豬流行性腹瀉病毒感染對小腸杯狀細胞的影響及其機制的初步分析

摘 要：

本研究旨在探明豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）對仔豬腸道黏液分泌的影響并揭示其潛在的分子機制。構建仔豬PEDV感染模型，通過阿利新藍-過碘酸-雪夫（Alcian blue-periodic acid-Schiff，AB-PAS）染色和免疫熒光染色，揭示病毒感染對仔豬腸道杯狀細胞數量和功能的影響。進一步利用腸道干細胞構建杯狀細胞的體外實驗模型，探明PEDV在該細胞模型的復制特點后，初步解析PEDV感染對杯狀細胞黏液蛋白轉錄及其分泌調控相關信號通路的影響。體內試驗結果顯示，PEDV主要感染仔豬的空腸和回腸，其對空腸具有更高的易感性，并能顯著抑制腸道黏膜中杯狀細胞的數量和分泌功能。進一步利用腸道干細胞建立了杯狀細胞體外培養模型，發現病毒感染顯著降低了杯狀細胞Muc2、TFF3和SPDEF基因的轉錄水平，同時，黏液分泌調控的關鍵通路MAPK信號通路的活性也受到了明顯抑制。PEDV感染會導致仔豬腸道杯狀細胞數量減少，黏蛋白分泌水平降低。病毒對MAPK信號途徑的抑制可能是導致這一現象的關鍵原因。

關鍵詞：

PEDV；杯狀細胞；MAPK信號通路

中圖分類號：S858.285.3

文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0900-12

收稿日期：2024-03-20

基金項目：國家重點研發計劃項目（2022YFD1800805-02）

作者簡介：劉芮伶（1998-），女，四川攀枝花人，碩士，主要從事仔豬黏膜免疫研究，E-mail：lrl33316407@163.com

*通信作者：楊 倩，主要從事動物黏膜免疫、上皮細胞與病原微生物相互作用研究，E-mail： zxbyq@njau.edu.cn

Preliminary Study on the Mechanism of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Infection Affecting Small Intestinal Goblet Cells

LIU" Ruiling， LI" Yuchen， TANG" Rongfeng， YANG" Qian*

（Animal Mucosal Immunology Laboratory， College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，" China）

Abstract：

The purpose of this study was to find out the specific effects of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） on intestinal goblet cells in piglets， and to reveal its potential mechanism. The model of PEDV infection in piglets was established， and the specific effects of virus infection on the number of goblet cells and mucus secretion in piglets′ intestines were revealed by using Alcian blue-periodic acid-Schiff （AB-PAS） staining and immunofluorescence staining. In order to verify the results of in vivo experiments， an in vitro experimental model of goblet cells was further constructed by using intestinal stem cells. In this model， firstly， the replication characteristics of PEDV are explored. Then， the effects of PEDV infection on transcription of functional genes （Muc2， TFF3， SPDEF） in goblet cells were studied. Finally， the influence of virus infection on the core regulatory pathway （MAPK signaling pathway） in the biological process of goblet cells was detected. Through the observation of tissue sections， it was found that PEDV mainly infected the jejunum and ileum of piglets， and jejunum was more susceptible to virus. Infection leads to severe atrophy of intestinal villi， significant decrease of goblet cells and serious loss of mucin. In addition， the in vitro culture model of goblet cells was successfully established， and the replication characteristics of PEDV in this model were revealed. Further research based on this in vitro infection model showed that PEDV infection significantly reduced the transcription level of Muc2， TFF3 and SPDEF genes in goblet cells， and at the same time， the activity of MAPK signaling pathway was also inhibited. PEDV infection can lead to the decrease of goblet cells and mucin secretion level in piglets. The inhibition of MAPK signaling pathway by virus may be the key reason for this phenomenon.

Key words：

PEDV; Goblet cell; MAPK signaling pathway

*Corresponding author：" YANG Qian， E-mail： zxbyq@njau.edu.cn

近年來，冠狀病毒的頻繁暴發對人類及動物健康造成了巨大威脅。其中，豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV），作為一種臨床上危害尤為嚴重的豬腸道冠狀病毒，已在全球范圍內對生豬養殖業造成了巨大經濟損失［1-2］。作為一種腸道病毒，PEDV主要侵害新生仔豬的腸上皮細胞［3］。因此，當前研究多聚焦于其對腸上皮細胞的調控作用，如揭示病毒感染的關鍵受體及抑制干擾素反應機制等［4-5］。然而，病毒在接觸腸上皮細胞之前，首先接觸的是覆蓋于腸上皮細胞表面的黏液層。傳統觀念認為，黏液層主要發揮潤滑食物的作用，但近年的研究揭示，這一黏液層實際上富含多種具有直接抗病毒活性的免疫物質［6］。因此，突破黏液屏障是建立病毒感染的必需步驟［7］。已有研究表明，PEDV感染會導致腸道黏液分泌顯著降低［6，8-16］，但其中的具體機制，仍有待進一步探究。

黏液屏障的形成主要依賴于杯狀細胞，這些細胞在抵御病原微生物入侵時發揮著至關重要的作用［17-19］。眾多研究表明，病毒能夠通過調控杯狀細胞來削弱黏液屏障，進而建立腸道感染。例如，輪狀病毒通過改變杯狀細胞數量來破壞腸道黏液屏障，為病毒感染創造有利條件［20］；而星狀病毒則通過干擾杯狀細胞分泌黏液的功能，改變腸道黏液層的防御能力，從而促使病毒感染的發生［21］。鑒于以上研究背景，本研究旨在明確PEDV對腸道杯狀細胞數量及黏液分泌能力的影響。通過建立體外杯狀細胞培養模型，探究PEDV感染特征及病毒對黏液分泌和杯狀細胞分化通路的影響，以期為開發針對杯狀細胞保護和恢復的新PEDV防御策略提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗所用3和7日齡健康三元雜交豬（杜洛克×長白×大白），均由江蘇省南京市高淳養豬場提供。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器：超凈工作臺、熒光定量PCR儀LC480、激光共聚焦熒光顯微鏡Zeiss LSM980。

主要試劑：胎牛血清、DMEM/F12（Gibco公司）、反轉錄試劑盒（諾唯贊公司）、AB-PAS染色試劑盒（賽維爾公司）、Muc2抗體（Abbexa公司）、UEA-1染料（Sigma公司）、PEDV抗體（Medgene公司）、594標記山羊抗兔IgG、488標記山羊抗鼠IgG（翌圣生物公司）。

1.3 毒株

PEDV野生型毒株Zhejiang 08為本實驗室留存。

1.4 動物分組與樣品采集

挑選6頭健康3日齡仔豬， 自由飲水、采食， 常規飼養管理。對照組（3頭）口服3 mL PBS，PEDV組（3頭）口服3 mL PEDV活病毒（105 PFU·mL-1）。攻毒3 d后，PEDV仔豬出現腹瀉癥狀。將所有仔豬安樂死，采集仔豬十二指腸、空腸和回腸樣品，制備組織切片。

1.5 AB-PAS染色觀察腸道組織杯狀細胞分布情況

將組織切片浸入二甲苯中，進行脫蠟處理，隨后使用梯度酒精（如100%、95%、85%、75%）進行水化。使用阿利新藍染色液（pH 2.5）染色10～20 min，自來水沖洗5 min，蒸餾水洗1 min，然后用過碘酸溶液染色10 min，自來水沖洗1 min，蒸餾水洗1 min，隨后用Schiff試劑室溫避光染色5～15 min，自來水沖洗5 min，蒸餾水洗1 min。使用蘇木素復染細胞核，最后乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.6 免疫熒光染色觀察PEDV感染對杯狀細胞黏蛋白分泌的影響

參照AB-PAS染色步驟進行水化。隨后，使用0.01 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）進行抗原修復。5%BSA封閉，TritonX-100 通透20 min，隨后一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育2 h，DAPI核色染15 min，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。一抗使用PEDV-N多克隆抗體（1∶200）時，二抗使用 488標記山羊抗鼠IgG（H+L）（1∶200）；一抗使用 Muc 2多克隆抗體（1∶200）時，二抗使用 594標記山羊抗兔IgG（H+L）。

1.7 通過腸道干細胞建立杯狀細胞體外培養模型

參考Wang等［22］的方法，建立腸道干細胞氣液界面培養模型。采集7日齡健康三元仔豬（PEDV陰性）小腸組織，剪成3 cm小段后使用PBS漂洗，隨后置于含有EDTA的PBS在4 ℃中震蕩消化1 h。隨后，使用70 μm的無菌濾膜過濾去除消化液中大體積的組織，并通過離心收集隱窩干細胞。將收集的干細胞用細胞外基質Matrigel重懸（含有EGF、Noggin、R-spondin和Rock抑制劑），37 ℃靜置至Matrigel凝固后，加入DMEM/F12培養基（含青鏈霉素、B27補充物、N2補充物等），等待其分化為具有絨毛和隱窩結構的腸類器官（Enteroids）模型。培養5 d后將豬小腸類器官消化為單細胞懸液，鋪設于Transwell小室，待其形成單層細胞后，棄去上室液體構建氣液培養模型。該氣液培養模型培養7 d，其中杯狀細胞的陽性率達到70%，可作為杯狀細胞體外模型用于后續研究。細胞在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中進行培養。

1.8 PEDV感染體外培養的杯狀細胞模型

待杯狀細胞分化完成，用 PBS清洗， 在Transwell小室上室添加PEDV病毒液感染細胞4 h（MOI=1）， 隨后棄去上清液， 在小室下室添加含有5 μg·mL-1胰酶的DMEM/F12空白培養基繼續培養。于0、2、4、6、12和24 h分別收集細胞的RNA樣品，檢測PEDV在細胞中的生長復制情況。

1.9 RT-qPCR檢測目的基因轉錄水平

接毒后按照試驗設計時間使用TRIzol法分別提取各孔細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以β-actin為內參基因，采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測PEDV N、Muc2、SPDEF、TFF3、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAP2K1基因mRNA表達量，試驗結果采用2-ΔΔCt法計算，分析各組轉錄因子mRNA的水平變化。RT-qPCR反應體系：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.2 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL，2×GS AntiQ qPCR SYBR Master Mix 5 μL，ddH2O 3.4 μL，總反應體積為10 μL。反應程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環；熔解曲線程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃15 s。RT-qPCR引物序列見表1。

1.10 Western blot檢測MAPK信號通路激活情況

將細胞表面上清吸出后用空白 DMEM 培養基清洗三遍，加入 200 μL 含有 1% PMSF 的 RIPA 強裂解液，將細胞培養板置于冰上靜置 15 min 使細胞總蛋白完全釋放。將裂解的細胞蛋白液轉移至 1.5 mL 的無酶離心管中，12 000 r·min-1離心 15 min 后收集蛋白上清。用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度后統一蛋白上樣量。按比例加入 5×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸 15 min 使蛋白完全變性后進行 SDS-PAGE 凝膠電泳（60 V）。電泳完成后使用 eBlotTM L1 快速濕轉儀將蛋白轉印至 PVDF 膜（提前用甲醇活化），然后將轉印好的 PVDF 膜浸入 5%脫脂乳中室溫封閉2 h。隨后一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育2 h，使用 ECL 發光液顯色并拍攝照片。一抗使用 ERK多克隆抗體（1∶1 000）和p-ERK多克隆抗體（1∶2 000），二抗使用 HRP山羊抗兔IgG（1∶8 000），內參使用 Anti-β-actin-HRP 抗體（1∶5 000）。

1.11 數據處理與統計分析

結果數據以“平均值±標準差（x-±s）”表示，用GraphPad prism 8軟件對數據進行雙因素方差分析和差異顯著性檢驗（Plt;0.05）。

2 結 果

2.1 PEDV感染導致腸道杯狀細胞數量減少

收集口服感染PEDV 72 h后的仔豬的十二指腸、空腸和回腸腸段，進行AB-PAS和免疫熒光染色觀察腸道杯狀細胞數量和病毒感染情況。觀察結果顯示，對照組腸絨毛正常，杯狀細胞分布均勻。而PEDV組腸絨毛萎縮，杯狀細胞數量顯著減少，該現象在PEDV陽性細胞更多的空腸部位最為明顯（圖1）。鑒于PEDV陽性細胞的分布情況與腸道的損傷情況一致，表明PEDV感染是導致腸道損傷和杯狀數量減少的主要原因。

2.2 PEDV感染導致腸道杯狀細胞黏蛋白分泌功能受損

本研究使用Muc2（杯狀細胞特征性黏蛋白）抗體進行免疫熒光染色，深入探究PEDV感染對杯狀細胞黏蛋白分泌功能的具體影響［18，23］。結果顯示，對照組杯狀細胞黏蛋白充盈，細胞分泌功能正常。而PEDV組杯狀細胞黏蛋白著色減少，細胞分泌功能受損，并且可以觀察到PEDV和Muc2定位于同一細胞的現象，說明PEDV可以感染腸道杯狀細胞（圖2）。進一步觀察發現，在PEDV易感性更高的空腸部位，杯狀細胞黏蛋白減少最明顯，表明PEDV可以通過感染杯狀細胞嚴重損害其黏蛋白分泌功能。

2.3 杯狀細胞體外培養模型的建立

本研究參照Wang等［22］的方法，建立豬小腸杯狀細胞的體外培養模型（圖3A）。光學顯微鏡觀察發現，杯狀細胞緊密排列。PAS結果顯示，培養模型中大部分細胞為杯狀細胞，占比超過70%（圖3B）。進一步通過免疫熒光染色發現，培養至第7天時，杯狀細胞培養模型的游離端（上室）存在明顯的黏液（圖3C），表明該體外培養能夠維持其分泌黏液的能力。RT-qPCR檢測結果顯示，Muc2、TFF3和SPDEF等基因的轉錄水平在培養過程中均顯著升高（圖3D），表明該體外培養模型支持杯狀細胞的正常功能表達，為后續研究提供了試驗基礎。

2.4 PEDV感染導致杯狀細胞黏蛋白轉錄水平下降

在體外構建杯狀細胞的PEDV接毒模型，并測定病毒在杯狀細胞中的復制曲線。結果表明，PEDV成功感染杯狀細胞并有效復制。病毒感染后的2～6 h為潛伏期，此階段病毒拷貝數保持穩定，主要進行病毒粒子的裝配工作；6～12 h進入裂解期，與2 hpi相比，病毒拷貝數激增了23倍，表明病毒粒子在此階段實現了增殖；12～24 h進入穩定期，此時PEDV拷貝數維持在較高的水平，保持病毒增殖的高峰狀態（圖4A和E）。進一步通過RT-qPCR技術檢測杯狀細胞黏蛋白相關基因表的達情況。結果顯示，從PEDV感染的潛伏期開始，杯狀細胞中Muc2（杯狀細胞黏液骨架蛋白［23-24］）和TFF3（杯狀細胞黏液保護分子［25-26］）的轉錄水平即呈現出明顯的下降趨勢，并且這種轉錄抑制現象一直延續至感染平穩期（圖4B和C）。免疫熒光染色結果進一步佐證了Muc2的含量下降，表明PEDV感染嚴重損傷杯狀細胞的分泌功能（圖4E）。進一步檢測發現，黏蛋白上游基因SPDEF（杯狀細胞黏蛋白核心轉錄因子［27］）的轉錄水平同樣出現了顯著降低。這一發現提示，PEDV感染可能通過抑制黏蛋白轉錄因子SPDEF的表達，進而降低黏蛋白表達（圖4D）。

2.5 PEDV感染抑制MAPK信號通路

MAPK信號通路在杯狀細胞的生物學過程中扮演著重要角色，既可以通過調控杯狀細胞的分化來影響其數量［28］，還可以通過調控杯狀細胞黏蛋白基因的轉錄來影響其黏液分泌功能［29］。為探究PEDV感染是否通過調控該通路影響杯狀細胞，收集了不同感染期的杯狀細胞RNA，并通過RT-qPCR和Western blot檢測MAPK通路激活情況。試驗結果表明，PEDV感染的潛伏期至平穩期，MAPK信號通路的關鍵基因（MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAP2K1）轉錄水平持續降低，ERK1/2磷酸化水平也下降（圖5）。這種抑制趨勢與黏蛋白基因轉錄下調的時間高度吻合，表明PEDV感染可能通過抑制MAPK信號通路的活性，從而損害杯狀細胞的數量和黏液分泌功能。

3 討 論

腸道杯狀細胞主要通過分泌黏蛋白，構建起腸絨毛的保護屏障，為腸道抵御外界病原體提供了重要的防線［30］。近年來的研究顯示，杯狀細胞的數量與腸道對病原體的防護效果密切相關［31］，而其黏液分泌功能更是直接影響病原體的清除［32］。因此，當病原體入侵時，杯狀細胞會做出積極響應，通過增加數量［33］和迅速分泌大量黏液來抵御感染［7，34］。本研究觀察到，口服感染PEDV的仔豬腸道中，杯狀細胞的數量顯著減少，且黏液分泌功能幾乎喪失。這種數量和功能的雙重打擊使得腸道對外部病原體的抵抗能力大幅下降，為PEDV的進一步感染和復制創造了有利條件。此外，這種變化還可能增加腸道對其他病原體的易感性，進而提高了繼發感染的風險。值得注意的是，本研究還發現腸道杯狀細胞數量的減少與空腸絨毛萎縮的嚴重程度正相關，這進一步證實了杯狀細胞數量可以作為評估PEDV感染腸道病理學的一個重要指標。采用免疫熒光染色技術觀察到PEDV與Muc2存在共定位現象，這再次證實了PEDV能夠入侵杯狀細胞，與前人的研究結果一致［35］ ，病毒可能通過感染杯狀細胞進而影響黏液分泌功能。

為了進一步探究PEDV調控杯狀細胞黏液分泌的機制，參考Wang等［22］的方法，構建了基于腸道干細胞的體外杯狀細胞培養模型。在該模型中，杯狀細胞占比高達70%，并且PEDV的復制模式與經典的IPEC-J2細胞接毒模型相似［36］，具有典型的病毒生命周期，包括潛伏期（2～6 h）、裂解期（6～12 h）和穩定期（12～24 h）。因此，該模型可以用于研究病毒感染對杯狀細胞的影響。與傳統細胞系相比，本研究構建的模型保持了仔豬的遺傳信息和生理特點，更能真實地反映病毒感染對杯狀細胞的影響［9，37］。

利用上述模型發現，PEDV感染能夠顯著抑制杯狀細胞中黏蛋白相關基因（Muc2和TFF3）以及黏蛋白上游轉錄因子（SPDEF）的轉錄水平，這與本研究在體內試驗中觀察到的現象一致。這一結果證實了PEDV感染對杯狀細胞功能的損害，為了揭示損害機制，進一步檢測了相關的信號通路。杯狀細胞的生物學過程受多種信號通路的復合調控，其中MAPK信號通路處于核心地位。首先，MAPK信號通路可以影響杯狀細胞的分化過程，改變腸道杯狀細胞的數量［38］。其次，該信號通路還可以調節杯狀細胞的黏液分泌功能。MAPK信號通路通過調控啟動子的活性來影響黏蛋白（如Muc2）的轉錄效率，從而精細調控黏液的產生［39］，因此，該通路的激活可以顯著增強黏蛋白基因的表達水平［40］。同時，MAPK信號通路也間接通過SPDEF調控杯狀細胞免疫活性因子（如TFF3）的表達［41］，進一步調控杯狀細胞的功能。本研究發現，PEDV感染能夠顯著抑制MAPK信號通路活性，這可能是導致杯狀細胞數量減少和功能受損的重要原因。通過抑制這一通路，PEDV可能阻礙了杯狀細胞的補充機制，從而導致腸道中杯狀細胞的數量大幅下降，并且影響了黏蛋白相關基因的轉錄過程，導致杯狀細胞的黏液不能正常表達，進而損害杯狀細胞的黏液分泌功能。然而，影響杯狀細胞黏液分泌的因素還有很多，比如NLRP6炎癥小體［42］和EGFR-PI3K信號通路［43］。未來，還需要進一步探究PEDV感染導致杯狀細胞功能受損的其他潛在機制，以期更全面地揭示PEDV對腸道健康的影響及其機制。

綜上所述，本研究在探明PEDV感染對腸道杯狀細胞的嚴重損害后，通過建立體外杯狀細胞培養模型，進一步解析了其潛在機制。本研究不僅加深了對PEDV致病機制的理解，還為開發以杯狀細胞為中心的防御策略提供了理論基礎。未來，將繼續深入研究PEDV與杯狀細胞之間的相互作用，以期為防控PEDV感染提供新的思路和方法。

4 結 論

本研究指出PEDV感染會損傷仔豬腸道杯狀細胞，造成其數量減少并且降低其黏蛋白分泌水平。進一步通過構建體外杯狀細胞培養模型，明確了PEDV可以感染杯狀細胞并且會抑制其黏蛋白產生，同時也發現MAPK信號通路活性被抑制，初步探明病毒感染導致的MAPK信號活性的抑制是導致這一現象的關鍵原因。本研究結果表明PEDV感染對腸道黏液屏障的影響，為后續開發新的的防控策略提供了理論依據。

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（編輯 白永平）