牙周炎患犬口腔菌群差異性及卟啉單胞菌耐藥性分析

摘 要：

牙周炎是犬常見的口腔疾病之一，會導致不可逆轉的牙周組織丟失、牙周附著力降低，嚴重影響動物福利。本研究旨在了解牙周炎患犬和牙周健康犬口腔菌群豐度及藥物敏感性差異，探究犬牙周炎特征性致病菌及其藥物敏感性、耐藥基因攜帶情況。通過采集牙周炎患犬與牙周健康犬牙菌斑，采用16S rDNA測序方法進行口腔菌群差異性分析、確定菌群藥物敏感性、明確特征性致病菌。并對致病菌進行分離鑒定及藥物敏感性試驗。結果表明，與牙周健康犬相比，牙周炎患犬口腔菌群中齦下菌斑數目顯著高于齦上菌斑，擬桿菌門和螺旋體門相對豐度有所增加，屬水平上卟啉單胞菌屬相對豐度明顯增加，提示其可能為牙周炎潛在致病菌。菌群藥敏結果顯示，齦下需氧菌對阿莫西林、恩諾沙星等抗生素敏感性最高，甲硝唑敏感性最低；齦下厭氧菌對恩諾沙星敏感性中等，甲硝唑敏感性最低。分離到的可疑致病菌與猴卟啉單胞菌（P. macacae-DSM20710）相似性達98.89%，卟啉單胞菌對恩諾沙星敏感，含有大環內酯類（ermF）和四環素類（tetQ）兩種耐藥基因。犬牙周炎的臨床治療可首選恩諾沙星。

關鍵詞：

犬牙周炎；菌群分離鑒定；藥物敏感性試驗；耐藥基因

中圖分類號：S852.6

文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0934-09

收稿日期：2024-03-18

基金項目：新瑞鵬寵物醫療公司集團有限公司橫向課題

作者簡介：杜清潔（1999-），女，山西臨汾人，碩士生，主要從事小動物臨床疾病研究，E-mail： duqingjie0502@163.com

*通信作者：張欣珂，主要從事獸醫臨床學研究，E-mail： zxk19830521@163.com

Difference Analysis of Oral Flora in Dogs with Periodontitis and Drug Resistance of Oral Porphyromonas

DU" Qingjie1， WU" Liping2， ZHANG" Fan1， DAI" Pengxiu1， FENG" Xiancheng1， ZHANG" Xinke1*

（1.College of Veterinary Medicine， Northwest Aamp;F University， Yangling 712100，" China;

2.Yangling Vocational and Technical College， Yangling 712100，" China）

Abstract：

Periodontitis is one of the common oral diseases in dogs， which can cause irreversible periodontal tissue loss and reduced periodontal adhesion， and seriously affect animal welfare. This study was designed to understand the drug resistance status oral flora in canine periodontitis; and to explore the drug sensitivity and drug resistance genes of characteristic pathogenic bacteria of canine periodontitis. This trial will be randomly selected periodontitis-infected dogs and healthy dogs to collect dental plaque and conduct drug sensitivity tests. In addition， 16S rDNA sequencing was performed on oral samples. The differences in oral flora between periodontitis-infected dogs and healthy dogs were explored， and the possible characteristic pathogenic bacteria causing canine periodontitis were identified. The drug susceptibility of the oral flora was determined. Then， the isolation， identification and drug sensitivity test were performed. The results showed that the relative abundance of Bacteroidetes and Spirochaeta increased at the level of oral flora， and the relative abundance of Porphyromonas at the genus level was significantly increased. It was speculated that the potential pathogenic bacteria of canine periodontitis was Porphyromonas. The subgingival aerobic bacteria had the highest sensitivity to amoxicillin and enrofloxacin， and had the lowest sensitivity to metronidazole. The sensitivity of subgingival anaerobes to enrofloxacin was medium， and the sensitivity to metronidazole was lowest. P. clinical is sensitive to enrofloxacin and contains two resistance genes ermF and tetQ. Enrofloxacin is preferred in the clinical treatment of canine periodontitis.

Key words：

canine periodontitis; isolation and identification of flora; drug sensitivity test; drug resistance gene

*Corresponding author：" ZHANG Xinke， E-mail： zxk19830521@163.com

犬牙周炎是一種由細菌及其毒素引起的慢性炎癥性疾病，會導致犬牙周支持組織進行性丟失，伴有出血和病理性牙周袋形成，最終導致牙齒脫落，是犬常見的口腔疾病之一，研究指出3歲以上的犬中有80%會出現牙周炎［1-2］。口腔微生物種類和微生物菌群相對豐度的變化都有可能引起口腔微環境的改變，進而成為口腔疾病的始動因子之一。當口腔微生態系統平衡被打破，牙齒表面微生物膜不斷沉積形成牙菌斑，是口腔微生物失衡的表現之一，可能誘發牙周炎等多種口腔疾?。?-5］。在牙菌斑病原微生物及其代謝產物的刺激下引發牙齦炎，若不及時治療菌斑將增厚，并進一步挺伸直至齒齦溝，破壞牙周附著組織，形成病理性牙周袋及不可逆的牙槽骨、牙骨質丟失，最終導致牙齒脫落，即牙周炎，嚴重的牙周炎還可能引發全身性疾?。?-7］。

有研究表明，卟啉單胞菌在牙周炎的發生發展過程中發揮著重要的作用，是主要的病原體之一［8-9］。健康犬、牙齦炎患犬和牙周炎患犬口腔內均有卟啉單胞菌屬的存在，但在牙周炎患犬口腔菌群中占比較大［9-10］。卟啉單胞菌在牙齒表面及牙周袋內大量繁殖，抗原成分及代謝產物直接破壞牙周組織［10-11］。有研究表明其對氨基糖苷類、較老的氟喹諾酮類藥物、大環內酯類和林克胺類抗生素具有耐藥性［12］，為牙周炎的抗生素治療帶來了一定的困難。

本研究擬采集牙周炎患犬和牙周健康犬的牙菌斑，通過16S rDNA測序對牙周炎患犬和健康犬口腔菌群進行對比研究，評估兩組口腔菌群之間相對豐度的差異。進而對牙周炎患犬口腔齦下卟啉單胞菌進行分離培養、鑒定，藥物敏感性試驗、耐藥基因確定等，為針對性治療犬牙周炎提供理論基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

2021年2—9月于西北農林科大西安動物醫院就診犬只中，隨機選取18只牙周炎患犬和9只牙周健康犬。

1.2 主要試劑

腦心浸出液（BHI）肉湯、腦心浸出液（BHI）瓊脂購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；DNAiso Reagent、PrimeSTAR Max Premix（2×），購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；藥敏試紙購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本采集及測序

采集全身麻醉的犬齦上菌斑樣本，然后對牙冠表面進行超聲潔治術，再次使用牙周刮匙采集牙周袋底部的齦下菌斑。將采集到的齦上、齦下菌斑樣本-20 ℃保存，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行16S rDNA測序。對有效數據進行OTUs（operational taxonomic units）聚類和物種分類分析，同時進行相對豐度的對比。

1.3.2 細菌分離、培養與鑒定

將齦下菌斑樣本涂布于BHI血平板37 ℃厭氧培養5～7 d。純化培養4～5代后挑取典型單菌落進行染色鏡檢、生化鑒定、16S rDNA特異性引物（表1）PCR擴增，同時使用細菌通用引物27F與1492R（表1）作為對照。PCR反應體系25 μL：上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，PrimeSTAR Max Premix （2×），13 μL，dd H2O 9 μL。反應條件：98 ℃預變性10 min；98 ℃變性10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循環35次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行測序，將測序結果進行同源性比對分析并完成發育樹的構建。將陽性菌液配置至甘油終濃度25%，將陽性菌液保存于25%甘油中， -80 ℃凍存。

1.3.3 藥敏試驗

以ATCC13124作為質控菌株，參考美國臨床檢驗標準委員會（CLSI）推薦的K-B瓊脂擴散法測定口腔菌群耐藥性以及使用瓊脂稀釋法測定卟啉單胞菌的耐藥性并判定MIC。參考美國臨床檢驗標準委員會（CLSI）推薦的K-B瓊脂擴散法，對口腔菌群的耐藥性進行測定，使用瓊脂稀釋法檢測卟啉單胞菌的耐藥性并判定MIC。

1.3.4 耐藥基因篩選

以細菌為模板進行β-內酰胺類（cfxA）、大環內酯類（ermF）、四環素類（tetQ）和硝基咪唑類（nim）耐藥基因引物擴增（表2）。對得到的PCR產物進行測序，并在NCBI中與對應的耐藥基因參考序列進行同源性比對。

2 結 果

2.1 16S rDNA測序

2.1.1 OTU 分析

分別對牙周健康犬和牙周炎患犬牙菌斑樣本進行分析處理與質控拼接，對所得序列聚類生成OTUs。本試驗采集的54個樣本中，測得其包含447科、856屬、648種細菌。在OTU的基礎上制成Venn圖，如圖1所示，牙周健康犬Venn圖（圖1a）顯示有1 417個OTUs為齦上菌斑與齦下菌斑共有，齦下菌斑特有676個OTUs，齦上菌斑特有645個OTUs；牙周炎患犬的Venn圖（圖1b）顯示共有1 287個OTUs，齦下菌斑特有950個OTUs，齦上菌斑特有542個OTUs。結果顯示出無論是牙周健康犬還是牙周炎患犬，齦下菌斑的OTUs數目均高于齦上菌斑，但與牙周健康犬相比，牙周炎患犬齦下菌斑數目顯著高于齦上菌斑，且齦上菌斑數目有所降低。

2.1.2 微生物菌群相對豐度比較

對齦上菌斑門水平上微生物菌群相對豐度對比分析，結果如圖2所示，牙周炎患犬中排名前3的是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota），與牙周健康犬相較，其擬桿菌門和螺旋體門（Spirochaetota）相對豐度均有顯著增加，梭桿菌門（Fusobacteriota）的相對豐度無明顯變化。從齦上菌斑屬水平上的相對豐度比較結果可以看出，患犬中排名前3的是卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、莫拉菌屬（Moraxella）。

對齦下菌斑門水平上微生物菌群相對豐度進行比較，結果顯示（圖3），牙周炎患犬的牙菌斑中擬桿菌門和螺旋體門相對豐度有所升高，梭桿菌門相對豐度降低。從屬水平上對微生物菌群的相對豐度結果進行分析可知，與牙周健康犬相比，牙周炎患犬卟啉單胞菌屬相對豐度顯著升高，梭桿菌屬豐度降低。

鑒于本試驗16S rDNA測序結果顯示，卟啉單胞菌在牙周炎患犬和牙周健康犬口腔中分布差異顯著，且相關研究指出卟啉單胞菌可能是導致犬患牙周炎潛在致病菌［13-14］。因此本試驗對牙周炎患犬口腔齦下卟啉單胞菌進行分離鑒定，并對其進行藥物敏感性試驗，篩選耐藥基因，以期為犬牙周炎的臨床治療提供參考。

2.2 細菌分離培養

將牙周炎患犬的齦下菌斑樣本經厭氧培養，分離純化共得到符合卟啉單胞菌菌落菌體形態和染色特征的18株臨床分離菌株。分離菌落表面光滑，呈圓形凸起，專性厭氧培養至第7天左右，顏色由灰白色轉為墨黑色，具有金屬光澤。進行革蘭染色后的鏡檢結果顯示呈短桿狀，無芽胞的革蘭陰性菌（圖4）。

2.3 細菌鑒定結果

2.3.1 分子生物學鑒定結果

以分離菌株為模板進行PCR特異性引物擴增后，發現6株分離菌株產生目的條帶（圖5a和b）；細菌通用引物擴增產物均產生目的條帶（圖5c）。對通用引物PCR產物測序并經BLAST比對分析，發現其中一株分離菌株序列與獼猴卟啉單胞菌DSM20710菌株相似性為98.89%，命名為P. clinical。

2.3.2 系統發育樹構建結果

P. clinical與獼猴卟啉單胞菌（P. macacae-DSM20710）菌株聚為一支，相較于其他菌種的常見菌株，P. clinical與獼猴卟啉單胞菌常見菌株P. macacae-7728-L6C菌株也聚為一支（圖6）。

2.3.3 生化鑒定結果

生化鑒定結果顯示P.clinical不能酵解阿糖醇、肌醇、木糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露醇等糖醇類。不具有尿素酶和七葉苷水解酶活性；能使色氨酸去氨基化，無法對鳥氨酸、胍丁胺、精氨酸、枸櫞酸鹽、賴氨酸、丙二酸、丙酮酸等進行碳利用。存在FR7（γ-谷氨酰胺-7-甲基香豆素酰胺）底物酶，未檢測出其余生化項目的底物酶。

2.4 藥物敏感性試驗

2.4.1 口腔菌群藥敏試驗結果

牙周炎患犬的齦上菌斑藥物敏感性試驗結果顯示（表3），齦上需氧菌對氨芐西林、頭孢氨芐、恩諾沙星和阿奇霉素的

敏感性最高，其次是阿莫西林，敏感性最差的藥物是甲硝唑和多西環素。齦上厭氧菌對阿莫西林、頭孢氨芐、甲硝唑、恩諾沙星和阿奇霉素的敏感性最高，其次是氨芐西林和多西環素。

牙周炎患犬的齦下菌斑藥物敏感性試驗結果顯示（表3），齦下需氧菌對阿莫西林、氨芐西林、頭孢氨芐、恩諾沙星和阿奇霉素的敏感性最高，多西環素敏感性次之，甲硝唑的敏感性最低。齦下厭氧菌對阿莫西林、氨芐西林、頭孢氨芐和阿奇霉素的敏感性最高，對恩諾沙星和多西環素敏感性次之，甲硝唑敏感性最低。

2.4.2 卟啉單胞菌藥敏試驗結果

使用ATCC13124質控菌株對P. clinical進行藥物敏感性試驗，根據CLSI提供的參考標準進行結果判讀，結果顯示（表4），P. clinical對恩諾沙星敏感，對阿莫西林、頭孢曲松鈉和頭孢氨芐中度敏感，對鹽酸多西環素、甲硝唑、硫酸慶大霉素和阿奇霉素耐藥。

2.5 卟啉單胞菌耐藥基因

以P.clinical為模板使用cfxA、ermF、tetQ和nim耐藥基因引物進行PCR擴增后，發現攜帶ermF和tetQ兩種耐藥基因，條帶大小分別為466和904 bp（圖7），未發現nim和cfxA的陽性條帶，說明分離得到的P. clinical存在大環內酯類和四環素類的耐藥基因。

3 討 論

口腔是食物消化的起始器官，其特殊的環境為口腔微生物的生長繁殖和定植提供了條件。犬進食20 min后口腔游離菌群會形成生物膜，6 h后形成牙菌斑。牙菌斑在唾液、食物和牙齒中的鈣質礦化作用下形成牙結石，其在為牙菌斑的附著提供條件的同時又反復刺激牙齦，最終導致牙齦炎的形成［5］。隨著牙齦炎的進一步發展可能成為牙周炎，牙齦和牙齒分離后形成了牙周袋，為牙周炎致病專性厭氧菌的生存提供了有利條件。牙周炎致病菌產生的厭氧菌酶和內毒素可引起根尖周病變［9］，若病原菌隨血液進入全身，有可能會誘發系統性疾病，甚至出現菌血癥［15］。除了菌血癥外，牙周炎病原菌長期釋放炎癥介質、免疫復合物、細菌和細胞降解的產物進入血液和淋巴液，可能造成直接或免疫介導性的遠端器官病變。

本研究中牙周健康犬和牙周炎患犬口腔齦上菌斑與齦下菌斑OTUs分析結果顯示牙周炎患犬中齦下菌斑中的OTUs數目顯著多于齦上菌斑，且牙周炎患犬中齦上菌斑OTUs數目降低，由此推測齦下菌斑可能含有導致犬牙周炎的主要菌群。Oba等［14］指出牙周炎患犬和牙周健康犬最具代表性的門是擬桿菌門、梭桿菌門、螺旋體門、變形菌門和厚壁菌門。Dewhirst等［16］提出擬桿菌門、螺旋體門和梭桿菌門相對豐度的變化與犬牙周炎的形成存在密切關系。本試驗結果顯示，患犬口腔齦下菌斑與齦上菌斑中擬桿菌門和螺旋體門相對豐度明顯升高，梭桿菌門相對豐度變化不大，與先前研究中所提出的擬桿菌門、螺旋體門、梭桿菌門與牙周炎關系密切相一致。本試驗牙周炎患犬齦上菌斑卟啉單胞菌屬、梭桿菌屬與牙周健康犬相比豐度均有所升高，齦下菌斑卟啉單胞菌屬的相對豐度與牙周健康犬相比明顯升高，而梭桿菌屬的豐度降低。本試驗結果與先前研究中提出的卟啉單胞菌屬可能是牙周炎致病菌相一致［14］；但梭桿菌屬相對豐度變化與先前研究中所提出的梭桿菌屬與牙周炎關系密切不一致，這可能是由于時間和地區的不同，患犬口腔菌群分布差異有關。因此在本研究結果上結合前人研究，推測卟啉單胞菌相對豐度的升高與犬牙周炎存在關聯，因此重點對卟啉單胞菌屬進行研究。

目前治療口腔感染性疾病的常用藥物主要包括β-內酰胺類、四環素類、硝基咪唑類等。本研究發現無論口腔需氧菌還是厭氧菌均對恩諾沙星和β-內酰胺類藥物的敏感性最高，具有較好的體外抑菌效果。盡管甲硝唑是治療厭氧菌感染的常用藥物，但是本試驗中齦上菌斑和齦下菌斑對甲硝唑表現出的敏感性并不高，說明甲硝唑可能已經存在耐藥現象。本研究結果顯示恩諾沙星和β-內酰胺類藥物對口腔菌群具有良好的體外抑菌效果，為犬牙周炎的抗菌治療提供了用藥建議。

卟啉單胞菌是一類革蘭陰性厭氧桿菌，無芽胞，無孢子，生長需要維生素K1和氯化血紅素，菌落大多呈黑色，主要的發酵產物為正丁酸和乙酸，也可以產生丙酸、異戊酸和苯乙酸［17］。其常在健康犬口腔與患犬的牙菌斑和牙周袋內均有發現，可編碼多種毒力因子侵入牙齦上皮細胞刺激宿主［9-11，18］。

卟啉單胞菌作為牙周厭氧菌的代表性菌種，其在厭氧感染的致病性中起著重要作用。目前已有研究指出，卟啉單胞菌對大環內酯類和林克胺類抗生素出現耐藥性［12］。而本試驗MIC測定結果中，P. clinical僅對恩諾沙星敏感，對多西環素、甲硝唑、硫酸慶大霉素和阿奇霉素耐藥。通過耐藥基因檢測發現該菌株攜帶tetQ和ermF兩種耐藥基因。這說明該菌已對四環素類藥物和大環內酯類藥物產生耐藥性，與先前研究中牙周炎優勢厭氧菌對四環素類藥物敏感的結果存在差異［19］，這可能是由于地域和時間的變化，經驗性使用廣譜抗生素或者將其作為傳統牙周治療的輔助藥物，造成的藥物敏感性差異。本研究綜合MIC測定和耐藥基因檢測結果表明P. clinical存在多重耐藥性，為獸醫臨床牙周炎中應用抗生素治療帶來了困難。并且細菌攜帶的耐藥基因可以通過駐留或瞬時在群體中通過水平基因轉移，而逐漸在其他致病菌種中傳播［20-21］，而犬與人類密切接觸，對公共健康構成了威脅［22］。因此建議在獸醫臨床治療中，應進行藥物敏感性試驗，謹慎使用抗生素。

4 結 論

本研究顯示犬牙周炎潛在致病菌為卟啉單胞菌屬；恩諾沙星可作為控制犬牙周炎的首選抗生素，臨床分離菌株MIC測定結果以及耐藥基因檢測結果表明已出現多重耐藥的現象，應謹慎使用抗生素。

本研究對牙周炎患犬和健康犬的口腔菌群樣本進行16S rDNA測序，通過分析發現，犬牙周炎主要潛在致病菌屬為卟啉單胞菌屬。使用阿莫西林、氨芐西林、頭孢氨芐、阿奇霉素、多西環素、恩諾沙星和甲硝唑七種抗生素，對口腔菌群進行體外藥物敏感性試驗，結果顯示患犬口腔菌群對恩諾沙星敏感性最高，對甲硝唑敏感性最低。從患犬齦下菌斑中分離得到的卟啉單胞菌，綜合其藥敏結果僅對恩諾沙星敏感，以及耐藥基因檢測存在erm F和tet Q這兩種基因，表明該菌已存在多重耐藥現象。

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（編輯 白永平）