基于DNA甲基化組學技術分析TET1基因對小鼠uNK細胞DNA甲基化的影響

摘 要：

本研究旨在探究去甲基化酶1（ten eleven translocation， TET 1）對小鼠子宮內自然殺傷細胞（uterine natural killer， uNK）DNA甲基化的影響，深入了解其分子調控機制。無菌采集妊娠10 d小鼠子宮蛻膜，分離純化uNK細胞進行培養，利用RNA干擾技術敲低TET 1基因的表達，提取TET 1干擾組和正常對照組細胞的總DNA，利用簡化基因組DNA甲基化測序（reduced representation bisulfite sequencing， RRBS）技術進行測序，測序結果經生物信息學軟件分析進行兩組樣本差異甲基化區域（differentially methylated region， DMR）的統計與注釋，并進一步對DMR相關基因進行GO數據庫分析及注釋，了解相關基因的功能，利用KEGG數據庫對其調控的信號通路進行富集分析。結果顯示，TET 1干擾組相較對照組共有14 120個DMRs，其中高甲基化的DMR有4 897個，低甲基化的DMR有9 223個，分布在基因體（genebody）上的DMR最多，共9 762個，占總數的69.14%。DMR廣泛分布于基因組的不同元件，且有些基因不同元件同時存在高甲基化和低甲基化的DMR。GO注釋結果顯示，存在DMR的基因主要集中在ATP結合、核酸結合、細胞組建、細胞分化、胚胎發育、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調控、細胞增殖負調控等方面。KEGG數據庫分析顯示，DMR主要在代謝通路呈現顯著富集，其中丙酮酸代謝通路共有12個參與代謝的關鍵分子出現了54個DMR，是出現DMR顯著富集的代謝通路，其中乙酰輔酶A合成酶（Acss）、乳酸脫氫酶B（Ldhb）和丙酮酸激酶（Pklr）的DMR呈現單一高甲基化狀態。此外，PI3K/AKT信號通路和HIF-1信號通路在介導丙酮酸代謝過程中發揮重要作用，且在基因體和啟動子上的DMR也出現顯著富集。綜上，TET 1對小鼠uNK細胞具有甲基化調控作用，丙酮酸代謝是其發揮調控作用的主要途徑，Acss、Ldhb和Pklr是其潛在的調控靶分子，PI3K/AKT和HIF-1是參與調控的重要信號通路。

關鍵詞：

TET 1基因；uNK細胞；甲基化組學；丙酮酸；小鼠

中圖分類號：

S857.2 """"文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0912-13

收稿日期：2024-04-07

基金項目：國家自然基金（32002356）；重慶市自然基金（cstc2019jcyj-msxmX0140）；重慶市科企聯合體種質資源收集利用與品種試驗項目（草食牲畜）

作者簡介：趙靜賢（2001-），女，新疆庫爾勒人，碩士生，主要從事動物免疫學研究，E-mail：1912790377@qq.com；楊曉偉（1980-），副教授，主要從事動物生殖免疫學研究，E-mail： yangxiaowei396@163.com。趙靜賢和楊曉偉為同等貢獻作者

*通信作者：趙光偉，主要從事動物疾病實驗室診斷研究，E-mail：stay612@163.com；趙永聚，主要從事草食牲畜遺傳改良等領域的教學和研究工作，E-mail：zyongju@163.com

Analysis of the Effect of TET 1 Gene on Methylation of Mouse uNK Cells based on

DNA Methylation Histology Technique

ZHAO" Jingxian1， YANG" Xiaowei1， 2， 3， LIU" Yanyan1， ZHAO" Ziliang1， 4， ZHAO" Guangwei1*， ZHAO" Yongju2， 3*

（1.College of Veterinary Medicine， Southwest University， Chongqing 402460，" China;

2.College of Animal Science and Technology， Southwest University， Chongqing 400715，" China;

3.Chongqing Key Laboratory of Herbivore Science， Chongqing 400715，" China;

4.National Pig Technology Innovation Center， Chongqing 402460，" China）

Abstract：

The purpose of this study was to investigate the effect of ten eleven translocation 1 （TET 1） on the methylation of the DNA of mouse uterine natural killer （uNK） cells， and to gain insight into its molecular regulatory mechanism. Mouse uterine metaphase was aseptically collected on the 10th day of gestation， and the uNK cells were isolated and purified for culture. The expression of TET 1 gene was knocked down by RNA interference technology. Then， total DNA from cells of the interference group and the normal control group were extracted， respectively. Sequencing was performed using reduced representation bisulfite sequencing （RRBS） method， and the results were analyzed by bioinformatics software for the statistics and annotation of differentially methylated region （DMR） in the two group samples， and further analyzed by the GO database for DMR-related genes to understand their functions. Also， the sequencing results were analyzed for the differentially methylated region （DMR） annotation， and the enriched signaling pathways in which regulated by the KEGG database. The results showed that there were 14 120 DMRs in the TET 1 interference group when compared with the control group， of which 4 897 were hypermethylated DMRs and 9 223 were hypomethylated DMRs. The largest number of DMRs were distributed in the genebody， with a total of 9 762 DMRs， accounting for 69.14% of the total number of DMRs. DMRs were widely distributed in the different elements of the genome， and some genes had DMRs with both hypermethylated and hypomethylated in different elements. GO annotation results showed that the DMRs were mainly concentrated in ATP binding， nucleic acid binding， cell formation， cell differentiation， embryonic development， RNA polymerase II transcriptional regulation and negative regulation of cell proliferation， etc. KEGG database analysis results revealed that the DMRs were significantly enriched in the metabolic pathways， with a total of 12 key molecules involved in metabolism in the pyruvate metabolic pathway， and 54 DMRs appeared， which was the most significant enrichment of DMRs in the metabolic pathway. Among the 12 key molecules， acetyl-coA synthetase （Acss）， lactate dehydrogenase B （Ldhb）， and pyruvate kinase L/R （Pklr） exhibited a single hypermethylated status. In addition， significant enrichment of DMRs were also found in the PI3K/AKT signaling pathway and HIF-1 signaling pathway， indicating that DMRs play important roles in mediating pyruvate metabolism. Thus， TET 1 has a methylation regulatory effect mouse uNK cells， and pyruvate metabolism is the main pathway for its regulatory effect. What’s more， Acss， Ldhb and Pklr are potential regulatory target molecules， while PI3K/AKT and HIF-1 are important signaling pathways which involved in regulation.

Key words：

TET 1; uNK cell; methylomics; pyruvate; mouse

*Corresponding authors：" ZHAO Guangwei， E-mail： stay612@163.com; ZHAO Yongju， E-mail： zyongju@163.com

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要分支，在醫學、生命科學和畜牧業等眾多領域被廣泛研究和應用［1］，大量研究顯示其在卵巢卵泡發育［2］、雄性不育［3］、動物胚胎發育［4］等眾多方面發揮著重要的作用，其過程主要是在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase， DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine， SAM）作為甲基供體在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子進行甲基化完成［5-6］，胞嘧啶的甲基化是一個動態可逆過程，去甲基化酶（ten eleven translocation，TET）能夠通過氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）使其變成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），實現DNA去甲基化作用［7］。研究發現TET家族包含 TET 1、TET 2和TET 3三個成員［8］，其中TET 1在調控哺乳動物胚胎發育過程中發揮著重要作用，Yamaguchi等［9］發現TET 1缺乏會顯著降低卵母細胞數量，影響母鼠的生育能力。此后，Xu等［10］在探索豬卵母細胞體外成熟機制方面進行了更深入的研究，推測TET家族對豬卵母細胞排出第一極體的過程具有正向調控作用。Yamaguchi等［11］、Khoueiry等［12］相繼發現TET 1的敲除或缺失將會導致小鼠胚胎發育不良，甚至死亡。此外，TET 1也是調控免疫細胞活性的一種重要的表觀遺傳修飾分子。Peng等［13］通過鑒定小鼠先天免疫細胞（innate lymphoid cell， ILC）和NK細胞亞群之間的差異甲基化和羥甲基化DNA區域，發現TET家族參與調控ILC并發揮積極作用。Yang等［14］發現，硫化氫促進TET 1和TET 2的表達以介導TGF-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）和IL-2（interleukin-2， IL-2）信號下游的Foxp3（forkhead box protein P3， Foxp3）去甲基化，進而促進調節性T細胞的功能和維持免疫穩態。此外，Orlanski等［15］發現敲除發育早期階段B細胞上的TET蛋白后，導致早期B細胞去甲基化缺乏，進而影響附近B細胞的基因表達，造成B細胞分化和功能缺陷。說明TET 1在調控妊娠、胎兒發育及免疫細胞活性等生命活動中具有重要的調控作用。

哺乳動物子宮內自然殺傷細胞（uterine natural killer， uNK）是妊娠期在子宮內膜短暫存在的一類NK細胞亞群，是妊娠早期胎盤蛻膜中數量最多的免疫細胞［16］，其增殖分化對于維持正常妊娠和胎兒發育具有重要意義［17］。現有的研究表明uNK細胞異常增殖與復發性流產、復發性植入失敗、散發性流產和胎兒生長受限等疾病密切相關［18］，例如當uNK細胞數目異常升高時會表達細胞毒性受體，對細胞具有殺傷作用從而導致自然流產；反之，當uNK細胞比例顯著下降時，其分泌的IFN-γ減少，對Th17細胞的極化抑制作用下降，導致大量促炎因子（如IL-1β和IL-6）表達增加，引起子宮局部炎癥反應，最終導致胎兒定植失敗［19-20］。因此，uNK細胞對于維持正常妊娠過程發揮了巨大的作用，然而該細胞的調控機制尚不明確，前期研究發現通過下調uNK細胞中TET 1基因的表達量，能夠影響其關鍵細胞因子（IFN-γ、VEGF-C 和TGF-β1）的轉錄［21］，因而TET 1對uNK細胞具有調控作用。鑒于此，本試驗擬采用簡化基因組DNA甲基化測序（reduced representation bisulfite sequencing， RRBS）技術，檢測TET 1對小鼠uNK細胞DNA甲基化的影響，深入了解其調控機制，為動物繁殖障礙性疾病的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器及實驗動物

磁珠法通用型基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司（貨號DP705）；Acegen Rapid RRBS Library Prep Kit購自深圳艾斯基因科技有限公司（貨號AG0422）；ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit購自美國Zymo Research公司（貨號D5008）；Agilent DNA 1000 Kit購自美國Agilent科技有限公司（貨號5067-1504）；QubitTM dsDNA HS Assay Kit購自美國Invitrogen生命技術有限公司（貨號Q32854）；NovaSeq Reagent Kit購自美國Illumina公司（貨號PE150）。

ABI 9700/2720 PCR儀、ABI Qpcr儀（美國，ABI公司）；Agilent 2100 生物分析儀（美國，Agilent公司）；Labchip GX 生物大分子分析儀（美國，PerkinElmer公司）；高通量二代測序儀（美國，Illumina公司）。

成年雌、雄昆明小鼠（10～12周齡，體重25 g左右）購自西南醫科大學實驗動物中心，正常飼喂于西南大學SPF實驗動物房。

1.2 小鼠uNK細胞的分離與培養

參考文獻［21］方法，無菌采集妊娠10 d左右小鼠子宮蛻膜，利用剪刀和0.1%的膠原酶I將其處理成細胞團塊，使用紅細胞裂解液、淋巴細胞分離液分離出小鼠淋巴細胞，再以鏈霉親和素包被磁珠法，從淋巴細胞中分選出uNK細胞，培養基為含10％胎牛血清、5％青鏈霉素和10 ng·mL-1 IL-15的1640低糖培養基，置37℃、5% CO2培養箱中培養。

1.3 慢病毒滴度測定

采用本課題組前期構建成功的重組干擾質粒和慢病毒包裝質粒［21］，將慢病毒包裝的TET 1重組干擾質粒梯度稀釋后轉染至處于對數生長期的293T細胞，待細胞密度高于80%時，抽提各稀釋度細胞的RNA，利用RT-qPCR技術比較對照組標準曲線和試驗組的Ct值差異計算滴度，其公式為滴度（TU/Ml）=［平均每基因組慢病毒整合拷貝數×感染時細胞的數目×病毒的稀釋倍數×1 000］/ 加入稀釋病毒的體積數。其中，目的基因WPRE和內參基因GADPH的檢測引物序列見表1。

1.4 小鼠uNK細胞TET 1干擾模型的建立

取生長狀態良好的小鼠uNK細胞進行計數，按照1.5×106細胞接種6孔板，參考本課題組前期建立的方法以MOI為10～200的比值加入慢病毒［21］，轉染96 h后，收獲TET 1干擾的uNK細胞，共3個重復，記為TET 1干擾組；同時收獲正常培養的uNK細胞，共3個重復，記為對照組；6組細胞樣本各取100μL提取RNA，用于RT-qPCR技術檢測目的基因TET 1的表達情況，其中，目的基因TET 1和內參基因β-actin的檢測引物序列見表1。剩余所有樣本用于基因組DNA甲基化組測定。

1.5 細胞樣本DNA提取與檢測

按照磁珠法（通用型）基因組DNA提取試劑盒說明書分別提取6組細胞樣本基因組總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳對樣品進行質檢，結果提示基因組DNA主帶清晰，沒有明顯降解。利用Nanodrop超微量分光光度計和Qubit 2.0熒光儀進行DNA純度檢測和濃度的測定，保證樣本的OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0，且含量在1.5 μg以上，DNA樣品低溫送至北京奧維森基因科技有限公司用于后續建庫測序。

1.6 RRBS文庫制備及測序

按照Acegen Rapid RRBS Library Prep Kit試劑盒說明書，使用限制性核酸內切酶Msp I將上述質檢合格的基因組總DNA切割為100～350 bp的片段，對純化后產物使用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit 試劑盒進行亞硫酸鹽轉化，對回收產物使用PCR擴增完成文庫構建。

PCR產物經過1X AMPure XP純化，使用Qubit 2.0熒光儀定量檢測，將文庫稀釋到1 ng·μL-1，文庫中插入片段長度通過Agilent 2100進行檢測，再通過qPCR方法準確定量文庫有效濃度（文庫有效濃度gt;2 nmol·L-1），確保文庫的質量。

質量合格的DNA文庫使用Illumina Novaseq 6000上機測序，選用邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis）的雙端150 bp測序（PE150）作為測序策略。

1.7 數據生物信息分析

獲得原始測序序列（Sequenced Reads）后，通過FastQCv_0.11.9工具進行原始序列質量統計，通過Trimmomaticv_0.39軟件降低低質量和測序接頭數據，通過BSMAPv_0.22.3軟件將優化后的測序數據與參比基因組進行對比，收集比對的統計信息，主要包括C位點的測序深度、覆蓋度，Msp I的酶切效率和CpG位點覆蓋。其中，參考基因組的版本為mm10（GCF_000001635.24，注釋：22 June 2016）。

1.8 差異甲基化區域識別與結果注釋

通過二元分隔算法結合雙重統計學檢驗，利用Metilenev_0.2.8軟件對兩組樣本的差異甲基化區域（differentially methylated regions， DMR）進行分析，分別使用CG、CHG和CHH位點尋找DMRs，并對其進行區域注釋，對鑒定的DMR平均甲基化水平進行聚類熱圖繪制，觀察甲基化水平在組合間差異情況。

1.9 DMR相關基因的GO注釋和KEGG通路富集分析

分別利用GO和KEGG數據庫，對DMR相關基因的功能進行注釋分析，同時對基因顯著富集的信號通路進行分析。

1.10 統計學分析及作圖軟件

采用SPSS 23.0統計學軟件進行統計分析，數據采用“均數±標準誤（x-±sX-）”表示，方差檢驗采用單因素ANOVA方差分析，以P＜0.05為顯著性判斷標準；采用Graphpad prim軟件繪制圖片。

2 結 果

2.1 慢病毒滴度測定

收獲經梯度稀釋慢病毒感染的293T細胞，利用RT-qPCR方法對目的基因WPRE和GADPH進行檢測，通過公式計算得出重組干擾質粒包被慢病毒的滴度為1.12 TU·mL-1。

2.2 小鼠uNK細胞TET 1基因表達

待小鼠uNK細胞轉染慢病毒96h后，收取TET 1干擾組和對照組共6個細胞樣本（每組3個重復）各100 μL，通過RT-qPCR的方法對目的基因TET 1和β-actin進行檢測，結果如圖1所示，TET 1干擾組各組TET 1基因mRNA轉錄水平顯著低于對照組，組內差異不顯著，表明小鼠uNK細胞TET 1干擾模型建立成功，且試驗重復性良好。

2.3 測序數據質控

對下機后每個樣本原始數據采用Trimming的方式截去測序接頭和低質量數據，進行原始數據質量的優化。結果顯示：去甲基化酶TET 1干擾組3個樣本優化后堿基數分別為4 946 708 853、4 916 698 452、5 007 778 090，質量指標Q20分別達到96.98%、97.09%和96.86%，Q30分別為89.51%、89.30%和88.54%，對照組3個樣本優化后堿基數分別為4 953 400 258、4 901 118 203和4 920 968 110，質量指標Q20分別達到96.99%、96.83%和96.97%，Q30分別為89.16%、90.28%和89.88%，6個樣品質量指標Q20均超過95%，

Q30均超過85%，表明優化后測試數據質量合格，如表2所示，可用于進一步分析。

2.4 C位點的測序深度、覆蓋度與MspI 酶切效率及覆蓋CpG 位點統計

對去甲基酶TET 1干擾組和對照組共6個樣本優化后的數據進行C位點的覆蓋度統計，干擾組uNK細胞樣本CG類型C位點數量分別為4 971 883、4 921 960和5 326 157，有效覆蓋深度分別為15.737 09、18.209 16和15.892 16，測序深度5×以上位點的覆蓋度分別為0.559 367、0.615 603和0.560 050，測序深度10×以上位點的覆蓋度分別為0.417 201、0.492 745和0.434 085，對照組uNK細胞樣本CG類型C位點數量分別為4 477 985、4 827 758和5 326 157，有效覆蓋深度分別為20.956 05、14.268 55和14.328 09，測序深度5×以上位點的覆蓋度分別為0.638 982、0.518 964和0.500 710，測序深度10×以上位點的覆蓋度分別為0.516 772、0.368 129和0.356 494。CHG和CHH類型C位點測序深度和覆蓋度結果，詳見表3。

2.5 差異甲基化區域（DMR）統計與注釋

利用Metilenev_0.2.8軟件分析TET 1干擾組和對照組樣本的差異甲基化區域（DMR），結果顯示：TET 1干擾組與對照組相比，共有14 120個DMR，其中4 897個DMR為高甲基差異區域，9 223個DMR為低甲基差異區域。其中9 762個DMR分布在基因體（genebody）上，占總數的69.14%，3 597個DMR分布在外顯子（exon）上，占總數的25.48%，分布在重復序列（repeat）、啟動子（promoter）、5′非翻譯區（5′-untranslated region， 5′UTR）、CpG島區（CpG island， cgi）、上游2k區（upstream 2k）、CpG島岸區（CpG shore， cgi-shore）、下游2k（downstream 2k） 區和3′非翻譯區（3′-untranslated region， 3′UTR）的數量占比分別為24.11%、12.39%、10.28%、8.57%、8.36%、6.28%、5.86%和3.09%（圖2A），兩組樣本基因甲基化水平聚類分析差異性結果如圖2B所示。

2.6 DMR相關基因功能分析

將得到DMR區域相關基因利用GO數據庫富集，進一步分析其基因主要功能，結果顯示細胞組件是基因體和啟動子DMR注釋數量最多的部分（圖3），其中膜、細胞質、核、細胞外泌體等是二者共同注釋細胞組件條目，此外部分基因體DMR注釋在細胞突起、細胞結、細胞骨架等條目（圖3A），而少量啟動子DMR注釋在內質網和黏著斑（圖3B）；分子功能部分的鋅離子結合、轉移酶活性、嗅覺受體活性、DNA結合、金屬離子結合以及蛋白質結合條目是基因體和啟動子DMR共同注釋條目，而ATP結合和核苷酸結合兩個條目僅部分基因體DMR注釋。

2.7 DMR相關基因通路富集及分析

將基因體和啟動子區域DMR分別進行KEGG通路富集，二者最為顯著的25條通路信息如圖4所示，可見基因體和啟動子上的DMR均在代謝通路中最為富集，且與細胞能量代謝相關的cGMP-PKG、cAMP、PI3K/AKT和HIF-1信號通路也出現顯著富集，說明能量代謝在TET 1調控小鼠uNK細胞甲基化過程中發揮著重要的作用。

進一步分析能量代謝途徑發現丙酮酸代謝途徑中差異DMR最為顯著，參與丙酮酸代謝途徑的關鍵分子中有12個分子的基因元件上出現54個DMR，其中13個為高甲基化DMR，41個為低甲基化DMR（表4）。13個高甲基化DMR分布在乙酰輔酶A合成酶（Acss）、乳酸脫氫酶B（Ldhb）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK 1）、丙酮酸羧化酶（Pcx）、丙酮酸激酶（Pklr）的不同基因元件中，其中Acss的差異顯著性最高；而41個低甲基化DMR分布在丙酮酸脫氫酶 （Pdha1）、乙酰輔酶A羧化酶β（Acacb）、乳酸脫氫酶D（Ldhd）、乙二醛酶1（Glo 1）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）、丙酮酸羧化酶（Pcx）、醛脫氫酶2（Aldh 2）、酰基磷酸酶2（Acyp2）基因不同元件。

結合TET 1所具有的去甲基化生物學功能，TET 1干擾組去甲基化的能力受到抑制，因而其調控的基因組中會呈現高甲基化狀態。在丙酮酸代謝途徑出現顯著甲基化DMR的關鍵分子中，共有Acss、Ldhb、PCK 1、Pcx和Pklr 5個酶的基因中表現高甲基化，其中Acss、Ldhb和Pklr基因的DMR均呈現單一高甲基化（表4），其余兩個分子不同元件的DMR表現為高甲基化和低甲基化同時存在，因而Acss、Ldhb和Pklr應是TET 1調控uNK細胞甲基化潛在的重要靶分子。由于PI3K/AKT信號通路和HIF-1信號通路均是參與細胞能量代謝的經典通路，而丙酮酸是糖、脂肪酸、蛋白質等代謝過程中的中心產物，與能量代謝息息相關，且這兩個通路在基因體和啟動子上的DMR也出現富集，因而PI3K/AKT和HIF-1信號通路是參與TET1調控uNK細胞的重要信號通路。

3 討 論

DNA甲基化是在胞嘧啶上第5位碳原子甲基化變為5-甲基胞嘧啶（5mC）或5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的反應，在生命領域被廣泛研究和應用，現已發現在胚胎發育［22］、造血系統［23］及腫瘤等［24-25］相關疾病發生過程中發揮重要作用。胞嘧啶甲基化導致DNA的轉錄不能正常延伸，從而使得基因沉默，因此高甲基化往往意味著調控基因的沉默，低甲基化會激活基因的轉錄與表達，借此來調控基因的表達。而TET 1能在Fe2+和α-酮戊二酸的輔助下將5-甲基胞嘧啶（5-mc）氧化成5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），實現DNA去甲基化作用，借此對多種生命活動進行調控，目前已經證實TET 1在胚胎發育［26］、干細胞重編程［27］以及免疫細胞Treg的分化、穩定［28］等方面具有重要的調控作用，且課題組前期也發現TET 1對維持正常妊娠發揮重要作用的uNK細胞具有調控作用［21］，但對調控機制尚不明確，鑒于TET 1具有去甲基化的能力，因此推測其很有可能是通過調控某些重要通路中基因的甲基化來實現的，因此本試驗通過RNA干擾的方式敲低uNK細胞中TET 1的表達，對比正常uNK細胞進行甲基化組學測序分析。

目前，用于DNA甲基化測序的方法主要有全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）、簡化甲基化測序（RRBS）、精準DNA甲基化和羥甲基化測序（oxBS-seq）、羥甲基化DNA免疫共沉淀測序（MeDIP-seq）等4種方式，其中RRBS主要利用限制性內切酶對基因進行酶切，富集啟動子及CpG島等重要表觀調控區域進行重亞硫酸鹽測序，該方法可以減少樣本DNA需求量，顯著提高CpG區域測序深度，能增強在CpG島、啟動子區域和增強子元件區域分辨率的精準度，是一種準確、高效的DNA甲基化研究方法［29］，本試驗中的uNK細胞為原代細胞，不易獲取且增殖分化速度較慢，因此采用RRBS方法對其進行DNA甲基化測序分析，能夠保證在有限的DNA濃度下準確分析甲基化結果。

與對照組相比，TET 1干擾組uNK細胞中共篩選到14 120個甲基化差異區域（DMR），其中高甲基DMR為4 897個，低甲基化DMR為9 223個，位于基因體（69.14%）和外顯子（25.48%）上的DMR數量最多，說明TET 1是廣泛作用于uNK細胞的基因組，而非特異性作用于某單一基因，且uNK細胞內極有可能存在TET 1的拮抗機制，通過DNA甲基化重編程平衡TET 1干擾造成的活性紊亂，已有研究證實在小鼠胚胎成纖維細胞內TET 1與甲基化轉移酶Dnmt通過拮抗關系維持正常DNA甲基化水平［30］。

本試驗中通過KEGG通路富集顯示基因體和啟動子上的DMR均在代謝通路中最為顯著，這說明TET 1對小鼠uNK細胞的調控主要是從物質能量代謝方面發揮作用的，而進一步分析發現丙酮酸代謝在代謝通路中的差異尤為顯著，丙酮酸是細胞內重要的小分子有機物，是糖、蛋白質和脂肪三者代謝過程中重要的中間代謝產物，也是整個代謝網絡的中心產物［31］。試驗結果顯示12個參與丙酮酸代謝的關鍵分子上共有54個DMR，作為DMR出現最為廣泛和集中的一個代謝途徑，表明TET 1應是主要通過調控丙酮酸進而影響uNK細胞的能量代謝，這與丙酮酸促進T細胞分化并調控T細胞以增強其抗腫瘤作用［32，33］、介導巨噬細胞參與炎癥反應［34］具有類似的現象。而該試驗結果說明丙酮酸代謝同樣對uNK細胞具有調控作用，且甲基化是其調控細胞活性的手段之一。TET 1具有去甲基化的生物學功能，TET 1干擾組由于基因的表達受到干擾使得去甲基化的能力受到抑制，因而受其調控的基因會呈現高甲基化的狀態。在對丙酮酸代謝途徑中關鍵分子出現顯著高甲基化DMR的分析中發現，Acss、Ldhb和Pklr三個分子中的DMR在所有DNA元件上呈現單一高甲基化，而其余兩個在啟動子、外顯子、內含子、基因體、2K上游區、5′非翻譯區和3′非翻譯區上表現既有高甲基化DMR，又有低甲基化DMR，因此Acss、Ldhb和Pklr三個酶極有可能是TET 1調控uNK細胞甲基化的靶分子，需要進一步通過轉錄組、蛋白質組學分別在mRNA水平和蛋白質水平對其進一步驗證。

PI3K/AKT和HIF-1信號通路均是參與細胞能量代謝的經典通路，如脂質代謝基因FTO介導PI3K/AKT信號通路影響乳腺癌細胞能量代謝［35］，CD38蛋白通過增加AKT、mTOR及PI3K的磷酸化以激活PI3K/AKT信號通路來調節宮頸癌細胞的能量代謝［36］，中藥槐耳則是通過介導PI3K/AKT/HIF-1α通路抑制肺癌細胞的能量代謝，顯示其抗癌活性［37］，而HIF-1更是作為調節細胞能量代謝的重要調節因子成為治療癌癥的候選靶點［38］。大量研究顯示二者均參與丙酮酸代謝途徑，Cerniglia等［39］發現PI3K/AKT信號通路對腫瘤細胞耗氧量的調控與丙酮酸脫氫酶的磷酸化有關，Zhou等［40］發現丙酮酸通過誘導GSK3β磷酸化參與激活PI3K/AKT信號傳導，從而抑制黑色素細胞合成黑色素，丙酮酸還是激活HIF-1通路的激活劑［41-42］。此外，PI3K/AKT和HIF-1信號通路參與去甲基化酶TET 1的表觀遺傳調控作用。子宮內膜癌發展過程中，由胰島素誘導表達的TET 1通過激活PI3K/AKT通路，促進子宮內膜癌細胞分化［43］。在缺氧環境下，脂肪細胞內HIF-1通過誘導TET 1表達降低脂肪細胞因子DNA啟動子甲基化，誘導其表達［44］。在本試驗發現這兩個通路的基因體和啟動子上的DMR出現了顯著富集，因而認為PI3K/AKT和HIF-1信號通路是參與TET 1調控uNK細胞的重要信號通路。

4 結 論

TET 1對小鼠uNK細胞具有甲基化調控作用，丙酮酸代謝是其發揮調控作用的主要途徑，Acss、Ldhb和Pklr是其潛在的靶分子，PI3K/AKT和HIF-1通路是參與其調控作用的重要信號通路。

參考文獻（References）：

［1］ 雒瑞瑞， 王彩蓮， 郎 俠. DNA甲基化在家畜繁殖中的研究進展［J］. 農業生物技術學報， 2023， 31（10）：2190-2199.

LUO R R， WANG C L， LANG X. Research progress on DNA methylation in domestic animal reproduction［J］. Journal of Agricultural Biotechnology， 2023， 31（10）：2190-2199. （in Chinese）

［2］ TWIGT J M， HAMMICHE F， SINCLAIR K D， et al. Preconception folic acid use modulates estradiol and follicular responses to ovarian stimulation［J］. J Clin Endocrinol Metab， 2011， 96（2）：E322-E329.

［3］ CHAN D， MCGRAW S， KLEIN K， et al. Stability of the human sperm DNA methylome to folic acid fortification and short-term supplementation［J］. Hum Reprod， 2017， 32（2）：272-283.

［4］ GRAZUL-BILSKA A T， JOHNSON M L， BOROWICZ P P， et al. Placental development during early pregnancy in sheep：effects of embryo origin on fetal and placental growth and global methylation［J］. Theriogenology， 2013， 79（1）：94-102.

［5］ BIRD A. DNA methylation patterns and epigenetic memory［J］. Genes Dev， 2002， 16（1）：6-21.

［6］ SCHBELER D. Function and information content of DNA methylation［J］. Nature， 2015， 517（7534）：321-326.

［7］ 馬 飛. TET1表觀修飾BCL6B調控胃癌進展的機制［D］. 福州：福建醫科大學， 2016.

MA F. Mechanism of TET1 epigenetic modification of gene BCL6B in the regulation of gastric cancer［D］. Fuzhou：Fujian Medical University， 2016. （in Chinese）

［8］ 黎明國， 華再東， 畢延震. TET蛋白在配子形成和早期胚胎中的作用研究進展［J］. 中國畜牧雜志， 2023， 59（11）：71-77.

LI M G， HUA Z D， BI Y Z. Research progress on the role of TET protein in gametogenesis and early embryo［J］. Chinese Journal of Animal Science， 2023， 59（11）：71-77. （in Chinese）

［9］ YAMAGUCHI S， HONG K， LIU R， et al. Tet1 controls meiosis by regulating meiotic gene expression［J］. Nature， 2012， 492（7429）：443-447.

［10］ XU M Z， QIAN J L， SI L， et al. The effect of epigenetic changes on the extrusion of the first polar body in pig oocytes during in vitro maturation［J］. Cell Reprogram， 2019， 21（3）：129-140.

［11］ YAMAGUCHI S， SHEN L， LIU Y T， et al. Role of Tet1 in erasure of genomic imprinting［J］. Nature， 2013， 504（7480）：460-464.

［12］ KHOUEIRY R， SOHNI A， THIENPONT B， et al. Lineage-specific functions of TET1 in the postimplantation mouse embryo［J］. Nat Genet， 2017， 49（7）：1061-1072.

［13］ PENG V， XING X Y， BANDO J K， et al. Whole-genome profiling of DNA methylation and hydroxymethylation identifies distinct regulatory programs among innate lymphocytes［J］. Nat Immunol， 2022， 23（4）：619-631.

［14］ YANG R L， QU C Y， ZHOU Y， et al. Hydrogen sulfide promotes Tet1- and Tet2-mediated Foxp3 demethylation to drive regulatory T cell differentiation and maintain immune homeostasis［J］. Immunity， 2015， 43（2）：251-263.

［15］ ORLANSKI S， LABI V， REIZEL Y， et al. Tissue-specific DNA demethylation is required for proper B-cell differentiation and function［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2016， 113（18）：5018-5023.

［16］ SOJKA D K， YANG L P， YOKOYAMA W M. Uterine natural killer cells［J］. Front Immunol， 2019， 10：960.

［17］ JABRANE-FERRAT N. Features of human decidual NK cells in healthy pregnancy and during viral infection［J］. Front Immunol， 2019， 10：1397.

［18］ 楊曉偉， 趙永聚. 哺乳動物子宮自然殺傷（uNK）細胞對妊娠的調控作用［J］. 畜牧獸醫學報， 2020， 51（5）：899-906.

YANG X W， ZHAO Y J. The regulation role of uterine natural killer （uNK） cells during pregnancy in mammals［J］. Acta Veterinaria Et Zootechnica Sinica， 2020， 51（5）：899-906. （in Chinese）

［19］ XIE M， LI Y， MENG Y Z， et al. Uterine natural killer cells：a rising star in human pregnancy regulation［J］. Front Immunol， 2022， 13：918550.

［20］ DAZ-HERNNDEZ I， ALECSANDRU D， GARCA-VELASCO J A， et al. Uterine natural killer cells：from foe to friend in reproduction［J］. Hum Reprod Update， 2021， 27（4）：720-746.

［21］ 楊曉偉， 趙自亮， 付 雨， 等. TET1基因對小鼠uNK細胞增殖及IFN-γ、VEGF-C和TGF-β1轉錄水平的影響［J］. 畜牧獸醫學報， 2023， 54（3）：1221-1228.

YANG X W， ZHAO Z L， FU Y， et al. Effects of TET1 gene on the proliferation of mouse uNK cells and the transcriptional level of IFN-γ， VEGF-C and TGF-β1［J］. Acta Veterinaria Et Zootechnica Sinica， 2023， 54（3）：1221-1228. （in Chinese）

［22］ 趙柯郁， 蘇麗婭. 胚胎發育過程的表觀遺傳調控研究進展［J］. 生物學雜志， 2023， 40（6）：99-103.

ZHAO K Y， SU L Y. Advancement of epigenetic regulation in embryonic development［J］. Journal of Biology， 2023， 40（6）：99-103. （in Chinese）

［23］ QIAN D C， ULRICH B C， PENG G， et al. Outcomes stratification of head and neck cancer using pre- and post-treatment DNA methylation from peripheral blood［J］. Int J Radiat Oncol Biol Phys， 2023， 115（5）：1217-1228.

［24］ STURGEON S R， SELA D A， BROWNE E P， et al. Prediagnostic white blood cell DNA methylation and risk of breast cancer in the prostate lung， colorectal， and ovarian cancer screening trial （PLCO） cohort［J］. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2021， 30（8）：1575-1581.

［25］ 郭靜思， 李馨陽， 楊躍輝. 甲基轉移酶樣蛋白家族在腫瘤疾病中的相關研究進展［J］. 中國藥學雜志， 2024， 59（5）：392-397.

GUO J S， LI X Y， YANG Y H. Research progress in research on methyltransferase-like protein family in cancer diseases［J］. Chinese Pharmaceutical Journal， 2024， 59（5）：392-397. （in Chinese）

［26］ VASCONCELOS S， CANIAIS C， CHUVA DE SOUSA LOPES S M， et al. The role of DNA hydroxymethylation and TET enzymes in placental development and pregnancy outcome［J］. Clin Epigenet， 2023， 15（1）：66.

［27］ CUI Y H， LI T， YANG D H， et al. miR-29 regulates Tet1 expression and contributes to early differentiation of mouse ESCs［J］. Oncotarget， 2016， 7（40）：64932-64941.

［28］ NAKATSUKASA H， ODA M， YIN J H， et al. Loss of TET proteins in regulatory T cells promotes abnormal proliferation， Foxp3 destabilization and IL-17 expression［J］. Int Immunol， 2019， 31（5）：335-347.

［29］ LAIRD P W. Principles and challenges of genome-wide DNA methylation analysis［J］. Nat Rev Genet， 2010， 11（3）：191-203.

［30］ 王倩倩. 雙加氧酶Tet對DNA甲基化修飾的影響及相關調控機制研究［D］. 北京：中國農業大學， 2018.

WANG Q Q. Effects of Tet dioxygenases on DNA methylation and related regulatory mechanisms［D］. Beijing： China Agricultural University， 2018.（in Chinese）

［31］ GRAY L R， TOMPKINS S C， TAYLOR E B. Regulation of pyruvate metabolism and human disease［J］. Cell Mol Life Sci， 2014， 71（14）：2577-2604.

［32］ ELIA I， ROWE J H， JOHNSON S， et al. Tumor cells dictate anti-tumor immune responses by altering pyruvate utilization and succinate signaling in CD8+ T cells［J］. Cell Metab， 2022， 34（8）：1137-1150. e6.

［33］ WENES M， JACCARD A， WYSS T， et al. The mitochondrial pyruvate carrier regulates memory T cell differentiation and antitumor function［J］. Cell Metab， 2022， 34（5）：731-746. e9.

［34］ PALMIERI E M， GONZALEZ-COTTO M， BASELER W A， et al. Nitric oxide orchestrates metabolic rewiring in M1 macrophages by targeting aconitase 2 and pyruvate dehydrogenase［J］. Nat Commun， 2020， 11（1）：698.

［35］ LIU Y Z， WANG R Y， ZHANG L C， et al. The lipid metabolism gene FTO influences breast cancer cell energy metabolism via the PI3K/AKT signaling pathway［J］. Oncol Lett， 2017， 13（6）：4685-4690.

［36］ LIAO S， LIANG L， YUE C X， et al. CD38 is involved in cell energy metabolism via activating the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in cervical cancer cells［J］. Int J Oncol， 2020， 57（1）：338-354.

［37］ LIU X L， LIU L D， CHEN K Y， et al. Huaier shows anti-cancer activities by inhibition of cell growth， migration and energy metabolism in lung cancer through PI3K/AKT/HIF-1α pathway［J］. J Cell Mol Med， 2021， 25（4）：2228-2237.

［38］ INFANTINO V， SANTARSIERO A， CONVERTINI P， et al. Cancer cell metabolism in hypoxia：role of HIF-1 as key regulator and therapeutic target［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（11）：5703.

［39］ CERNIGLIA G J， DEY S， GALLAGHER-COLOMBO S M， et al. The PI3K/Akt pathway regulates oxygen metabolism via pyruvate dehydrogenase （PDH）-E1α phosphorylation［J］. Mol Cancer Ther， 2015， 14（8）：1928-1938.

［40］ ZHOU S Q， SAKAMOTO K. Pyruvic acid/ethyl pyruvate inhibits melanogenesis in B16F10 melanoma cells through PI3K/AKT， GSK3β， and ROS-ERK signaling pathways［J］. Genes Cells， 2019， 24（1）：60-69.

［41］ LUO Z S， ZENG W Z， DU G C， et al. Enhancement of pyruvic acid production in Candida glabrata by engineering hypoxia-inducible factor 1［J］. Bioresour Technol， 2020， 295：122248.

［42］ WANG Y， HUANG Y， YANG J， et al. Pyruvate is a prospective alkalizer to correct hypoxic lactic acidosis［J］. Mil Med Res， 2018， 5（1）：13.

［43］ XIE B Y， LV Q Y， NING C C， et al. TET1-GPER-PI3K/AKT pathway is involved in insulin-driven endometrial cancer cell proliferation［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2017， 482（4）：857-862.

［44］ ALI M M， PHILLIPS S A， MAHMOUD A M. HIF1α/TET1 pathway mediates hypoxia-induced adipocytokine promoter hypomethylation in human adipocytes［J］. Cells， 2020， 9（1）：134.

（編輯 白永平）