LINC00313結合miR-4429在非小細胞肺癌的診斷和預后中的作用及價值

摘要：目的 "探討 LINC00313/miR-4429 在非小細胞肺癌（NSCLC）診斷和預后中的潛在作用和臨床價值。方法 "選擇2016年1月-2018年5月在我院接受腫瘤切除術的128例NSCLC患者設為試驗組。采集NSCLC靜脈血樣及腫瘤組織，將鄰近的正常組織（距腫瘤組織邊緣3 cm）樣本設為對照組。通過反轉錄定量 PCR 檢測觀察 LINC00313 和 miR-4429 在 NSCLC 患者血清、組織和細胞系中的表達水平，觀察LINC00313/miR-4429與NSCLC患者的臨床病理特征之間的關系，通過 ROC 曲線分析評估診斷價值，Kaplan-Meier 生存分析和 Cox 回歸分析預后價值。結果 "LINC00313在NSCLC血清、組織和細胞系中的表達增加，而miR-4429的表達減少，LINC00313的過量表達抑制了NSCLC細胞中miR-4429的表達。LINC00313的表達水平與腫瘤大小、分化、淋巴結轉移和TNM分期相關（P＜0.05），而miR-4429的表達水平與分化、淋巴結轉移和TNM分期相關。ROC曲線顯示，LINC00313和miR-4429具有很高的診斷價值；Kaplan-Meier曲線結果表明，LINC00313的高表達和miR-4429的低表達提示預后不良。結論 "LINC00313和miR-4429的異位表達在NSCLC的診斷和預后中具有良好的臨床意義，LINC00313/miR-4429可能為NSCLC的治療提供一種新的生物標志物。

關鍵詞：非小細胞肺癌；LINC00313；miR-4429；診斷；預后

中圖分類號：R73 " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A " " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.02.014

文章編號：1006-1959（2025）02-0082-06

Role and Value of LINC00313 Combined with miR-4429 in the Diagnosis

and Prognosis of Non-small Cell Lung Cancer

CHEN Yanfang， SUI Xiaomei， HAO Meili， ZHANG Qifu

（Department of Radiotherapy， Affiliated Hospital of Shandong Second Medical University， Weifang 261031， Shandong， China）

Abstract： Objective "To investigate the potential role and clinical value of LINC00313/miR-4429 in the diagnosis and prognosis of non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods "A total of 128 patients with NSCLC who underwent tumor resection in our hospital from January 2016 to May 2018 were selected as the experimental group. The venous blood samples and tumor tissues of NSCLC were collected， and the adjacent normal tissues （3 cm from the edge of tumor tissues） were set as the control group. The expression levels of LINC00313 and miR-4429 in serum， tissues and cell lines of NSCLC patients were observed by reverse transcription quantitative PCR. The relationship between LINC00313/miR-4429 and clinicopathological features of NSCLC patients was observed. The diagnostic value was evaluated by ROC curve analysis， and the prognostic value was analyzed by Kaplan-Meier survival analysis and Cox regression analysis. Results "The expression of LINC00313 was increased in serum， tissues and cell lines of NSCLC， while the expression of miR-4429 was decreased， the overexpression of LINC00313 inhibited the expression of miR-4429 in NSCLC cells. The expression level of LINC00313 was correlated with tumor size， differentiation， lymph node metastasis and TNM stage （Plt;0.05）， while the expression level of miR-4429 was correlated with differentiation， lymph node metastasis and TNM stage. ROC curve showed that LINC00313 and miR-4429 had high diagnostic value. Kaplan-Meier curve results showed that high expression of LINC00313 and low expression of miR-4429 indicated poor prognosis. Conclusion "The ectopic expression of LINC00313 and miR-4429 has good clinical significance in the diagnosis and prognosis of NSCLC. LINC00313/miR-4429 may provide a new biomarker for the treatment of NSCLC.

Key words：Non-small cell lung cancer; LINC00313; miR-4429; Diagnosis; Prognosis

肺癌（lung cancer）是世界上最常見、死亡率最高的惡性腫瘤之一。該病是一種與環境因素和生活方式有關的疾病，吸煙是目前公認的肺癌最重要的致病因素。根據癌細胞的生物學特性，肺癌分為兩大類：小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）[1]。在我國，2022年肺癌發病率是所有惡性腫瘤的首位，死亡人數占總惡性腫瘤死亡的23.9%，排名第一，嚴重危害人民生命健康[2]。因此，找到新的生物標志物以提高NSCLS的診斷效率和改善不良預后具有重要意義。LncRNA和miRNA被認為是一類新的腫瘤生物標志物，因為它們的表達水平在一些癌癥中發生變化[3]。研究發現，lncRNA LINC00313的表達水平在肺癌組織中被上調，并且LINC00313與肺癌的生存期有關[4]，LINC00313通過捕捉miR-4429充當乳頭狀甲狀腺癌的癌基因，這表明LINC00313可能成功作為乳頭狀甲狀腺癌的治療目標[5]。miR-4429已經在一些癌癥中得到研究，如腎細胞癌[6]、胃癌[7]和宮頸癌[8]。 然而，miR-4429在NSCLC中的表達和臨床價值，以及它與LINC00313在NSCLC中的關系還缺少報道。本研究旨在分析NSCLC血清、組織和細胞中LINC00313和miR-4429的表達水平，并進一步分析異常表達的LINC00313/miR-4429在NSCLC診斷和預后中的臨床意義，現將結果報道如下。

1資料與方法

1.1研究對象 "選擇2016年1月-2018年5月在山東第二醫科大學附屬醫院（原濰坊醫學院附屬醫院）接受腫瘤切除術的128例NSCLC患者設為試驗組。將患者腫瘤組織鄰近的正常組織（距腫瘤組織邊緣3 cm）樣本設為對照組。納入標準：①組織學證實為NSCLC；②具有完整的臨床病理資料及隨訪信息。排除標準：①手術前接受過抗癌治療；②術前曾進行放化療；③有石棉接觸史。健康對照組64名來自在濰坊醫學院附屬醫院進行常規健康檢查并確認無癌癥史者。入組人群標本的采集已獲濰坊醫學院附屬醫院倫理委員會審批通過，均已簽署患者知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本采集 "分別采集對照組、試驗組人群術前的靜脈血樣。試驗組術中采集腫瘤組織和鄰近的正常組織（距腫瘤組織邊緣3 cm）。采集的血樣經離心分離后保存在-80 ℃冰箱。收集的腫瘤組織和鄰近的正常組織在液氮中快速保存。所有患者在術后都參加了為期5年的電話隨訪，以記錄患者的生存情況，用于后續的生存分析。

1.2.2 細胞培養 "NSCLC細胞系（SK-MES-1， A549）和正常肺細胞系（NHBE）購自中國科學院上海細胞庫。將凍存的 A549 和NHBE解凍、復蘇，接種于體積分數10%胎牛血清和100 "U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素雙抗的的杜氏PBS緩沖液改良Eagle培養基中，置于37 ℃、體積分數5%CO2恒溫培養箱中，待其貼壁后，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.3 細胞轉染 "細胞LINC00313總RNA反轉錄后獲得cDNA。采用PCR技術擴增得到LINC00313的編碼區片段，經同源重組與pcDNA3.1載體相連接，將酶切鑒定和測序正確的重組質粒命名為pcDNA3.1-LINC00313，并利用購自于北京百奧創新科技有限公司的Lipofectamine TM2000 轉染試劑（11668019）將該過表達載體或空載體pcDNA3.1轉染到NSCLC細胞系A549和SK-MES-1。轉染48 h后檢測LINC00313的表達水平以評估轉染效率。

1.2.4 RNA提取 "Trizol法提取血清、組織和細胞中的LINC00313總RNA（GenElute）Sigma-AldrichRNA提取試劑），利用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scien- tific， Waltham， MA， USA）測定RNA純度和純度，吸光度比OD260/OD280結果接近2.0的RNA可用于后續逆轉錄。

1.2.5反轉錄定量PCR（RT-qPCR） "qRT-PCR使用SYBR green I Master Mix試劑盒（Invitrogen， Carlsbad， CA），在（QuantStudio 7 Flex）美國ABI系統上進行。LINC00313和miR-4429的水平使用2-△△CT方法計算，并將其歸一化。分別到U6或GAPDH的水平。寡核苷酸核苷酸引物序列如下。LINC00313正向：5'-TTGCGTGACAGTTTCCACTC-3'。LINC00313反向：5'-CTCCCTTCTGCGGTCATTTC-3'。miR-4429正向：5'-ATTATTGGGGCTGGGCG-3'。miR-4429反向：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。U6正向：5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'。U6反向：5'-CCAGTGAGGGTCCGAGGT-3'。GAPDH正向：5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'。GAPDH反向：5'-AGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3。

1.3統計學方法 "采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0版軟件進行統計分析。兩組間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗。腫瘤組織中LINC00313和miR-4429的表達水平與患者臨床癥狀數據之間的關系采用Chi-square檢驗。根據血清LINC00313或miR-4429的表達水平建立ROC曲線，以評估LINC00313/miR-4429的診斷價值。采用Kaplan-Meier方法建立患者生存曲線，并采用對數秩檢驗用于比較生存曲線之間的差異。Cox回歸分析用于評估LINC00313和miR-4429在預測患者5年生存率方面的預后價值。P＜0.05時認為差異有統計學意義，P＜0.001表示統計學意義極顯著。

2結果

2.1 LINC00313和miR-4429在NSCLC血清和組織樣本中的表達情況 "與健康對照組相比，NSCLC患者的血清LINC00313表達水平上調，miR-4429表達水平下調（P＜0.001），且LINC00313和miR-4429的水平呈負相關（r=-0.498，P＜0.001）（圖1A）。在NSCLC組織中，LINC00313表達水平上調，miR-4429表達水平下調（P＜0.001），且LINC00313和miR-4429的水平呈負相關（r=-0.534，P＜0.001）（圖1B）。

2.2 LINC00313的過量表達對NSCLC細胞中miR-4429表達的影響 "在NSCLC細胞系中，LINC00313和miR-4429的水平呈負相關（P＜0.01，圖2A和圖2B），pcDNA3.1-LINC00313過表達載體中，LINC00313的過表達可以降低NSCLC細胞中miR-4429的表達水平（P＜0.05，圖2C）。

2.3 LINC00313/miR-4429與NSCLC患者的臨床病理特征之間的關系 "LINC00313的表達水平與腫瘤大小、分化、淋巴結轉移和TNM分期相關（P＜0.05），而miR-4429的表達水平與分化、淋巴結轉移和TNM分期相關（P＜0.05）；不同性別、年齡和吸煙史比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.4 LINC00313/miR-4429對NSCLC患者的診斷價值 "ROC曲線顯示LINC00313的曲線下面積為0.916，敏感性為78.91%，特異性為90.63%（圖3A）。此外，miR-4429其敏感性為87.5%，特異性為82.81%，曲線下面積為0.898（圖3B）。

2.5 LINC00313/miR-4429對NSCLC患者的預后的影響 "如圖4A所示，LINC00313表達水平低的患者有較高的總生存率（Log-rank P=0.002），而miR-4429表達水平高的患者有更好的預后（Log-rank P=0.003）（圖4B）。此外，多變量Cox分析顯示，LINC00313（HR=2.290，95%CI=1.427～3.675，P=0.001）和miR-4429（HR=2.144，95%CI=1.291～3.561，P=0.003）是影響NSCLC患者生存的兩個獨立預后因素，見表2。

3討論

NSCLC是一種死亡率很高的致命性癌癥，正在威脅著全世界人民的健康[9]。臨床上多數患者出現癥狀就診時已屬于晚期，晚期肺癌患者的5年整體生存率僅為20%左右[10]。因此，迫切需要探索NSCLC發病和進展的分子機制，尋找新的無創生物標志物和有效治療的新靶點，以改善NSCLC患者的診斷效率和預后。

LncRNA 是一類新發現的非編碼 RNA，lncRNA 參與腫瘤過程并且通過多種模式，包括轉錄調控、選擇性剪接、miRNA 競爭性吸附、mRNA 穩定調控、調控蛋白質的翻譯、降解、結構與功能[11]。miRNA 是一段編碼少于 20 bp的非編碼 RNA 分子，在調控基因表達過程中起著重要作用[12-14]。研究表明[15-17]，lncRNA 可以通過競爭內源性 RNA 或 miRNA“海綿”來調節腫瘤中關鍵癌基因或腫瘤抑癌基因，從而調節癌細胞的生長增殖等行為。位于21q22.3的LINC00313是一個新發現的lncRNA，其失調已在一些腫瘤中被報道[18]。例如，有實驗結果表明，下調LINC00313可抑制甲狀腺乳頭癌細胞的增殖、遷移和集落形成能力，進一步機制研究顯示，LINC00313下調miR-4429的表達，miR-4429過表達可抵抗LINC00313在甲狀腺乳頭狀癌細胞中的致癌作用[5，19]，但是，LINC00313 和miR-4429在NSCLC中的作用仍不清楚。本研究發現，在NSCLC患者和細胞中，LINC00313過度表達，而miR-4429下調表達，LINC00313的表達水平與miR-4429呈負相關。因此，miR-4429 和LINC00313可能在NSCLC的發生和發展中起作用。

本研究發現LINC00313和miR-4429有結合位點，LINC00313的過表達可以抑制miR-4429的表達水平。這與之前的研究LINC00313通過結合miR-4429充當了甲狀腺乳頭狀癌的癌基因的結果一致[5]。此外，本研究還進一步探討了miR-4429和LINC00313的臨床意義。Kaplan-Meier生存曲線顯示，LINC00313高表達的NSCLC患者的預后較低表達的患者差，而miR-4429高表達的NSCLC患者有更好的預后，所以LINC00313和miR-4429可能作為NSCLC患者的獨立預后生物標志物。此外，本研究進一步分析了LINC00313和miR-4429在診斷中的意義。ROC曲線結果顯示，LINC00313和miR-4429具有較高的診斷價值，其AUC 值分別為0.916和0.898。基于lncRNA和miRNA從組織釋放到血液中，并且在血漿中穩定存在的特性，進一步說明lncRNA和miRNA具有作為診斷NSCLC患者的生物標志物的潛在可能性[20，21]。

綜上所述， LINC00313和miR-4429在NSCLC患者和細胞中異常地表達，其表達水平可作為NSCLC患者的診斷及預后生物標志物。這項研究為NSCLC的診斷和預后提供了兩個潛在的生物標志物，并為未來NSCLC的研究和開發新的治療策略提供了研究思路。當然，本研究仍有許多不足之處，包括沒有進一步分析LINC00313/miR-4429在NSCLC病理機制中的作用，這將是今后研究的重點。

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收稿日期：2023-10-30；修回日期：2023-12-28

編輯/肖婷婷