豬IL-1β單克隆抗體制備及其抗炎癥反應活性

摘 要：

IL-1β可介導炎癥病理，阻斷IL-1活性具有重要抗炎治療作用。本研究通過構建豬IL-1β原核表達質粒，進行大腸桿菌表達和蛋白純化，制備重組蛋白。采用細胞雜交瘤技術制備獲得4株穩定分泌IL-1β單克隆抗體雜交瘤細胞株（1E2、2H3、5H3及7E7）；4株單抗腹水ELISA效價高達1∶1 024 000；5H3單抗識別的抗原表位為149DLKREVVFCM158；1E2、2H3和7E7單抗所識別的抗原表位為202KRYPKRD208。脂多糖（LPS）小鼠炎癥模型抗炎試驗結果顯示，相對LPS對照組，IL-1β單抗處理組小鼠血清NO、TNF-α、IL-6和IL-1β含量及臨床癥狀評分顯著降低，表明4株單抗均有較好抗炎效果，其中1E2單抗抗炎作用最優，為豬IL-1β阻斷藥物研究奠定了重要基礎。

關鍵詞：

IL-1β；單克隆抗體；炎癥治療

中圖分類號：

S852.659.6 """"文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0890-10

收稿日期：2024-03-25

基金項目：國家自然科學基金項目（32230103）；國家生豬產業技術體系專項（CARS-35）；江蘇省自主創新研發基金項目（CX（22）1011）

作者簡介：李 璠（1997-），女，陜西漢中人，碩士生，主要從事動物傳染病學研究，E-mail：962392369@qq.com

*通信作者：姜 平，主要從事動物傳染病學研究，E-mail： jiangp@njau.edu.cn

Preparation and Anti-inflammatory Activity of Porcine IL-1β Monoclonal Antibody

LI" Fan， SUN" Haifeng， SUN" Meng， GAO" Yanxiao， SUN" Yangyang， ZHANG" Lujie， BAI" Juan， JIANG" Ping*

（Key Laboratory of Animal Bacteriology of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，" China）

Abstract：

IL-1β mediates inflammatory pathology， and blocking IL-1 activity has important anti-inflammatory effects. In this study， recombinant protein was prepared by constructing porcine IL-1β prokaryotic expression plasmid， expression by Escherichia coli and protein purification. Four hybridoma cell lines （1E2， 2H3， 5H3 and 7E7） with stable IL-1β monoclonal antibody secretion were prepared by cell hybridoma technique. The ELISA titer of the 4 mAbs in ascites were up to 1： 1 024 000. The epitope of 5H3 mAb was 149DLKREVVFCM158. The epitope recognized by 1E2， 2H3 and 7E7 mAb was 202KRYPKRD208. The anti-inflammatory test results of lipopolysaccharide （LPS） mice inflammation model showed that compared with LPS control group， serum NO， TNF-α， IL-6 and IL-1β contents and clinical symptom score of mice treated with IL-1β monoclonal antibody were significantly reduced， indicating that all the four strains of monoclonal antibody had better anti-inflammatory effect， and 1E2 monoclonal antibody had the best anti-inflammatory effect. It laid an important foundation for the study of porcine IL-1β blocking drugs.

Key words：

IL-1β; monoclonal antibody; inflammatory therapy

*Corresponding author：" JIANG Ping， E-mail： jiangp@njau.edu.cn

細胞因子是一種伴隨著炎癥、免疫激活、細胞分化及死亡的一種多肽，在免疫應答過程中發揮著關鍵作用［1-2］。過度的免疫激活和細胞因子釋放可誘導發熱、血管滲漏、腹瀉、心肌病和肺損傷［3-5］。細胞炎性死亡可促進成熟的IL-1β釋放到細胞，從而介導炎癥［6］。豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬流行性腹瀉病毒等重要病原感染可產生IL-1β，引起強烈的炎癥反應［7-9］。配合采用相應的抗炎治療，將降低病毒感染的發病率及死亡率，可利于防止豬病情惡化。單克隆抗體及其衍生物，包括雙特異性抗體、抗體-藥物綴合物和抗體片段，是目前發展最快的一類治療分子［10］。目前尚無針對豬強烈炎癥反應的IL-1抗體阻斷治療藥物。

本研究采用大腸桿菌表達系統獲得IL-1β重組蛋白，研制出4株單克隆抗體，采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）小鼠炎癥模型［11-13］，證明本研究研制的豬IL-1β單克隆抗體具有較好抗炎效果，為IL-1β阻斷藥物研究奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

地塞米松購自Solarbio公司；一氧化氮（NO）含量檢測試劑盒（化學法）、小鼠腫瘤壞死因子α ELISA 試劑盒、小鼠白細胞介素1 β ELISA 試劑盒、小鼠白細胞介素6 ELISA 試劑盒均購自Solarbio公司。2×Phanta Max Master Mix 和Pres-tained Protein Marker購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性核酸內切酶和T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher Scientific公司；山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP和HPR-SPA購自上海碧云天生物技術有限公司；HisSep Ni-NTA Agarose Resin購自上海翊圣生物科技有限公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Proteintech 生物科技有限公司；TanonTM High-sig ECL Western blot 底物試劑盒購自天能科技有限公司；異丙基硫代-β-D半乳糖（IPTG）、PEG1450、50×HAT、50×HT和LPS購自美國Sigma公司。其他試劑均為國產分析純。

小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0）、大腸桿菌E. coli T1、Rosetta和BL21均由本實驗室保存。

SPF 級雌性ICR小鼠（4～5周齡，18～20 g），雌性BALB/c小鼠（6～8周齡）購自揚州大學實驗動物中心。

1.2 重組質粒構建

根據豬IL-1β（NCBI： NM_214055.1）基因序列， 選擇第115—268 aa活性基因部分，采用 TMHMM Serverv.2.0網站軟件進行蛋白性質分析，該部分均為胞外區。設計PCR引物：IL-1β-F：5′-CCGCTCGAGGCCAACGTGCAGTCTATGGAG-TGCAA-3′，含有XhoⅠ 酶切位點（下劃線處）；IL-1β-R：5′- CGCGGATCCGGGAGAGAGGACTTCCATGG-3′，含有BamH Ⅰ 酶切位點（下劃線處），用于擴增IL-1β片段，大小為462 bp。提取豬肺泡巨噬細胞RNA，反轉錄為cDNA。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，循環35次；72 ℃ 5 min。將目的片段和pCold Ⅰ載體通過XhoⅠ 和BamH Ⅰ 雙酶切后進行連接，連接產物轉化至T1菌，經菌液PCR和酶切鑒定正確后送通用生物公司測序，結果比對正確，將重組質粒pCold Ⅰ-IL-1β于-20 ℃保存備用。

1.3 重組蛋白誘導表達及純化

參考文獻［14］中的方法，將重組質粒pCold Ⅰ-IL-1β轉化至Rosetta感受態細胞，1 mmol·L-1 IPTG誘導，16 ℃培養6 h。收集菌體超聲破碎，分離上清和沉淀，SDS-PAGE鑒定蛋白表達形式，采用鎳柱親和層析法純化目的蛋白，純化IL-1β蛋白用超濾管進行濃縮后測定蛋白濃度，于-80 ℃保存備用。

1.4 豬IL-1β單克隆抗體的制備

1.4.1 動物免疫

根據參考文獻［15］，將純化后的重組IL-1β蛋白與等體積ISA206佐劑混合，充分乳化后皮下注射小鼠，50 μg·只-1，間接ELISA測定小鼠血清抗體效價，當抗體效價≥1∶10 000時，用重組IL-1β蛋白進行加強免疫。3 d后進行細胞融合。

1.4.2 細胞融合與陽性雜交瘤細胞篩選

根據參考文獻［16-17］，取加強免疫小鼠脾細胞和SP2/0細胞，按照7∶1的比例混合均勻，加入PEG1450進行融合。將融合完成的細胞按照不同密度鋪至含有2% HAT選擇性培養基的96孔板內，培養7 d左右，觀察雜交瘤長成小團后，進行全換液，間隔24～36 h取雜交瘤細胞上清，用間接ELISA抗體檢測方法篩選陽性雜交瘤細胞，進行2～3次亞克隆。傳代至20代，擴大培養至T25細胞瓶，于液氮中保存。

1.4.3 間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞

參考文獻［18］報道的方法，用重組IL-1β蛋白作為包被抗原，雜交瘤細胞上清作為一抗，山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP作為二抗，融合前小鼠血清和SP2/0細胞培養液上清分別作為陽、陰性對照。測定每孔OD450 nm值，S/N＞2.1，則判定為陽性。

1.5 單克隆抗體特性鑒定

1.5.1 單克隆抗體細胞株分泌穩定性及亞型鑒定

將陽性雜交瘤細胞進行穩定傳代培養，第5、10、15和20代各凍存2支細胞，并收集其營養液測定抗體效價。按照抗體亞型鑒定試劑盒說明書進行抗體亞型鑒定。

1.5.2 單克隆抗體的特異性反應鑒定

取轉染和未轉染pCAGGS-IL-1β質粒的293T細胞樣品進行SDS-PAGE檢測，轉印至硝酸纖維素膜（NC膜）上，采用制備的單抗培養液上清進行Western blot反應性鑒定。

1.6 腹水制備

根據參考文獻［19］，取8周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射500 μL無菌液體石蠟。7 d后，腹腔注射3×106～4×106個雜交瘤細胞。7 d后觀察，小鼠腹部脹大，且觸之有波動感時，用頭皮針采集腹水。收集的腹水12 000 r·min-1離心10 min，取上清，分裝后，于-80 ℃保存備用。

1.7 B細胞抗原表位鑒定

根據豬IL-1β基因序列，設計12個截短體引物序列（表1），將PCR擴增產物克隆至pGEX-4T-1載體，轉入感受態細胞并誘導表達，用 SDS-PAGE 驗證截短體是否成功表達。以雜交瘤上清作為一抗，通過 Western blot 鑒定單抗針對的B細胞抗原表位。

1.8 單克隆抗體小鼠抗炎效果測定

1.8.1 小鼠試驗1

根據文獻［20-22］報道的方法，將小鼠隨機分為空白組、LPS對照組、地塞米松組、單抗處理組（1E2、2H3、5H3、7E7），共7組，5只·組-1。地塞米松組和單抗處理組分別腹腔注射地塞米松（15 mg·kg-1）、單抗腹水原液200 μL，LPS對照組和空白組腹腔注射生理鹽水200 μL。各組處理1 h后，除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射LPS（15 mg·kg-1），觀察至第12小時，進行眼球采血分離血清，測定NO、TNF-α、IL-6及IL-1β含量，或于4 ℃冰箱保存備用。NO的濃度測定采用NO含量檢測試劑盒通過化學法檢測。TNF-α、IL-6及IL-1β的濃度采用 ELISA 試劑盒檢測，按說明書操作。

1.8.2 小鼠試驗2

按試驗1方法分組和處理，單抗處理組選擇抗炎作用最強及最弱的兩組，共5組，5只·組-1。各組處理后1 h后，除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射LPS（15 mg·kg-1），飼養觀察3、6、9、12、24和36 h，記錄小鼠臨床癥狀，參考相關文獻［23］，按照表2評分標準進行評分，計算各組臨床計分平均值，并統計分析。

2 結 果

2.1 IL-1β基因表達與重組蛋白的制備

采用PCR方法擴增豬IL-1β基因并克隆至pCold Ⅰ載體，經過雙酶切鑒定以及測序比對正確后，轉化至大腸桿菌，IPTG誘導表達，SDS-PAGE鑒定結果顯示，目的蛋白大小約18.4 ku，與預期大小一致（圖1A），包涵體純化濃縮后顯示單一條帶，說明純化效果較好（圖1B）。Western blot 結果顯示，重組IL-1β蛋白與 His抗體有良好的反應特性（圖1C），可用作免疫原。

2.2 IL-1β免疫小鼠血清ELISA抗體測定

將IL-1β重組蛋白免疫小鼠，3次免疫后，免疫的5只小鼠血清效價均達到了1∶10 000，選擇其中抗體效價最高的小鼠，進行加強免疫，用于下一步細胞融合。

2.3 單克隆抗體制備及其效價測定

通過間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞并進行亞克隆，最終獲得4株穩定分泌豬IL-1β抗體的雜交瘤細胞，分別命名為1E2、2H3、5H3和7E7。將雜交瘤細胞連續傳代至20代，每隔5代取細胞上清檢測抗體效價，結果顯示，效價基本穩定。用4株雜交瘤細胞分別制備小鼠腹水并測定其效價，4株單抗制備的腹水ELISA效價為1∶（1.024～2.048）×106。

2.4 單克隆抗體亞型鑒定

ELISA結果顯示，1E2、2H3、7E7單抗重鏈屬于IgG1亞類，5H3單抗重鏈屬于IgG2b亞類，4株單抗輕鏈類型均屬于Kappa型。

2.5 單克隆抗體 Western blot 特異性鑒定

Western blot結果見圖2，4株單克隆抗體均能與轉染pCAGGS-IL-1β質粒的HEK 293T細胞樣品發生特異性反應，而不與未轉染pCAGGS-IL-1β質粒的HEK 293T細胞樣品反應。

2.6 單克隆抗體表位鑒定

SDS-PAGE檢測IL-1β 12個截短體蛋白，圖3（A）顯示其大小與理論相符。用GST抗體進行Western blot 鑒定，圖3（B）顯示重組蛋白正確表達。

取IL-1β截短體蛋白，以4株IL-1β單克隆抗體進行Western blot 鑒定，結果如圖4所示。5H3單抗所識別的抗原表位為149～158 aa，其氨基酸序列為149DLKREVVFCM158；1E2、2H3和7E7單抗所識別的抗原表位為202～208 aa，其氨基酸序列為202KRYPKRD208。抗原表位所在的豬和小鼠IL-1β對應的氨基酸序列比對結果如圖5所示。

2.7 IL-1β單抗抗炎效果測定

2.7.1 小鼠血清炎癥因子測定結果

LPS注射后12h，各組小鼠眼球采血，測定血清炎癥因子含量，結果表明：LPS對照組NO、TNF-α、IL-6和IL-1β均明顯高于空白組（Plt;0.05）。地塞米松組NO、TNF-α、IL-6和IL-1β均明顯低于LPS對照組 （Plt;0.05）。4株IL-1β單抗組結果顯示，1E2單抗處理組NO、TNF-α、IL-6和IL-1β明顯低于LPS組（Plt;0.05），與地塞米松組相似；5H3和7E7單抗處理組TNF-α、IL-6和IL-1β明顯低于LPS組（Plt;0.05），與地塞米松組相似（Pgt;0.05）（圖6），試驗結果表明4株單抗均有抗炎效果，1E2單抗抗炎效果最好，相比之下2H3單抗抗炎效果最弱。

2.7.2 小鼠臨床觀察和臨床計分

為了進一步明確IL-1β單抗治療炎癥效果，選擇上述拮抗小鼠血清炎癥因子效果最強和最弱的兩個單抗1E2和2H3進行小鼠試驗，LPS刺激后觀察3、6、9、12、24和36 h，記錄各組小鼠臨床癥狀并計分，結果見表3。LPS對照組小鼠，在LPS刺激后6～36 h，眼結膜發炎，活動能力逐漸減弱，48h后共死亡2只小鼠。地塞米松組、1E2、2H3單抗處理組小鼠，在LPS刺激后6～12 h眼結膜發炎，活動能力逐漸減弱，12h后逐漸恢復，48h后基本恢復正常狀態。各時間點地塞米松組、1E2和2H3單抗組的臨床計分值顯著低于LPS對照組（Plt;0.05），表明1E2、2H3兩株單抗均有抗炎作用，且1E2單抗作用更強。

3 討 論

IL-1β和IL-18是炎性小體介導的活化后由caspase-1加工的重要炎性細胞因子［24］。IL-1β產生過量會導致自身免疫性并引起自身炎性疾病［25］。IL-1可介導炎癥病理作用，阻斷IL-1活性藥物治療可快速減輕有些疾病嚴重程度，如心力衰竭［26］和急性痛風性關節炎［27］。目前，3種IL-1阻滯劑已被批準，分別為阿那白滯素、利洛那西普和卡那單抗［25］。本研究通過大腸桿菌表達豬IL-1β蛋白，并進行純化，制備重組蛋白。采用細胞雜交瘤技術制備了4株IL-1β單克隆抗體（1E2、2H3、5H3及7E7），小鼠炎癥模型試驗證明其具有較強的抗炎作用，為IL-1β單抗藥物研究奠定了重要基礎。

傳統的單克隆抗體具有完整的抗體結構，具有結合抗原和內源性免疫受體的固有能力［10，28］。該類生物治療劑需要具備高穩定性、特異性和適應性等特點［29］。本研究制備的4株IL-1β單克隆抗體（1E2、2H3、5H3及7E7），其中1E2、5H3及7E7單抗腹水ELISA效價高達1∶2 048 000，2H3單抗腹水ELISA效價1∶1 024 000。小鼠抗炎試驗結果顯示，1E2、5H3及7E7抗炎效果優于2H3。該結果表明IL-1β單抗抗炎活性可能與其抗體效價有關，單抗親和力有待進一步測定。

豬和小鼠的IL-1β基因核苷酸序列相似性為74.5%，推導的氨基酸序列相似性性為65.4%。本研究單抗識別的B細胞抗原表位結果顯示，5H3單抗所識別的抗原表位為149～158 aa，其氨基酸序列為149DLKREVVFCM158；1E2、2H3和7E7單抗所識別的抗原表位為202～208 aa，其氨基酸序列為202KRYPKRD208。這兩個抗原表位在豬和小鼠的IL-1β對應的氨基酸序列存在一些差異，而IL-1β單抗小鼠炎癥模型試驗證明其具有抗炎活性，提示單抗識別的抗原表位中關鍵氨基酸功能位點有待進一步研究。本研究選擇地塞米松作為抗炎治療試驗陽性對照，研究結果與文獻報道一致。

小鼠單抗藥物進入人體會引發免疫反應，導致其被加速清除［30-31］。因此，治療性抗體一般需要將小鼠抗體的氨基酸序列進行基因工程人源化改造，形成嵌合抗體。本研究通過小鼠試驗證明IL-1β單抗1E2具有顯著抗炎作用。小鼠單抗腹水原液含有白蛋白、血清白蛋白、脂類蛋白等成分，但單抗效價比較高，腹腔注射劑量僅200 μL·只-1，小鼠注射后沒有異常臨床表現。當然，為了避免其它因素干擾，選用純化單抗進行治療試驗更佳。目前，生豬疾病較多，炎癥病理反應比較普遍，后續研究可通過IL-1β單抗基因測序，采用基因工程技術構建小鼠-豬嵌合抗體，延長抗體的半衰期并且降低其免疫原性，可為豬病臨床治療提供新的抗體治療制劑奠定基礎。

4 結 論

本研究研制4株豬IL-1β單克隆抗體，鑒定出2個IL-1β蛋白抗原表位，分別位于149DLKREVVFCM158和202KRYPKRD208。通過小鼠試驗證明IL-1β單抗1E2具有顯著抗炎作用，與地塞米松組相似，可用于豬IL-1β阻斷藥物的進一步研究。

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（編輯 白永平）