HIV-TB共感染患者Th17/Treg免疫軸及免疫相關因子表達水平的研究

摘要：目的 "比較我國新疆喀什地區結核（TB）患者、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者及艾滋病合并結核共感染（HIV-TB）共感染者外周血外周血單個核細胞（PBMC）中CD4+T細胞、Th17細胞及Treg細胞水平，及其相關細胞因子的表達水平。方法 "收集2021年5月-2022年12月就診于喀什地區第一人民醫院的初治TB患者24例、HIV患者21例、HIV-TB患者17例。采用流式細胞術檢測各患者PBMCs中CD4+T細胞、Th17、Treg細胞水平及Th17/Treg比例；采用酶聯免疫吸附（ELISA）方法檢測各組患者血清中IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ及TNF-α等細胞因子的表達水平。結果 "與TB、HIV患者相比，HIV-TB患者CD4+T、Th17細胞水平下調（P＜0.05），Treg細胞水平上調（P＜0.05），Th17/Treg比例下調（P＜0.05）。與TB患者相比，HIV-TB患者IL-2、IFN-γ及IL-17濃度降低，IL-10、TNF-α濃度升高（P＜0.05）；與HIV患者相比，HIV-TB患者IL-2、IL-17濃度降低，IL-10、IFN-γ和TNF-α濃度升高（P＜0.05）。結論 "與TB和HIV患者相比，HIV-TB患者Th17/Treg免疫軸的失衡更為顯著。與TB和HIV患者相比，HIV-TB患者免疫水平異常更加嚴重。

關鍵詞：HIV-TB共感染；Th17/Treg免疫軸；免疫因子

中圖分類號：R512 " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A " " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.02.017

文章編號：1006-1959（2025）02-0097-06

Study on the Expression of Th17/Treg Immune Axis and Immune-related Factors

in HIV-TB Co-infected Patients

Dilare·Hairoula1， LI Li2

（1.Shihezi University School of Medicine， Shihezi 832000， Xinjiang， China;

2.State Key Laboratory of Pathogenesis，Prevention and Treatment of High Incidence Diseasees in Central Asia，

the First People's Hospital of Kashgar， Kashgar 844000， Xinjiang， China）

Abstract： Objective "To compare the levels of CD4+ T cells， Th17 cells and Treg cells in peripheral blood mononuclear cells （PBMC） of patients with tuberculosis （TB）， human immunodeficiency virus （HIV） infection and AIDS complicated with tuberculosis（HIV-TB） co-infection in Kashgar， Xinjiang， China， and the expression levels of related cytokines. Methods "From May 2021 to December 2022， 24 patients with newly diagnosed TB， 21 patients with HIV and 17 patients with HIV-TB were collected from the First People's Hospital of Kashgar. Flow cytometry was used to detect the levels of CD4+ T cells， Th17， Treg cells and Th17/Treg ratio in PBMCs of each patient. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the expression levels of IL-2， IL-10， IL-17， IFN-γ and TNF-α in the serum of each patient. Results "Compared with TB and HIV patients， the levels of CD4+ T and Th17 cells in HIV-TB patients were down-regulated （Plt;0.05）， the level of Treg cells was up-regulated （Plt;0.05）， and the ratio of Th17/Treg was down-regulated （Plt;0.05）. Compared with TB patients， the concentrations of IL-2， IFN-γ and IL-17 in HIV-TB patients were decreased， and the concentrations of IL-10 and TNF-α were increased （Plt;0.05）. Compared with HIV patients， the concentrations of IL-2 and IL-17 in HIV-TB patients decreased， and the concentrations of IL-10， IFN-γ and TNF-α increased （Plt;0.05）. Conclusion "Compared with TB and HIV patients， the imbalance of Th17/Treg immune axis in HIV-TB patients is more significant. Compared with TB and HIV patients， the abnormal immune level of HIV-TB patients is more serious.

Key words： HIV-TB co-infection; Th17/Treg immune axis; Immune-related cytokines

艾滋病（acquired immune deficiency syndrome， AIDS）是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）引起的一種常見傳染病，其特征性表現為免疫功能缺陷。艾滋病毒感染在全世界范圍內是發病率和死亡率最高的病因之一[1]。結核（TB）病是HIV感染者最常見的機會性感染，這也是HIV患者最常見的死亡原因之一[2]。同樣，HIV感染合并感染亦是導致潛伏性結核感染進展為活動性結核病的最重要的危險因素之一[3]。結核病與艾滋病可以相繼感染或同時感染[4]。據報道，2022年全球結核病合并HIV（HIV-TB）雙重感染患者占所有結核病患者的8%，其中約21.4萬人死于艾滋病合并結核病雙重感染。即使在有效抵抗逆轉錄病毒療法可獲得性增加的背景下，由于結核病診斷的延誤、晚期免疫缺陷、疾病嚴重性的增加、機會性感染的并存以及與貧困相關的社會因素，艾滋病感染者中死于結核病的情況也更為常見[5]。然而，目前HIV-TB共感染的發病機制并未闡明。HIV和TB的感染及發病均涉及復雜的細胞免疫變化。相關研究認為，細胞免疫失衡是TB促進HIV病毒復制和疾病進展的機制之一，但目前對HIV-TB共感染患者細胞免疫變化及其分子生物學機制尚存在爭議。本研究擬探討HIV-TB共感染患者CD4+T細胞、Th17細胞、Treg細胞水平及相關免疫因子的表達水平，希望為HIV-TB共感染患者的診斷和治療提供理論和實驗依據，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 "收集2021年5月-2022年12月喀什地區第一人民醫院收治的初治TB患者24例、HIV患者21例、HIV-TB患者17例，TB患者、 HIV患者及 HIV-TB患者住院當日收集一般資料，包括姓名、性別、年齡、身高、體重、體重指數、職業、吸煙史等。入組者均知情且簽署知情同意書，并通過喀什地區第一人民醫院倫理審批。樣本分組：外周血樣本檢測分組：患者根據疾病類型分為TB組、HIV組、HIV-TB組。

1.2納入排除標準

1.2.1納入標準 "①HIV患者納入標準：參照艾滋病診療指南，研究對象經我院或外院艾滋病初篩實驗室初篩陽性，后經喀什地區預防控制中心艾滋病確認實驗室確認陽性。②TB患者納入標準：滿足以下任何一條，痰查抗酸桿菌陽性2次；痰查抗酸桿菌陽性1次，同時結核分枝桿菌培養陽性1次，痰查抗酸桿菌陽性1次，同時影像學支持肺結核；或痰培養結核分枝桿菌培養陽性，影像學支持肺結核；或影像學支持肺結核，同時結核分枝桿菌核酸檢測陽性；或影像學支持肺結核，同時病理檢查支持肺結核，即可確診。③HIV-TB患者納入標準：既滿足TB的診斷標準，又滿足HIV的診斷標準。

1.2.2排除標準 "所有可能影響Th17/Treg細胞的疾病。如肺炎、腫瘤、血液系統疾病、結締組織疾病、心血管疾病等。

1.3試劑和儀器 "磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司），ELISA 試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司），FITC-CD4 （美國 eBioscience公司），SDS裂解液（北京Solarbio公司）EDTA-K2 抗凝管塑料真空采血管（美國BD公司），-80 ℃超低溫冰箱（日本 Sanyo公司），高速臺式冷凍離心機（深圳柏萊科技），超凈工作臺（山東博科公司），FACS Calibur流式細胞儀 （美國BD公司），低速離心機（中國湘儀公司），細胞計數器（賽默費雪公司），酶標儀 Wellscan MK3（芬蘭Leibo Co.Fenland公司）。

1.4方法

1.4.1樣本收集 "所有研究對象于住院次日清晨空腹采用肝素鈉抗凝管取外周靜脈血10 ml，一部分外周血樣本分離血清收集，一部分血樣本收集分離血漿及血細胞收集，一部分血樣本分離PBMCs。

1.4.2流式細胞術檢測CD4+T細胞、Thl7及Treg細胞數量 "①Th17細胞檢測：吸取PBMCs 100 μl，加入相對應組合的抗體，每種抗體5 μl（IL-17的組合是CD3、CD4、CD8），兩樣本處理完畢后避光室溫放置15 min，加入2 ml溶血素10 min后離心（1500 r/min、5 min）去上清，加入2 ml PBS洗滌離心（1500 r/min、5 min）去上清，加入500 μl PBS，重懸。②Treg細胞檢測：吸取PBMCs 100 μl，加入相對應組合的抗體，每種抗體5 μl（Foxp3的組合是CD4、CD25、CD3），輕輕吹打4～5遍混勻。放入4 ℃冰箱，避光孵育30 min。采用FACS Calibur流式細胞儀Cell Quest 3.0分析軟件進行分析，根據各自的空白對照以確定Th17細胞和Treg細胞的數值。

1.4.3酶聯免疫反應 "獲得總蛋白樣品，采用ELISA法檢測IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ及TNF-α的表達，具體操作按照ELISA試劑盒說明書進行。按照ELISA標準曲線步驟繪制標準曲線，蛋白樣品在洗脫緩沖液中按1∶100的比例稀釋。用滅菌后的PBS（pH 7.2）按1∶200的比例稀釋樣品后，在96孔板上加入100 μl，每孔加入50 μl。室溫孵育2 h后，加入TMB底物，在495 nm處測定吸光度。然后根據標準曲線計算各樣品中IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ及TNF-α的濃度。

1.5統計學方法 "使用SPSS 20.0統計軟件處理數據，計量資料采用（x±s）表示，服從正態性和方差齊性，多組間采用單因素方差分析，多重比較采用LSD或SNK法，計數資料采用[n（%）]表示，采用？字2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1三組一般資料比較 "TB、HIV及HIV-TB組的年齡、性別、 BMI、吸煙情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2三組外周血PBMCs中CD4+T細胞、Th17 細胞及Treg細胞水平比較 "與TB、HIV組相比，HIV-TB組CD4+T、Th17細胞水平下調（P＜0.05），Treg細胞水平上調（P＜0.05），Th17/Treg比例下調（P＜0.05），見表2、圖1。

2.3三組血清中IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ及TNF-α水平比較 "與TB組相比，HIV-TB組IL-2、IL-17及IFN-γ濃度降低，IL-10、TNF-α濃度升高（P＜0.05）。與HIV組相比，HIV-TB組IL-2、IL-17濃度降低，IL-10、IFN-γ及TNF-α濃度升高（P＜0.05）。總之，與TB和HIV組比較，HIV-TB組的IL-2、IL-17濃度最低，IL-10、TNF-α的濃度最高。見表3、圖2。

3討論

艾滋病和結核病作為全世界范圍內流行的兩種慢性傳染性疾病嚴重威脅著人類的健康[6， 7]。據報道[8， 9]，截止2022年末，全球感染艾滋病人數達3900萬。2022年全球新發結核病人數約1060萬。雖然結核病和艾滋病的傳播途徑截然不同，但是二者之間的關系卻十分密切，易同時或先后感染，導致結核病合并艾滋病的雙重感染[10]。據研究顯示[11]，與未合并結核病的HIV感染/AIDS患者相比，HIV-TB共感染患者發生其他機會性感染和死亡的風險更高。近年來，多項研究表明HIV-TB共感發生發展涉及免疫系統異常激活，但是具體機制仍未明確。因此，研究HIV-TB共感中的異常免疫反應及明確其機制有重要意義。

HIV主要通過攻擊CD4+T細胞，使其數量減少并引起免疫功能缺陷，最終促進艾滋病的發展[12]。而機體清除體內的Mtb主要依靠的也是CD4+T細胞參與的細胞免疫反應。CD4+T細胞根據分泌的細胞因子不同可分為Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞及Treg細胞。Th1細胞通過分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α，活化巨噬細胞街道細胞免疫促胞內病原微生物及病毒的清除[13]。而Th17細通過分泌IL-17、IL-22和IL-23等炎癥因子，促進炎癥反應和自身免疫疾病的發生。而Treg細胞通過分泌IL-10，抑制自身免疫反應[14]。Th17細胞和Treg細胞在適應性免疫反應中發揮重要作用，在免疫疾病中相互拮抗[15]。Th17細胞促進自身免疫，而Treg細胞則起著抑制自身免疫的作用，Th17/Treg免疫軸的平衡在維持人體免疫穩態方面起關鍵作用[13]。在正常生理狀態下，Th17/Treg比例相對穩定[14]，但Th17/Treg細胞的數量和功能改變會引起異常的免疫反應，導致炎癥、癌癥或自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡（SLE）、類風濕關節炎（RA）、炎癥性結腸炎、多發性硬化癥和甲狀腺相關眼病（TAO）[16-19]。

本研究結果顯示，與TB、HIV患者相比，HIV-TB共感染患者PBMCs中CD4+T細胞、Th17細胞的水平降低（P＜0.05），而Treg細胞水平升高（P＜0.05），Th17/Treg比例降低（P＜0.05）。國外學者[1]探討了Th17/Treg免疫軸失衡對HIV-TB共感染患者HIV復制的影響，結果表明HIV-TB共感染患者的Th17細胞下降，隨后又逐漸上升；而Treg細胞在HIV-TB共感染患者中呈上升趨勢，隨著病情的惡化，Th17/Treg細胞比例發生顯著改變相符。由此表明，Th17/Treg免疫軸失衡可促進HIV-TB共感染患者免疫水平異常，與共感染的發生發展密切相關。有研究表明[18]，患有活動性TB的兒童IL-2、IFN-γ、IL-17的表達下降。在HIV感染過程中，Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ的表達下調，而Th2型細胞因子IL-10、TNF-α的表達上調[20]。相關研究表明[21]，在HIV-TB共感染中IL-2、IFN-γ的表達顯著降低，而IL-10、TNF-α的表達顯著升高。本研究結果顯示，與TB組和HIV組相比，HIV-TB組IL-2、IL-17、IFN-γ濃度降低，而IL-10、TNF-α濃度升高，與上述研究結果基本一致。因此，結合前人研究，本研究更進一步明確了HIV-TB共感機制涉及免疫反應異常激活。

綜上所述，HIV-TB共感染患者存在Th17/Treg免疫軸失衡，HIV-TB共感染IL-2、IL-17、IFN-γ濃度降低，而IL-10、TNF-α濃度升高，HIV-TB患者體內免疫相關細胞因子的表達異常更為顯著，共感患者免疫水平顯著異常。

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收稿日期：2023-10-30；修回日期：2024-01-30

編輯/成森