腸道菌群與早產兒壞死性小腸結腸炎發生發展的關系

摘要：目的 "應用16SrDNA 測序技術分析早產兒壞死性小腸結腸炎（NEC）腸道菌群變化情況。方法 "以2021年1月-2023年7月在湖南省婦幼保健院出生、出生胎齡＜32周、出生后24 h內住院、住院過程并發NEC的早產兒20例作為研究對象，于發病后2 h內收集NEC組和匹配對照組20例出生胎齡＜32周、出生后24 h內早產兒糞便標本，采用高通量測序技術對兩組患兒腸道菌群進行分析。結果 "兩組早產兒及其母親的一般情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；但NEC組腸道菌群不動桿菌屬、假單胞菌屬高于對照組（P＜0.05）；Alpha多樣性分析顯示，NEC組Shannon指數和Simpson指數高于對照組（P＜0.05）。結論 "早產兒腸道菌群不動桿菌屬、假單胞菌屬增多可能與NEC的發生有關。

關鍵詞：嬰兒；早產；小腸結腸炎；壞死性；糞便；高通量核苷酸測序

中圖分類號：R722.1 " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A " " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.02.015

文章編號：1006-1959（2025）02-0088-04

Relationship Between Intestinal Flora and the Occurrence and Development

of Necrotizing Enterocolitis in Premature Infants

FAN Liying， XIONG Xiyue， FENG Binbin， LI Suping， GONG Jin， WANG Qian， PAN Qian

（The Second Department of Neonatology， Hunan Provincial Maternal and

Child Health Care Hospital， Changsha 410008， Hunan， China）

Abstract： Objective "To analyze the changes of intestinal flora in premature infants with necrotizing enterocolitis （NEC） by 16SrDNA sequencing. Methods "A total of 20 premature infants born in Hunan Maternal and Child Health Care Hospital from January 2021 to July 2023， with gestational age lt;32 weeks， hospitalization within 24 h after birth， and complications of NEC during hospitalization were selected as the study objects. Within 2 hours after the onset of the disease， fecal samples of 20 premature infants in the NEC group and matched control group with gestational age lt;32 weeks and within 24 h after birth were collected， and the intestinal flora of the children in the two groups was analyzed by high-throughput sequencing technology. Results "There was no significant difference in the general conditions of premature infants and their mothers between the two groups （Pgt;0.05）. However， the intestinal flora of Acinetobacter and Pseudomonas in the NEC group was higher than that in the control group （Plt;0.05）. Alpha diversity analysis showed that the Shannon index and Simpson index of the NEC group were higher than those of the control group （Plt;0.05）. Conclusion "The increase of Acinetobacter and Pseudomonas in the intestinal flora of premature infants may be related to the occurrence of NEC.

Key words： Infant; Premature; Enterocolitis; Necrotizing; Feces; High throughput nucleotide sequencing

新生兒壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis， NEC）是一種常見的、嚴重威脅早產兒生命安全的急性壞死性腸道疾病，早產兒NEC發病率為5.0%～12.0%[1]。NEC病死率高達20.0%～30.0%，在需要外科手術治療的人群中，其病死率高達20%～40%[2]。嚴重NEC急性期可引起全身炎癥反應和多系統器官功能衰竭，后其可遺留腸狹窄、短腸綜合征、營養不良和神經發育遲緩等一系列后遺癥，嚴重影響了患兒的生活質量[3，4]。目前NEC治療尚無特效方法，特別是早期預防、早期診斷尤為困難。近年來NEC受到了廣泛的關注，但其發病機制尚未完全明確，多認為其涉及腸道菌群失衡、腸道發育不成熟、腸內喂養不合理、過度的炎癥反應、局部缺血再灌注損傷等多因素有關[5，6]。早產兒腸道菌群定植晚、種類少、加上住院期間使用抗生素、腸內喂養延遲，因此很多學者認為早產兒腸道菌群的動態變化可能是NEC病理生理學過程中最直接、最重要的環節[7]。本研究從腸道菌群入手，通過高通量測序技術對NEC糞便菌群進行測序，探討早產兒腸道菌群在NEC發病中變化，為臨床上通過調節腸道菌群失衡防治NEC提供理論依據，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 "選擇2021年1月-2023年7月在湖南省婦幼保健院住院的早產兒，住院過程并發NEC，入選標準：①出生胎齡＜32周；出生后24 h內入住新生兒重癥監護病房；②NEC的診斷采用《實用新生兒學》（第5版）中修正Bell-NEC分級標準進行診斷及分期Ⅱ期及以上者[8]。排除標準：①先天性消化道畸形；②其他臟器嚴重畸形以及合并遺傳代謝性疾病；③無NEC證據而發生自發性腸穿孔；④住院時間不足1周即自動出院；⑤口服益生菌。以同期住院的正常喂養無NEC早產兒為對照組，入選標準：①出生胎齡及日齡與NEC早產兒相當；②正常進食，無NEC癥狀；③先天性消化道畸形、其他臟器嚴重畸形以及合并遺傳代謝性疾病；④未服用益生菌。本研究經醫院倫理委員會審核通過（倫理編號：2020-S052）。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 "收集出生胎齡＜32周、出生后24 h內入住新生兒重癥監護病房并在住院期間并發Ⅱ期及以上NEC及其母親妊娠期基本資料，包括入院體重、胎齡、日齡、性別、宮內窘迫、產前激素使用、羊水情況、娩出方式、抗生素使用、是否自然受孕嬰兒、肺表面活性物質的應用等資料。對照組患兒按前述匹配原則收集臨床資料。

1.2.2樣本采集與保存 "收集診斷及分期Ⅱ期及以上NEC且＜32周早產兒糞便樣本，同時收集對照組糞便標本或腸道內容物（灌洗液）標本，兩組患兒盡可能在診斷后2 h內采集糞便標本。≥100 mg/例樣品，取新鮮樣本中段里部裝入2.0 ml無菌離心管（樣本體積不超過1/3），-80 ℃保存，待集中檢測。

1.2.3標本檢測與分析 "16SrRNA測序實驗采用QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen， Hilden， Germany）試劑盒提取糞便樣本（0.2 g）中微生物總DNA，用Qubit 2.0（Invitrogen）對DNA濃度進行定量檢測，用1%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA的分子大小。用Phusion "High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer（New England Biolabs）進行PCR擴增，確保擴增效率和準確性，擴增的片段為16S rDNA的V4高變區。擴增完成后，根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）對目的條帶膠進行回收純化。用TruSeq " DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用Illumina HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.2.4宏基因組測序實驗 "在16S rRNA測序基礎上，挑選在病例和對照組間腸道菌群差異明顯或含感興趣物種的目標糞便樣本進行宏基因組測序分析。糞便樣本DNA提取和檢測方法同上，將檢測合格的DNA樣品用Covaris超聲波破碎儀隨機打斷成長度約350 bp的片段，經過末端修復、加A尾和測序接頭、純化、PCR 擴增等步驟完成DNA的文庫制備。用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至2 ng/μl，隨后使用Agilent 2100檢測文庫insert size，確保有效濃度大于3 nmol/L，以保證文庫質量。庫檢合格后，根據不同文庫的有效濃度和目標下機數據量等需求pooling，使用Illumina HiSeq4000 PE150進行上機測序。

1.2.5物種分類及生物信息分析 "利用操作分類單位（operational taxonomic units， OTU）對原始數據進行處理后獲得最終的有效數據，對所有樣品的全部有效數據序列進行聚類，形成OTU。與此同時，應用韋恩圖（Venn）結合OTU所代表的物種找出不同環境的核心微生物。結果包括菌群多樣性、豐度，每個樣本在種、屬水平的組成，組間菌群的差異。

1.3統計學方法 "應用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以（x±s）表示，經方差齊性檢驗后，兩組間比較用t檢驗；非正態分布計量資料以[M（Q1，Q3）]表示，兩組組間比較采用Mann Whitney U檢驗及置換多元方差分析；計數資料以[n（%）]描述，組間比較采用？字2檢驗或Fisher確切概率法分析。P＜0.05為差異有統計學意義（雙側檢驗）。

2結果

2.1基本信息 "出生胎齡＜32周、出生后24 h內入住新生兒重癥監護病房并在住院期間并發Ⅱ期及以上NEC早產兒20例，全部在發病2 h內收集大便標本，Ⅱ期16例，有1例保守治療無效，轉成Ⅲ期手術；Ⅲ期3例手術。對照組20例，在治療組出現NEC 2 h內收集大便標本。2組早產兒及其母親的一般情況差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2腸道菌群屬水平變化 "NEC組的優勢菌屬平均豐度主要是腸球菌屬（25.61%），志賀氏菌屬（21.90%），對照組的優勢菌屬平均豐度主要是腸桿菌屬（27.61%），乳桿菌屬（18.93%），NEC組腸道菌群在不動桿菌屬、假單胞菌屬高于正常早產兒組（P＜0.05），見表2。

2.3 Alpha多樣性分析 "NEC組Shannon指數和Simpson指數高于對照組（P＜0.05）；NEC組Chao指數和Sobs指數與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

3討論

目前認為NEC發病機制與多種因素有關：如早產、喂養方式、長時間抗生素暴露、細菌定植異常、缺血再灌注損傷等[9]，但尚無確切定論。母乳含有多樣化的菌群和大量生物活性成分，可幫助建立健康腸道菌群，促進新生兒黏膜免疫發育[10]，母乳對NEC具有保護作用，本研究兩組母乳喂養率均低，且組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），建議加強母乳喂養，做好母乳喂養，加強母乳喂養的宣教。出生方式是影響整個新生兒期乃至嬰兒期腸道菌群組成的重要因素，但目前其與NEC發生的關系尚有爭議[11]，本研究兩組早產兒出生方式比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。母親妊娠期及新生兒抗菌藥物使用可增加發生NEC的風險[12]，本研究兩組早產兒母親產前和新生兒抗菌藥物使用率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

研究表明[13，14]，腸道菌群與宿主細胞存在密切交互作用和關聯，這種交互模式的改變與腸道疾病進程密切相關。早期新生兒腸道先驅菌群的大量定植主要發生在出生時及出生后不久，受胎齡、日齡、分娩方式、喂養方式和產婦飲食、環境因素等影響，早產兒腸道菌群多樣性低于足月兒，且受胎齡與日齡影響較大[15]。同時，其他潛在致病微生物群如肺炎克雷伯菌及大腸桿菌也增加。使早產兒的細菌定植模式發生改變，生命早期腸道微生態失調使新生兒易患NEC[16]。傳統培養技術往往只能反映環境中1%的菌群變化，往往無法真實地、完整地反映個體菌群整體的情況。二代測序技術16s rDNA 高通量測序技術為研究腸道菌群鋪平了道路[17]，本課題組利用16s rDNA高通量測序的方法來鑒定個體間腸道細菌的組成。本研究結果發現，NEC組Shannon指數和Simpson指數高于對照組（P＜0.05），提示腸道菌群多樣性高于對照組，不動桿菌屬、假單胞菌屬豐度明顯增加，菌群存在嚴重的失調，和相關研究報道一致[18，19]，NEC組Chao指數和Sobs指數與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示兩組腸道菌群豐富度無顯著差異。NEC組患兒的優勢菌屬平均豐度主要是腸球菌屬（25.61%），志賀氏菌屬（21.90%），對照組患兒的優勢菌屬平均豐度主要是腸桿菌屬（27.61%），乳桿菌屬（18.93%），發現NEC組腸道菌群在不動桿菌屬、假單胞菌屬明顯高于正常早產兒組，差異有統計學意義（P＜0.05），與Pammi M等[20]研究相似，這可能與早產兒出生后不動桿菌屬、假單胞菌屬持續升高有關。但本研究無法證實，需要更多的樣本和研究來探索新生兒腸道菌群的多樣性。因此，在生后糞便樣本中假單胞菌屬及不動桿菌屬含量持續較高的早產兒更容易發生 NEC。假單胞菌屬和不動桿菌屬可能作為一種預測NEC的標記物，值得進一步研究。宿主-微生物群的相互作用可能是NEC發病的核心環節，早產兒細菌定植時腸道對微生物配體的高反應性繼而引發一系列異常信號表達和黏膜炎癥免疫反應。

綜上所述，NEC患兒腸道菌群不動桿菌屬、假單胞菌屬的豐度增加，雙歧桿菌豐度減少，可能作為一種預測NEC的標記物，值得進一步研究。

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收稿日期：2023-12-21；修回日期：2024-01-26

編輯/王萌