響應(yīng)曲面法研究百眼藤總蒽醌的提取工藝研究

摘要：目的 "對百眼藤總蒽醌的提取工藝進(jìn)行研究，考察百眼藤總蒽醌小鼠單次給藥毒性反應(yīng)，為后續(xù)百眼藤總蒽醌的動物藥效實驗劑量設(shè)計提供理論依據(jù)。方法 "利用分光光度法測定百眼藤提取物中總蒽醌的含量，采用響應(yīng)曲面法對百眼藤提取工藝進(jìn)行考察。結(jié)果 "百眼藤總蒽醌的的最佳提取條件為提取溶劑66.26%乙醇，料液比1∶7.94，提取時間148.74 min。 結(jié)論 "本研究為百眼藤藥材中總蒽醌的最佳提取工藝提供了實驗依據(jù)。

關(guān)鍵詞：百眼藤；蒽醌；響應(yīng)曲面法

中圖分類號：R284.2 " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A " " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.02.013

文章編號：1006-1959（2025）02-0076-06

Study on the Extraction Process of Total Anthraquinones from Caulis Marsdeniae

by Response Surface Methodology

YAN Qin1， SU Hua2， HUANG Yulin1， JIANG Bei1， MA Xueying3， LUO Xiyi4

（1.Department of Pharmacy， Liuzhou Maternity and Child Healthcare Hospital， Liuzhou 545001， Guangxi， China;

2.Department of Evaluation of the Efficacy and Safety of Traditional Chinese Medicine Center， Guangxi Institute

of Chinese Medicine amp; Pharmaceutical Science， Nanning 530022， Guangxi， China;

3.College of Pharmacy， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;

4.College of Pharmacy Guilin Medical University， Guilin "541000， Guangxi， China）

Abstract： Objective "To study the extraction process of total anthraquinone in Morinda parvifolia， and to investigate the single-dose toxicity of total anthraquinone in mice， so as to provide a theoretical basis for the dose design of animal efficacy experiment of total anthraquinone in Morinda parvifolia. Methods "The content of total anthraquinones was determined by spectrophotometry， and the extraction process was investigated by response surface methodology. Results "The optimum extraction conditions of total anthraquinones were as follows： extraction solvent 66.26% ethanol， solid-liquid ratio 1：7.94， extraction time 148.74 min. Conclusion "This study provides an experimental basis for the optimal extraction process of total anthraquinones in Morinda parvifolia.

Key words： Morinda parvifolia; Anthraquinone; Response surface methodology

百眼藤為茜草科巴戟屬植物百眼藤（Morinda parvifolia Bartl.ex DC.），以全草入藥。收錄于《中藥大辭典》《中華本草》《全國中草藥匯編》《廣西本草選編》等[1，2]，主要分布于廣東、廣西、福建、臺灣、香港、海南、江西等地。文獻(xiàn)報道[3，4]百眼藤富含蒽醌類成分，蒽醌類成分的含量易受乙醇濃度、提取物料比、提取時間及提取次數(shù)影響[5-7]，目前尚未有百眼藤總蒽醌提取工藝研究報道。本研究擬采用響應(yīng)面法對百眼藤中總蒽醌進(jìn)行提取工藝研究，為后續(xù)的動物實驗提供優(yōu)質(zhì)百眼藤總蒽醌，現(xiàn)報道如下。

1材料與儀器

1.1藥材與試劑 "百眼藤藥材：采自廣西貴港市平南縣，經(jīng)柳州市婦幼保健院謝巍副主任中藥師鑒定為茜草科巴戟屬植物百眼藤后使用；1，8-二羥基蒽醌（批號：B21740，上海源葉生物科技有限公司）；醋酸鎂、乙醇、甲醇等均為分析純（廣東光華科技股份有限公司）。

1.2主要儀器 "雙列數(shù)顯水浴鍋水浴鍋（型號：HH-4S，上海科辰實驗設(shè)備有限公司）；干燥箱（型號：DHG-9055A，吳江市永聯(lián)機(jī)械設(shè)備廠）；全波長全自動多功能酶標(biāo)儀（型號：MultiskanGo，美國ThermoFisher）。

2方法

2.1百眼藤提取物中總蒽醌的測定

2.1.1顯色劑的配制 "醋酸鎂-甲醇溶液：稱取醋酸鎂2.54 g，加甲醇500 ml，超聲使溶解完全，搖勻，備用（含量為0.51%）[8，9]。

2.1.2對照品溶液的制備 "精密稱取1，8-二羥基蒽醌12.3 mg，置于50 ml容量瓶中，加甲醇至近刻度，超聲溶解，放冷，加甲醇補(bǔ)至刻度，為0.246 mg/ml的對照品溶液，待用。

2.1.3供試品溶液的制備 "稱取百眼藤提取物干膏細(xì)粉0.1 g，置于100 ml燒瓶中，加甲醇100 ml，稱重，水浴回流1 h，補(bǔ)重，過濾，即得。

2.1.4方法學(xué)考察 "線性關(guān)系的考察：精密吸取濃度為0.246 mg/ml的1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 ml，分別置于10 ml容量瓶中，加醋酸鎂-甲醇溶液（0.51%）至刻度，搖勻，取適量至酶標(biāo)板中，1 cm光程，523 nm測定。濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度試驗：取對照品液（0.246 mg/ml）6份，每份0.6 ml/份，制備，測定吸光度。

重現(xiàn)性試驗：取提取物樣品6份，約0.1 g/份，精密稱定，制備，測定，計算。

穩(wěn)定性考察：取提取物樣品1份，約0.1 g/份，精密稱定，制備，分別在0～3.0 h測定，計算。

加樣回收試驗：稱取百眼藤提取物干膏細(xì)粉6份（約0.05 g/份，樣品中總蒽醌含量為16.74%），置于100 ml圓底燒瓶中，精密加入1，8-二羥基蒽醌溶液10 ml（濃度為8.1 mg/ml），按供試液制備方法制備，測定，計算加樣回收試驗樣品中蒽醌的含量，計算加樣回收率。

2.1.5樣品測定 "取供試液1.0 ml，移至10 ml量瓶，加醋酸鎂-甲醇溶液稀釋至刻度，混勻，測定，計算樣品中蒽醌的含量。

2.2百眼藤總蒽醌提取單因素試驗

2.2.1乙醇濃度考察 "取百眼藤藥材6份，20 g/份，加8倍量的40%～90%乙醇提取2次，每次2 h，取提取干膏0.2 g，按供試液制備方法制備，測定，計算。

2.2.2料液比考察 "取百眼藤藥材6份，20 g/份，分別加入6～16倍量60%乙醇提取2次，每次2 h，取提取干膏0.2 g，制備，測定，計算。

2.2.3提取時間考察 "取百眼藤藥材6份，20 g/份，8倍量60%乙醇提取2次，提取時間30～180 min，取提取干膏0.2 g，制備，測定，計算。

2.2.4提取次數(shù)考察 "取百眼藤藥材4份，20 g/份，8倍量60%乙醇回流提取1～4次，每次2.0 h，取提取干膏0.2 g，制備，測定，計算。

2.3響應(yīng)面設(shè)計實驗

2.3.1實驗因素與水平設(shè)計 "根據(jù)單因素考察結(jié)果，并以1、0、-1分別表示自變量的高低水平，設(shè)計的實驗因素和水平取值，見表1。

2.3.2響應(yīng)曲面分析設(shè)計 "利用Design expert 10.0軟件對三因素3水平共17個試驗點進(jìn)行編碼。擬合試驗數(shù)據(jù)，建立二次多元回歸方程，對其進(jìn)行方差分析[10-12]。

2.3.3最佳提取工藝及驗證試驗 "求解二次多元回歸方程，按百眼藤總蒽醌最佳提取工藝，相關(guān)數(shù)據(jù)調(diào)整為便于操作的整數(shù)進(jìn)行試驗驗證。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法 "采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（x±s）表示，行ANOVA方差分析。

3結(jié)果

3.1方法學(xué)考察結(jié)果 "標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以1，8-二羥基蒽醌濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在線性范圍0.0025～0.0246 mg/ml內(nèi)，濃度-吸光度回歸方程為Y=28.904X + 0.1739（r=0.9991）。精密度試驗結(jié)果表明，6次測定的RSD為0.45%，表明本法的精密度良好。重現(xiàn)性試驗結(jié)果表明，6次測定的RSD為0.85%，表明本法的重現(xiàn)性較好。穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，6次測定的RSD為0.50%，表明供試品在3.0 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。加樣回收試驗結(jié)果表明，總蒽醌的平均回收率為100.89%，RSD為1.20%，見表3。

3.2百眼藤總蒽醌提取單因素試驗

3.2.1乙醇濃度考察 "乙醇濃度為50%、60%、70%時，百眼藤總蒽醌提取得率較高，見圖1。

3.2.2料液比考察 "加入6～16倍量60%乙醇為提取溶劑，百眼藤總蒽醌提取得率無明顯區(qū)別，從節(jié)約成本角度考慮，選擇料液比為1∶6、1∶8、1∶10進(jìn)行考察，見圖2。

3.2.3提取時間考察 "提取時間為0.5、1.0 h時，百眼藤總蒽醌提取得率較低，提取時間為90、120、150、180 min時，百眼藤總蒽醌提取得率較高，且提取得率無明顯區(qū)別，從節(jié)約成本角度考慮，選擇提取時間為90、120、150、180 min進(jìn)行考察，見圖3。

3.2.4提取次數(shù)考察 "提取次數(shù)為1次時，百眼藤總蒽醌提取得率較低，提取次數(shù)為2、3、4次時，百眼藤總蒽醌提取得率較高，且提取得率無明顯區(qū)別，從節(jié)約成本角度考慮，選擇提取次為2次，見圖4。

3.3響應(yīng)面設(shè)計實驗

3.3.1響應(yīng)曲面分析設(shè)計 "利用Design expert 10.0軟件對三因素3水平共17個試驗點進(jìn)行編碼，見表4。

3.3.2響應(yīng)曲面結(jié)果分析 "根據(jù)表4的結(jié)果，對百眼藤總蒽醌提取結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸分析，二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗見表5，方差的結(jié)果分析，模型P值為0.0002，表示模型高度顯著，可充分代表響應(yīng)值（R）與三個變量A（溶劑濃度）、B（料液比）、C（提取時間）的關(guān)。根據(jù)ANOVA的分析表明百眼藤總蒽醌提取量的決定系數(shù)R2分別為96.68%，模型F值分別為22.67，說明模型非常顯著。從表4表5可以看出，百眼藤總蒽醌提取量主要溶劑濃度A影響（P＜0.0001），其次是提取時間C的影響（P=0.0001），最后是料液比B的影響（P=0.0003），對于交互項，分別繪制響應(yīng)面圖和等高線圖（圖5），從圖中可以看出，以上響應(yīng)面形狀均較陡，等高線呈明顯的橢圓形，說明各交互作用均較為明顯，對百眼藤總蒽醌提取量的影響依次為AC、AB、BC。Design expert 8.0.6預(yù)測得到百眼藤總蒽醌的最佳提取條件是乙醇濃度為66.26%，料液比為1∶7.94，3提取時間為148.74 min，百眼藤總蒽醌提取量為488.396 mg。各實驗因子對響應(yīng)值的影響呈顯著的線性關(guān)系，回歸方程為R=464.92+8.92A+7.03B+8.17C-3.29AB

-5.25AC+ 1.64BC+5.45A2+2.78B2-0.25C2。

3.3.3最佳提取工藝及驗證試驗 "求解二次多元回歸方程，百眼藤總蒽醌最佳提取工藝為乙醇濃度為66.26%，料液比為1∶7.94，提取時間為148.74 min，百眼藤總蒽醌提取得量為488.396 mg。

按百眼藤總蒽醌最佳提取工藝，相關(guān)數(shù)據(jù)調(diào)整為便于操作的整數(shù)進(jìn)行試驗驗證，方法如下：取百眼藤藥材3份，20 g/份，采用濃度為66%的乙醇溶液進(jìn)行提取，料液比：1∶8；提取時間：149 min；回流提取2次，取提取得干膏0.2 g，制備，測定并計算，見表6。

結(jié)果表明，按獲得的百眼藤總蒽醌最佳提取工藝進(jìn)行驗證試驗，實際提取結(jié)果與理論最佳提取工藝結(jié)果相差不大，實際值/理論值×100%=483.27/488.40×100%=98.95%。驗證試驗結(jié)果表明所得的最佳提取工藝可行性較高。

4討論

據(jù)文獻(xiàn)報道[3，4]，百眼藤中含有多種蒽醌類成分，如百眼藤醌A、百眼藤醌B，茜草素-1-甲醚、銹色洋地黃醌醇、1-羥基-6-或7-羥甲基蒽醌、2-羥甲基蒽醌等。多種蒽醌類成分具有較好的抗腫瘤作用并已經(jīng)作為臨床一線用藥使用，用于治療肺癌、胃癌、淋巴癌等惡性腫瘤，如阿霉素、米托霉素等[13]。另外，肝毒性是蒽醌類藥物較為常見的副作用[14]。如何獲得藥效好而毒性低的蒽醌類藥物[15]，從天然藥物中擴(kuò)大篩選范圍是比較可行的一種解決辦法。本實驗選擇以蒽醌類成分測定作為百眼藤提取工藝研究的監(jiān)控手段，更有可能獲得百眼藤藥效活性成分的富集部位。

蒽醌類成分的含量測定方法有滴定法、分光光度法、熒光分析法、高效液相色譜法、超高液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效毛細(xì)管電泳法等方法[16-19]。滴定法是藥物分析發(fā)展前期比較常用的一種含測方法，存在著誤差大的缺點。高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確度高，但是儀器價格高，維護(hù)成本大。分光光度法檢測儀器價格不高，檢測結(jié)果也有較好的準(zhǔn)確度，適用于活性部位或組分的含量控制，故本實驗選擇分光光度法對百眼藤提取物中蒽醌的含量進(jìn)行監(jiān)控。本實驗對百眼藤總蒽醌分光光度含量測定進(jìn)行了一系列的方法學(xué)研究，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、加樣回收試驗都取得了較為滿意的結(jié)果，證明建立起的含量測定方法可行。

藥材常用的提取溶劑有水、乙醇、乙醇-水混合溶劑，蒽醌類成分為含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)及羥基基團(tuán)的有機(jī)化合物，易溶于乙醇-水混合溶劑[19，20]，故本實驗選擇不同濃度的乙醇-水溶劑進(jìn)行考察，另選擇提取時間、提取次數(shù)、料液比等因素先進(jìn)行單因素考察，確定一定的水平范圍后再進(jìn)行響應(yīng)面法試驗研究，以料液比、提取次數(shù)及提取時間為3個考察因素，設(shè)置3水平來對百眼藤中總蒽醌的提取進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)百眼藤總蒽醌的最佳提取條件為：乙醇濃度66.26%，料液比1∶7.94，提取時間148.74 min。經(jīng)驗證試驗確證，預(yù)測值與驗證值相近。本實驗的研究為今后百眼藤總蒽醌的提取及藥效開發(fā)提供了參考。

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收稿日期：2023-12-23；修回日期：2024-01-09

編輯/成森