馬兜鈴酸靶向CHEK1促進(jìn)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)

[摘" "要]" "目的：馬兜鈴酸作為一種已知的潛在肝毒性化合物，其與肝細(xì)胞癌的發(fā)生及復(fù)發(fā)之間的關(guān)系仍未得到充分闡明，本文意在探討馬兜鈴酸促進(jìn)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的可能機(jī)制。方法：首先挑選出馬兜鈴酸的毒性基因、復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌中上調(diào)基因，二者的交集基因聚焦于“有絲分裂細(xì)胞周期階段轉(zhuǎn)換”功能模塊，以此模塊構(gòu)建的標(biāo)簽評分能有效預(yù)測肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)。隨后，運(yùn)用分子對接技術(shù)甄別出與馬兜鈴酸親和力最強(qiáng)的核心基因，最后對該基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：根據(jù)所有分子對接結(jié)果的熱圖展示，選取檢查點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase 1， CHEK1）作為主要的潛在靶點(diǎn)。無論是在發(fā)現(xiàn)隊列還是驗(yàn)證隊列中，CHEK1高表達(dá)均促進(jìn)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)，CHEK1表達(dá)在肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)患者中顯著上調(diào)，提示其與馬兜鈴酸結(jié)合進(jìn)一步加重肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險。結(jié)論：本研究闡明了馬兜鈴酸的肝毒性機(jī)制及其靶向CHEK1促進(jìn)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的可能機(jī)制，提示在抗腫瘤治療中應(yīng)嚴(yán)格管理馬兜鈴酸的暴露，以減少肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險。

[關(guān)鍵詞]" "網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)；馬兜鈴酸；肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)；分子對接；檢查點(diǎn)激酶1

[中圖分類號]" "R735.7" " " " " " " "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號]" "1674-7887（2025）01-0001-07

Aristolochic acid promotes hepatocellular carcinoma recurrence by targeting CHEK1*

ZHU Huilin1， 2， SONG-SHI Shengnan1， 2， QIAN Lu1， 2， YI Mingxun1， 2， QI Fengnan1， 2， ZHANG Xiaolu1， 2， TAN Letao1， 2， ZHANG Haijian1， 2**" " " " （1Research Center of Clinical Medicine， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001; 2Medical School of Nantong University）

[Abstract]" "Objective： Aristolochic acid， as a known potential hepatotoxic compound， has not yet been fully elucidated in its relationship with the occurrence and recurrence of hepatocellular carcinoma. This article aims to explore the possible mechanisms by which aristolochic acid promotes the recurrence of hepatocellular carcinoma. Methods： First， the toxicity genes associated with aristolochic acid and the upregulated genes in recurrent hepatocellular carcinoma were selected. The intersection of these two sets of genes focused on the functional module of “mitotic cell cycle phase transition”. The label score constructed based on this module can effectively predict the recurrence of hepatocellular carcinoma. Subsequently， molecular docking technology was used to identify the core gene with the strongest affinity to aristolochic acid， and finally， this gene was validated. Results： Based on the heatmap presentation of all molecular docking results， checkpoint kinase 1（CHEK1） was selected as the primary potential target. In both the discovery group and validation group， high expression of CHEK1 promoted the recurrence of hepatocellular carcinoma. CHEK1 expression was significantly upregulated in patients with recurrent hepatocellular carcinoma， suggesting that its binding with aristolochic acid further exacerbates the risk of hepatocellular carcinoma recurrence. Conclusion： This study elucidates the hepatotoxic mechanisms of aristolochic acid and its potential role in targeting CHEK1 to promote recurrence of hepatocellular carcinoma， which suggests that aristolochic acid exposure should be strictly controlled during anti-tumor treatment to reduce the risk of hepatocellular carcinoma recurrence.

[Key words]" "network toxicology; aristolochic acid; hepatocellular carcinoma recurrence; molecular docking; checkpoint kinase 1

馬兜鈴酸是馬兜鈴植物與許多天然草藥中豐富的化合物[1]，它在2002年被列為人類Ⅰ類致癌物[2]。肝細(xì)胞癌是最常見的原發(fā)性肝癌[3]，是肝細(xì)胞的主要惡性腫瘤[4]。如今，研究[5-6]已經(jīng)證實(shí)馬兜鈴酸與肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)，但是致癌的機(jī)制尚不完善，馬兜鈴酸影響肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的機(jī)制更是知之甚少。

癌癥的發(fā)展與細(xì)胞的持續(xù)過度分裂密切相關(guān)[7]，細(xì)胞周期的異常進(jìn)展被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的基本機(jī)制之一[8]。在臨床干預(yù)治療過程中，一些肝細(xì)胞癌干細(xì)胞能轉(zhuǎn)換為休眠狀態(tài)，有絲分裂暫時靜止，使它們在治療中得以存活，之后這些干細(xì)胞會恢復(fù)到正常分裂狀態(tài)從而引發(fā)活躍的增殖和自我更新，導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)[9]。由此，本研究基于肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)相關(guān)的“有絲分裂細(xì)胞周期階段轉(zhuǎn)換”的標(biāo)簽，篩選相關(guān)蛋白，探討馬兜鈴酸在肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)中可能發(fā)揮的促進(jìn)機(jī)制。

1" "材料與方法

1.1" "馬兜鈴酸的結(jié)構(gòu)與毒性基因預(yù)測

1.1.1" "獲取馬兜鈴酸結(jié)構(gòu)與毒性預(yù)測" "在PubChem網(wǎng)站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和ProTox網(wǎng)站（https：//tox.charite.de/）中獲得馬兜鈴酸的結(jié)構(gòu)示意圖與毒性預(yù)測圖。

1.1.2" "獲取馬兜鈴酸的毒性基因" "利用ChEMBL數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/chembl/），SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch/）和STITCH數(shù)據(jù)庫（http：//stitch.embl.de/），以“aristolochic acid”為關(guān)鍵詞獲取靶點(diǎn)基因，并利用Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。將以上3個數(shù)據(jù)庫所獲得的靶點(diǎn)基因利用Venny工具取并集。

1.2" "肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的特征性基因分析

1.2.1" "獲得差異基因" "發(fā)現(xiàn)隊列：RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相關(guān)臨床注釋來自癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas， TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）的肝細(xì)胞癌隊列。本研究納入365個病例，選取與肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)相關(guān)的數(shù)據(jù)。使用R4.4.1軟件的“l(fā)imma”包進(jìn)行數(shù)據(jù)矯正和差異分析，以Plt;0.05且logFC（fold change）gt;0為條件篩選在肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)上調(diào)的基因。驗(yàn)證隊列：數(shù)據(jù)來自GEO數(shù)據(jù)（GSE214432），同樣采用R4.4.1軟件的“l(fā)imma”包進(jìn)行數(shù)據(jù)矯正和差異分析，篩選條件同上。

1.2.2" "免疫浸潤分析" "單樣本基因組富集分析（single sample gene set enrichment analysis， ssGSEA）算法用于量化肝細(xì)胞癌中29個免疫特征的相對豐度。

1.2.3" "功能富集分析" "利用R4.4.1軟件的“l(fā)imma”包，在兩個群組之間識別出差異表達(dá)的mRNA（DEmRNA）。篩選DEmRNA的標(biāo)準(zhǔn)是logFC=0和錯誤發(fā)現(xiàn)率（1 discovery rate， FDR）=0.05。利用R4.4.1軟件的“org.Hs.eg.db”、“ggplot2”和“enrichplot”包執(zhí)行KEGG通路富集和GO富集分析。基因組富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）是一種計算方法，用于確定一組超越定義的基因是否在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著意義，運(yùn)用GSEA軟件（4.3.3版）對兩個群組進(jìn)行處理。

1.3" "馬兜鈴酸促進(jìn)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的毒性基因網(wǎng)絡(luò)分析

1.3.1" "獲得馬兜鈴酸和促進(jìn)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的共同靶點(diǎn)基因并進(jìn)行可視化" "利用Venny工具對1.1.2中獲得的馬兜鈴酸的毒性基因和1.2.1中獲得的肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)上調(diào)基因取交集基因。使用Cytoscape3.8.0軟件對交集基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.3.2" "分子對接" "對接前使用AutoDockTools-1.5.7軟件準(zhǔn)備相應(yīng)的pdbqt格式的文件。用Vina進(jìn)行對接并獲得結(jié)合自由能，以熱圖形式展現(xiàn)。最后選取結(jié)合能最低的復(fù)合物用PyMOL軟件（3.1版）等顯示對接情況。

1.4" "統(tǒng)計學(xué)方法" "使用R軟件程序（4.4.1版）進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用Kaplan-Meier方法構(gòu)建生存曲線，采用對數(shù)秩檢驗(yàn)。使用R軟件包“pheatmap”創(chuàng)建熱圖并使用“ggplot2”等繪制火山圖。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "馬兜鈴酸的結(jié)構(gòu)與毒性基因分析" "在獲取馬兜鈴酸結(jié)構(gòu)的同時，預(yù)測其半數(shù)致死量為2 100 mg/kg，毒性等級評估為5。這些數(shù)據(jù)為揭示馬兜鈴酸的毒性特征提供了重要的理論依據(jù)（圖1A）。在ChEMBL數(shù)據(jù)庫中，共識別出874個與馬兜鈴酸相關(guān)的靶點(diǎn)基因（圖1B）。在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中，獲得靶點(diǎn)基因的分類餅狀圖（圖1C）并進(jìn)一步篩選出86個靶點(diǎn)基因。通過STITCH數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步篩選出10個相關(guān)靶點(diǎn)基因得到相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖1D）。利用Venny工具進(jìn)行并集運(yùn)算，最終識別出與馬兜鈴酸相關(guān)的毒性基因總計951個（圖1E）。對951個基因進(jìn)行GO富集分析，特別關(guān)注促腫瘤效應(yīng)相關(guān)條目（圖1F）。這些發(fā)現(xiàn)為潛在治療靶點(diǎn)的識別提供初篩思路。

2.2" "肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的特征性基因分析" "隨后通過對肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)差異分析，共識別出2 253個在肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)中顯著上調(diào)的基因。繪制熱圖（圖2A）顯示復(fù)發(fā)組（Rec組）和非復(fù)發(fā)組（NoRec組）在基因表達(dá)上存在顯著差異。此外，火山圖（圖2B）直觀地展示了在肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)過程中基因表達(dá)的變化情況。

接下來，對2 253個基因的KEGG通路分析（圖2C）顯示，細(xì)胞周期通路的顯著性最高。免疫浸潤分析（圖2D）探討了與肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)及其免疫浸潤相關(guān)的不同細(xì)胞類型的相對比例。不同生物過程（GO條目）在樣本中的富集得分可視化結(jié)果（圖2E）為深入理解肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)機(jī)制及其潛在生物標(biāo)志物提供了重要的生物學(xué)基礎(chǔ)。

2.3" "馬兜鈴酸促進(jìn)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的毒性基因網(wǎng)絡(luò)分析" "本研究整合馬兜鈴酸相關(guān)的951個毒性基因與2 253個在肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)過程中上調(diào)基因的交集共25個（圖3A），并可視化（圖3B）。進(jìn)而進(jìn)行GO富集分析（圖3C），篩選出以“有絲分裂細(xì)胞周期階段轉(zhuǎn)換”為功能的7個基因，包括EIF4E、TACC3、CASP2、CDC25B、CCNA2、CDC25A和CHEK1。

根據(jù)以上7個核心基因構(gòu)建標(biāo)簽評分，將365例分為低表達(dá)組（Rec_low， 前182例）和高表達(dá)組（Rec_high， 后183例），結(jié)果顯示高表達(dá)組復(fù)發(fā)的概率明顯高于低表達(dá)組（P=0.000 11， 圖3D）。隨后，對7個靶基因與馬兜鈴酸及其衍生物7-甲氧基馬兜鈴酸A（對照組）進(jìn)行了分子對接并繪制熱圖（圖3E）。為驗(yàn)證馬兜鈴酸相關(guān)的肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)相關(guān)的標(biāo)簽評分的可靠性，在驗(yàn)證隊列（Validation cohort， GSE214432）中證實(shí)，7個核心基因擬合的標(biāo)簽評分在復(fù)發(fā)組（Rec組）更高（Plt;0.05， 圖3F）。研究選取CHEK1作為進(jìn)一步可視化的重點(diǎn)，分別采用了三維和二維對接模式進(jìn)行可視化，其中三維對接結(jié)果如圖4A和圖4B所示；二維對接圖（圖4C）揭示非共價相互作用。

最后，基于CHEK1的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)隊列（Discovery cohort， TCGA），復(fù)發(fā)曲線顯示CHEK1高表達(dá)組（CHEK1_high）術(shù)后復(fù)發(fā)概率顯著高于CHEK1低表達(dá)組（CHEK1_low）（Plt;0.001，圖4D）。高表達(dá)CHEK1與肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)狀態(tài)呈正相關(guān)（P=0.010，圖4E），而CHEK1在復(fù)發(fā)組中的顯著高表達(dá)再次支持了其作為肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的預(yù)測因子的潛力（P=0.002，圖4F）。驗(yàn)證隊列（Validation cohort， GSE214432），CHEK1高表達(dá)組中復(fù)發(fā)概率顯著高于CHEK1低表達(dá)組（Plt;0.001，圖4G），而CHEK1在復(fù)發(fā)組中表達(dá)水平顯著高于非復(fù)發(fā)組（Plt;0.001，圖4H），這與發(fā)現(xiàn)組的結(jié)果一致。

3" "討" " " 論

本研究旨在從馬兜鈴酸的分子毒性靶點(diǎn)及其對肝細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響入手，系統(tǒng)分析馬兜鈴酸在肝細(xì)胞癌預(yù)后過程中可能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞重新活躍的機(jī)制。闡明馬兜鈴酸在腫瘤復(fù)發(fā)機(jī)制中的作用，可為預(yù)防肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)提供新的潛在靶點(diǎn)。

馬兜鈴酸作為一種廣為人知的致癌物質(zhì)，其對肝細(xì)胞癌發(fā)生的致病機(jī)制已在大量流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究中得到充分闡述。然而，馬兜鈴酸是否具有促進(jìn)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的潛力，仍有待深入探究。其他與復(fù)發(fā)相關(guān)的研究[10]表明，持續(xù)性乙肝病毒血癥可增加肝細(xì)胞癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率，其與黃曲霉毒素B1共同暴露時，二者協(xié)同致癌的作用顯著增強(qiáng)[11]，且這一過程可能通過p62高表達(dá)介導(dǎo)的Nrf2通路的激活而發(fā)生[12]。類似于上述種種因素，本文所要探討的馬兜鈴酸，也可能通過其特定的作用機(jī)制誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)。

本研究中與未復(fù)發(fā)的肝細(xì)胞癌患者相比，復(fù)發(fā)患者的免疫細(xì)胞浸潤表現(xiàn)出顯著抑制趨勢，治療后復(fù)發(fā)進(jìn)一步加劇了免疫抑制環(huán)境的形成[13]。研究[14]表明，肥大細(xì)胞通過分泌促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，參與免疫監(jiān)視和腫瘤免疫逃逸。樹突狀細(xì)胞通過激活初始T細(xì)胞反應(yīng)，啟動和維持特異性免疫應(yīng)答[15]，這兩種細(xì)胞類型能塑造和調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境[16]。因此推測馬兜鈴酸可能會潛在地致使腫瘤微環(huán)境發(fā)生動蕩。此外，通過一系列生物信息學(xué)分析手段，馬兜鈴酸相關(guān)基因與肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)過程中的靶向基因主要集中于機(jī)體免疫功能失調(diào)模塊，如補(bǔ)體系統(tǒng)活性降低等。綜合這些證據(jù)，推測馬兜鈴酸既通過自身毒性達(dá)到致癌效果也可能通過干擾腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控、促進(jìn)DNA損傷修復(fù)失衡，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)和惡化。

在肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)機(jī)制研究中，如何從成千上萬的潛在指標(biāo)中篩選出既具有生物學(xué)意義又具有臨床可行性的預(yù)后標(biāo)志物，始終是本研究中的一個挑戰(zhàn)。通過回顧以往文獻(xiàn)，如甲胎蛋白異質(zhì)體3與異常凝血酶原雙陽性標(biāo)志物的檢測，可以強(qiáng)烈預(yù)測肝移植后的肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)風(fēng)險[17]。本研究嘗試篩選出毒物與疾病的交集基因并通過功能富集分析進(jìn)一步縮小范圍，最終聚焦于7個靶點(diǎn)基因。構(gòu)建這7個核心基因的表達(dá)量標(biāo)簽，劃分為高、低表達(dá)組，兩組的肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)概率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。并進(jìn)一步模擬馬兜鈴酸與7個標(biāo)簽基因結(jié)合來發(fā)揮促癌作用的微觀模型。

通過分析化合物與全部標(biāo)簽基因的分子對接的結(jié)合自由能結(jié)果，CHEK1與馬兜鈴酸在分子水平上表現(xiàn)出高度親和力，初步判定CHEK1在馬兜鈴酸致肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的毒性機(jī)制中扮演著關(guān)鍵的調(diào)控角色。研究[18]表明，CHEK1的過表達(dá)被視為影響腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥性的重要因素。鎖定該基因的同時，將肝細(xì)胞癌患者分為CHEK1高表達(dá)組和CHEK1低表達(dá)組，驗(yàn)證CHEK1在復(fù)發(fā)中的臨床價值。發(fā)現(xiàn)CHEK1的異常活化可能是馬兜鈴酸誘發(fā)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的一個關(guān)鍵因素。

這一發(fā)現(xiàn)提示在未來的治療策略中，如何針對CHEK1進(jìn)行干預(yù)，可能成為提升肝細(xì)胞癌治療效果的重要途徑。然而，盡管本研究在理論上為馬兜鈴酸促進(jìn)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)提供了初步基礎(chǔ)，該結(jié)論仍需通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以增強(qiáng)其可靠性。

綜上所述，本研究首先利用生物信息學(xué)方法篩選出馬兜鈴酸相關(guān)基因，并與肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行交叉比對，最終鎖定了25個具有顯著上調(diào)表達(dá)的共同靶點(diǎn)基因。值得注意的是，其中7個基因與“有絲分裂細(xì)胞周期階段轉(zhuǎn)換”功能相關(guān)并在復(fù)發(fā)患者中表現(xiàn)出較強(qiáng)的預(yù)后價值。整合分子對接結(jié)果，確定CHEK1作為馬兜鈴酸作用的潛在靶點(diǎn)，并深入探討其在肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)中的關(guān)鍵作用。這一發(fā)現(xiàn)為理解馬兜鈴酸的毒理機(jī)制及其與肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)之間的復(fù)雜相互作用提供了重要線索。

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[收稿日期] 2024-12-01