副豬格拉瑟菌OppA過表達株的構建及其對小鼠免疫保護性研究

摘 要：

本研究旨在增加副豬格拉瑟菌寡肽滲透酶（oligopeptide permease，OppA）表達量，構建可以過表達OppA的副豬格拉瑟菌株，并對其進行小鼠的免疫保護試驗以評價其作為格拉瑟病弱毒活疫苗的潛力。以副豬格拉瑟菌CF7066株為親本株，利用自然轉化和Flp-FRT無抗突變系統(tǒng)構建副豬格拉瑟菌OppA過表達株，通過Western blot檢測OppA的表達量，通過阿拉伯糖誘導和提高培養(yǎng)溫度消除抗性基因和Flp表達質粒。進行小鼠免疫保護試驗，通過檢測血清中抗體水平及脾淋巴細胞增殖、觀察小鼠死亡率。結果顯示：構建了3株副豬格拉瑟菌OppA過表達株ΔnanH：：oppAR，ΔnanH：：oppA和ΔnanH：：PqseB-oppA。由于ΔnanH：：oppAR株中OppA的表達量顯著高于CF7066 （Plt;0.001），所以選擇該過表達株進行小鼠免疫保護試驗。小鼠在免疫后進行rOppA-ELISA的抗體檢測，結果表明，ΔnanH：：oppAR免疫組的OppA抗體水平比CF7066組、ΔnanH組和PBS組高，但低于滅活疫苗組。用rOppA蛋白刺激脾淋巴細胞，ΔnanH：：oppAR和CF7066組小鼠脾淋巴細胞的增殖量顯著高于刺激前（P＜0.05），而ΔnanH、滅活疫苗組和PBS對照組沒有改變。用CF7066菌株進行攻毒，其中滅活疫苗組、ΔnanH：：oppAR組、CF7066組對小鼠的保護率均為100%，ΔnanH組為75%。當前研究構建的3株副豬格拉瑟菌重組菌株中，ΔnanH：：oppAR的OppA表達水平最高，用該菌株免疫小鼠后產生OppA特異性的體液免疫和細胞免疫，而且可對CF7066攻毒提供有效保護。基于此，副豬格拉瑟菌OppA過表達株ΔnanH：：oppAR有望作為副豬格拉瑟菌的減毒活疫苗。

關鍵詞：

副豬格拉瑟菌；寡肽滲透酶；過表達；基因工程；弱毒疫苗

中圖分類號：S852.61

文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0860-10

收稿日期：2024-03-21

基金項目：“十四五”國家重點研發(fā)計劃 （2022YFD1800902）；湖北省科技重大專項（2021ABA005）

作者簡介：李枝卉（1998-），女，湖北十堰人，碩士，主要從事副豬格拉瑟菌基因工程疫苗研究，E-mail： 1132879561@qq.com

*通信作者：徐曉娟，主要從事動物傳染病診斷試劑和疫苗研究，E-mail：xuxiaojuan@mail.hzau.edu.cn

Construction of the Gleasserella parasuis Strain Overexpressing OppA and Evaluation of

Its Immunogenicity and Efficacity in Mice

LI" Zhihui1， LUO" Jinlin1， XIE" Hong1， LI" Mingkun1， LIN" Yang1， ZHANG" Yujiao1， XU" Yindi2，

CHEN" Huanchun1， CAI" Xuwang1， XU" Xiaojuan1*

（1.National Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Key Laboratory of Preventive Veterinary

Medicine in Hubei Province， College of Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China;

2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Research， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002，" China）

Abstract：

The study aims to construct Glaesserella parasuis （G. parasuis） mutants overexpressing oligopeptide permease gene through improvement of its expression capacity， and to evaluate its immunogenicity and efficacity in mice. G. parasuis CF7066 strain being used as the parent strain，the overexpressing mutans were constructed via natural transformation and Flp-FRT markless mutation system. The OppA expression capacity of the overexpression strains was detected by WB，and then strains were induced by arabinose to excise KanR cassette and were cultured at high temperature to eliminated Flp expression plasmid. The mutant of ΔnanH：：oppAR was selected for conductind immunization and challenge experiments in mice. Comprehensive evaluations were conducted on serum antibody levels， spleen lymphocyte proliferation and the murine survival rate. Three overexpressing mutans of ΔnanH：：oppAR， ΔnanH：：oppA andΔnanH：：PqseB-oppA were constructed. Because ΔnanH：：oppAR had the highest capacity for expression of OppA， it wase used for murine immunization experiment. The rOppA-ELISA showed that the mice immunized with ΔnanH：：oppAR strain produced the higher level of OppA antibody than CF7066 and ΔnanH， but lower than the commercial inactivated vaccine group. After being stimulated with rOppA， the number of lymphocyte proliferation were significantly larger than before immunization among the mice immunized with ΔnanH：：oppAR and with CF7066（P＜0.05）， but not in the mice immunized with ΔnanH， the inactivated vaccine and PBS control. The challenge experiment showed that the survival rate were 100% in the mice immunized with ΔnanH：：oppAR and CF7066， and it was 75% in ΔnanH group. Three overexpressing mutants of G. parasuis were constructed， in which ΔnanH：：oppAR has the highest expression capacity of OppA. Immunization and challenge experiments showed that ΔnanH：：oppAR elicited murine antibody production and splenic lymphocyte proliferation specific for OppA protein， and simultaneously provided substantial protection against the wild strain CF7066. Thus， ΔnanH：：oppAR possessed potential as an attenuated vaccine strain for G. parasuis.

Key words：

Glaesserella parasuis; oligopeptide permease; overexpression; genetic engineering; attenuated vaccines

*Corresponding author：" XU Xiaojuan， E-mail： xuxiaojuan@mail.hzau.edu.cn

副豬格拉瑟菌（Glaesserella parasuis，GPS）是定植于豬上呼吸道的一種病原菌，革蘭陰性菌，體外培養(yǎng)依賴NAD。該菌在豬免疫力低下或受到應激時可導致全身性感染，引起以纖維素性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為特征的格拉瑟病（Glsser’s disease）［1］。格拉瑟病存在于世界上所有養(yǎng)豬的國家和地區(qū)，在我國規(guī)模化養(yǎng)殖的豬群中多發(fā)。目前，我國用于預防該病的疫苗主要為多價的滅活苗。眾所周知，細菌滅活疫苗主要誘導體液免疫，產生血清型特異性的免疫保護，對制苗菌株以外血清型的免疫保護非常有限，而已知副豬格拉瑟菌有15個已知的血清型和27%的不能分型的菌株。然而，細菌弱毒苗接種具有與自然發(fā)病類似感染的過程，可提供全面的免疫原性更好的抗原成分，從而能誘導體液免疫和細胞免疫反應，因此可提供針對不同血清型的交叉保護。所以，研究副豬格拉瑟菌的弱毒疫苗，可提高格拉瑟病的免疫預防的效果，對我國格拉瑟病防控具有重要意義。細菌的寡肽輸入是通過一種細菌外膜的結合ATP的轉運體完成，該轉運體命名為寡肽滲透酶（oligopeptide permease）。寡肽滲透酶由A、B、C、D、F 5種蛋白組成，其中四種蛋白OppBCDF存在于外膜形成孔道，OppA是位于周質或外膜的脂蛋白，負責結合細胞外寡肽并轉運至外膜［2-3］。研究表明，鼠疫耶爾森菌和卡他莫拉菌的重組OppA蛋白具有良好的免疫原性，在感染中可提供保護性免疫［4-6］。不僅如此，流感嗜血桿菌的OppA蛋白被證實可誘導小鼠肺Th17細胞特異的細胞免疫，可對不同血清型的流感嗜血桿菌提供交叉保護［7］。因此，本研究構建了過表達OppA蛋白并缺失唾液酸酶基因nanH（Neuraminidase H）的GPS突變株ΔnanH：：oppAR，并通過小鼠的免疫保護試驗對ΔnanH：：oppAR株在小鼠體內的免疫原保護性進行了評價。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）購自美國BD公司。新生犢牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、卡那霉素、慶大霉素購自德國BioFroxx公司。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）購自北京索萊寶科技有限公司。PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase、2×Rapid Taq Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。Uniclone One Step Seamless Cloning Kit購自金沙生物。各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自美國New England Biolabs公司。質粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自美國OmeGa Bio-Tek公司。HRPGoat Anti-Mouse IGG（H+L）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。WB底物顯色試劑盒（Clarity Western ECL Substrate）購自美國Bio-Rad公司。細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。凝膠回收試劑盒購自Omega Biotek公司。副豬格拉瑟菌滅活疫苗購自武漢科前生物公司。

1.2 菌株、蛋白和抗血清

GPS菌株使用含有10%胎牛血清和補充20 μg·mL-1 NAD的TSA或者TSB培養(yǎng)，根據需要加入卡那霉素（50 μg·mL-1）或慶大霉素（20 μg·mL-1）。大腸桿菌BL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司。用引物OppA-e-F/R擴增去除信號肽的OppA編碼序列，用30a-F/R擴增載體pET-30a的載體骨架，無縫克隆構建表達質粒pET-30a-OppA。用表達質粒pET-30a-OppA轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，在16℃條件下用0.2 mmol·L-1的IPTG誘導22 h，用鎳柱親和層析純化。純化rOppA分別使用弗式完全佐劑和弗式不完全佐劑乳化蛋白，分兩次免疫小鼠后制備rOppA蛋白的小鼠抗血清。NanH蛋白的抗血清為本實驗室制備并保存［8］。

1.3 質粒構建

用于構建過表達菌株的質粒構建方法：首先，使用引物ori-F/R和kan-R/F從pKF-ΔnanH擴增質粒復制原點和帶有FRT位點的卡那抗性表達盒，再用引物oppA-F/R、nanH-down-F/R和nanH-up-F/R從CF7066基因組擴增oppA基因和nanH基因上游同源臂，上述所得PCR產物純化后通過無縫克隆，獲得質粒pKF-ΔnanH-oppA。然后，使用引物P1-F/R從質粒pKF-ΔnanH-oppA擴增卡那抗性和oppA基因表達盒，再用引物P2-F/R擴增質粒其余部分，無縫克隆獲得質粒pKF-ΔnanH-oppAR。最后，使用引物對P3-F/R擴增從CF7066株PqseB啟動子，用引物P4-F/R從pKF-ΔnanH-oppA擴增無oppA啟動子區(qū)域，無縫克隆獲得質粒pKF-ΔnanH-PqseB-oppA（表1、2；圖1）。

1.4 過表達株的構建

OppA過表達菌株的構健參照文獻［9］。首先電轉化Flp酶表達質粒pGF到CF7066獲得慶大抗性的重組菌株CF7066（pGF），再將質粒pKF-ΔnanH-oppA、pKF-ΔnanH-oppAR和pKF-ΔnanH-PqseB-oppA自然轉化到CF7066（pGF）中，獲得具有慶大和卡那抗性的突變株CF7066ΔnanH：：oppA：：kan（pGF）、CF7066ΔnanH：：oppAR：：kan（pGF）和CF7066ΔnanH：：PqseB-oppA：：kan（pGF）。最后，經10mmol·L-1阿拉伯糖誘導和42℃無抗條件下培養(yǎng)，消除卡那抗性基因和Flp酶表達質粒pGF，最終獲得無抗性和無質粒的突變株CF7066ΔnanH：：oppA、CF7066ΔnanH：：oppAR和CF7066ΔnanH：：PqseB-oppA（表2）。

1.5 生長曲線測定

將所構建的OppA過表達菌株在無抗的TSA平板上連續(xù)接種3代，挑取單菌落接種于5 mL TSB培養(yǎng)基，于37℃搖床上以200 r·min-1（振蕩培養(yǎng)過夜，按1∶100轉接于新鮮TSB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。間隔2 h測定菌液在600 nm波長處的吸光度（OD600 nm），記錄OD600 nm并繪制生長曲線。

1.6 Western blot

菌株接種于TSA平板37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600 nm為 1.0時收

集菌液，離心后取菌體和上清分別制樣。樣品經SDS-PAGE凝膠電泳并轉移到PVDF膜上，TBST洗滌3次。在含5%脫脂乳的TBST溶液中于室溫封閉2 h后。分別按1∶5 000加入小鼠抗rOppA蛋白的血清和GAPDH單克隆抗體于4℃過夜孵育。TBST洗滌3次后，將PVDF膜放入含5%脫脂乳的TBST溶液中，按1∶5 000加入HRP標記的羊抗鼠 IgG （1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，于ECL超敏化學發(fā)光液中顯色后將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中顯色。

1.7 小鼠免疫試驗

6周齡雌性BALB/c小鼠40只，其中30只分為3組，10只·組-1，分別接種CF7066、CF7066ΔnanH、CF7066ΔnanH：：oppAR（8只用于保護率評價，2只用于淋巴細胞增殖試驗）。剩余10只分為2組，5只·組-1，接種滅活疫苗和作為攻毒對照。活菌的免疫劑量為5×107 CFU·只-1，免疫途徑為腹腔注射。滅活疫苗頸部肌肉注射。一免后14 d二免，二免后14 d攻毒，攻毒菌株為CF7066，劑量為5×109 CFU·只-1，腹腔注射。攻毒后，觀察小鼠精神狀態(tài)和存活情況，記錄死亡率。對免疫前后血清中OppA蛋白的抗體通過rOppA-ELISA進行檢測。分別于一免前、一免后7 d、一免后14 d、二免后7 d采血，分離血清檢測。

1.8 rOppA-ELISA

將表達純化的rOppA 蛋白用包被液（碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1.0 μg·mL-1，100 μL·孔-1加入酶標板4 ℃包被過夜。用洗滌液（含有0.05%Tween-20的PBS）200 μL·孔-1洗滌3次，加封閉液（含5%脫脂乳的洗滌液）200 μL·孔-137 ℃溫育2h，洗滌3次。用樣品稀釋液（PBS含有0.05%Tween-20，0.5%BSA）將被檢血清做1∶200稀釋，加100 μL·孔-137 ℃作用1 h，洗滌3次。加1∶15 000稀釋的的HPR標記的羊抗鼠二抗（ABclonal）100 μL·孔-137 ℃作用60 min，洗滌3次。加底物液四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和30% H2O2各50 μL·孔-1，混勻室溫避光顯色15 min，加50 μL·孔-1終止液氫氟酸（0.25%），10 min內在酶標儀上測波長630 nm處的吸光值（OD630 nm）。

1.9 淋巴細胞增殖試驗

二免后7 d，每組取兩只小鼠，處死后分離脾淋巴細胞，調整細胞數為107·mL-1，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。將均勻分散的脾淋巴細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板，加入終濃度為10 μg·mL-1的OppA蛋白。對照組加入終濃度10 μg·mL-1 ConA蛋白，空白組不加僅有細胞。每組重復3個孔，試驗重復兩次。置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中68 h后，每孔加入CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，使用酶標儀測定波長450 nm處的吸光值（OD450 nm）。

1.10 統(tǒng)計分析

小鼠抗體水平檢測和淋巴細胞增殖試驗的結果分析使用GraphPad9.5.0軟件的雙因素方差分析。

2 結 果

2.1 OppA蛋白的表達和抗血清制備

通過SignalP軟件預測OppA的信號肽，將去除信號肽的OppA編碼序列克隆到載體pET-30a，構建表達質粒pET-30a-OppA。質粒測序正確后轉化至大腸桿菌BL21（DE3）摸索最佳表達條件。結果表明，rOppA可溶性大量表達的條件是0.8 mmol·L-1 IPTG，16 ℃22 h。用鎳柱對表達蛋白進行純化，洗脫蛋白的咪唑濃度為100 mmol·L-1（圖2A）。純化蛋白免疫小鼠制備抗血清，通過Western blot檢測顯示，小鼠抗血清可以與大腸桿菌表達的rOppA蛋白和CF7066菌株的天然OppA蛋白反應，而未免疫小鼠血清均不反應（圖2B、C）。CF7066菌體中OppA蛋白的預期大小為58.3 ku，而rOppA蛋白由于兩端標簽和蛋白酶切位點序列的引入，預期大小為64.3 ku。所以，通過Western blot檢測天然OppA蛋白和rOppA時大小不一致是合理的。上述結果表明，rOppA的免疫原性良好，其抗血清可以對GPS菌株中天然的OppA蛋白通過Western blot進行檢測。

2.2 3株過表達菌株OppA的表達量

以GPS血清5型分離株CF7066為親本株，通過自然轉化和Flp-FRT介導的無抗基因敲除系統(tǒng)［9］，在缺失的nanH基因座插入3種oppA基因表達盒，構建了3株OppA蛋白過表達株，分別是ΔnanH：：oppA、ΔnanH：：oppAR和ΔnanH：：PqseB-oppA。其中，ΔnanH：：oppA中使用了oppA基因自身啟動子，ΔnanH：：oppAR也使用了自身啟動子，但oppA基因表達盒的方向與nanH基因轉錄方向相反，ΔnanH：：PqseB-oppA使用了qseB基因的啟動子，oppA基因表達盒的方向也與nanH相反（圖1）。

3株過表達菌株接種TSA平板活化，接種單菌落在TSB液體培養(yǎng)基至OD600 nm為1.0，收集菌液對菌體和培養(yǎng)上清中OppA蛋白使用小鼠抗rOppA血清進行Western blot檢測。結果表明，3株過表達菌株和CF7066的菌體細胞中OppA蛋白的表達量差異不顯著（P＞0.5，圖3A、B），而3株過表達菌株分泌到培養(yǎng)上清中的OppA蛋白的量顯著高于CF7066（P＜0.01，圖3C、D）。值得注意的是，Western blot檢測到的菌體中OppA蛋白的分子量比在上清中的大，這是由于分泌到上清中的OppA蛋白的信號肽（26 aa）已被切除。此外，通過Western blot對唾液酸酶NanH進行檢測，證實CF7066中有NanH的表達，而過表達株都沒有（圖3E），表明所構建的過表達株中nanH基因敲除成功。總之，當前研究構建了3株可以過表達OppA蛋白的GPS突變株，其過表達的OppA蛋白分泌到培養(yǎng)上清中以分泌蛋白的形式存在。

2.3 過表達株ΔnanH：：oppAR株對小鼠的免疫原性

進行了3株過表達菌株和CF7066的體外培養(yǎng)生長曲線的測定。結果顯示，CF7066生長最快，過表達株的生長速度均下降（圖4A）。盡管ΔnanH：：PqseB-oppA體外生長速度接近親本株，但由于其使用了GPS的qseB基因啟動子，可能會存在潛在的負面效應，而ΔnanH：：oppAR使用了oppA基因天然啟動子，而且ΔnanH：：oppAR中OppA表達量比ΔnanH：：PqseB-oppA高（圖3D）。因此，選擇ΔnanH：：oppAR株作為格拉瑟菌弱毒疫苗候選菌

株進行小鼠免疫保護試驗。

BALB/c小鼠分為5組，4組分別接種ΔnanH：：oppAR、ΔnanH、 CF7066和滅活苗進行免疫，對照組注射PBS。在小鼠免疫前和免疫后每間隔一周，用rOppA-ELIA對每組血清抗體進行檢測。結果表明，二免后一周（21 d），滅活疫苗組OD630 nm大于2.0，ΔnanH：：oppAR在1.5左右，CF7066、ΔnanH免疫組在1.0左右（圖4B）。可見，ΔnanH：：oppAR免疫小鼠后能夠刺激機體產生更多的OppA特異性抗體。

二免后一周（21d），每組取兩只小鼠，無菌分離小鼠脾淋巴細胞，用表達純化OppA蛋白刺激后，CF7066ΔnanH：：oppAR和CF7066免疫組小鼠脾淋巴細胞的增殖量顯著高于刺激前（P＜0.05），而ΔnanH、滅活疫苗組和PBS對照組幾乎沒有改變（圖4C）。上述結果表明，ΔnanH：：oppAR免疫小鼠后，可以刺激機體產生OppA蛋白致敏的淋巴細胞。

2.4 過表達株ΔnanH：：oppAR對小鼠的免疫保護

小鼠在二免疫后2周（28d），用CF7066株以109 CFU·只-1的菌量進行攻毒試驗。攻毒后小鼠精神萎頓、蜷縮、厭食。滅活疫苗免疫組小鼠在24 h時恢復正常，ΔnanH：：oppAR 和CF7066免疫組在48h時恢復正常，ΔnanH組有2只死亡，其余6只在48 h時恢復正常。PBS對照組有2只死亡，1只存活（表3）。

3 討 論

本研究使用GPS的無抗突變系統(tǒng)［9］，以GPS的血清5型分離株CF7066為親本株，構建了3株過表達寡肽滲透酶的GPS菌株。其中，ΔnanH：：oppAR在體外培養(yǎng)能夠分泌最多量的OppA蛋白，免疫小鼠后產生了OppA蛋白特異性抗體和致敏脾的淋巴細胞，而且能夠對免疫小鼠提供有效保護。

OppA是一種存在于多種病原菌的位于周質或外膜的脂蛋白，可分泌到細胞外，負責結合細菌所需要的肽并運輸到外膜，再通過寡肽轉運系統(tǒng)的外膜組分運輸到細胞內［2］。OppA在副豬格拉瑟菌中的基因相對保守，免疫原性良好，使用其作為抗原的間接血凝抗體檢測方法可以對GPS所有血清型的抗體做檢測［10］。另外，在流感嗜血桿菌的研究中發(fā)現，OppA蛋白可以誘導機體產生很強的體液免疫，還可以刺激機體產生具有交叉保護的特異性細胞免疫［7］。考慮到OppA蛋白免疫原性強，并能提供保護性的細胞免疫，所以選擇OppA蛋白作為GPS基因缺失疫苗的過表達抗原，以期能作為對多種血清型可產生交叉保護的副株格拉瑟菌基因工程減毒活疫苗。

為了實現OppA蛋白的過表達，起初使用組成型強啟動子置換OppA的天然啟動子，或者增加啟動子拷貝實現過表達，但均未能成功。后來，決定構建含有雙拷貝的菌株實現過表達。唾液酸酶NnaH是人上呼吸道病原菌肺炎鏈球菌的重要毒力因子，其在肺炎鏈球菌導致的敗血癥中發(fā)揮重要作用［11］。考慮到GPS引起仔豬的死亡都是發(fā)生于全身性感染后的敗血癥，所以推測NanH也很可能與GPS的毒力和致病性相關。另外，副豬格拉瑟菌的所有血清型菌株都可以表達唾液酸酶，既可獲取黏膜或漿膜表面的唾液酸作為營養(yǎng)，也可將其用于細菌唾液酸化而實現免疫逃避［12-13］。因此，本研究將含有oppA啟動子和編碼序列的片段重組出缺失了nanH的基因座，在增加oppA基因拷貝的同時也缺失了nanH基因，以期同時實現毒力的致弱和免疫原保護性的增強。

在小鼠免疫試驗中，分別進行了OppA的抗體檢測和淋巴細胞增殖試驗，過表達株ΔnanH：：oppAR所產生的抗體水平比CF7066雖然略有上升，但差異并不顯著，而淋巴細胞增殖試驗中ΔnanH：：oppAR組小鼠的淋巴細胞增殖能力比滅活疫苗和ΔnanH免疫組小鼠的高（P＜0.05）。流感嗜血桿菌的研究表明，可對其不同血清型菌株提供交叉保護主要是源于特異性的Th17的細胞免疫而非體液免疫，而Th17細胞免疫主要是由在不同血清型和未分型菌株間保守的OppA蛋白誘導產生［7］。根據該研究結果，再考慮到GPS與流感嗜血桿菌在遺傳學和致病性上相似性高，由此推測，雖然ΔnanH：：oppAR在小鼠體內刺激的OppA抗體水平上升雖然不明顯，但顯著增加的OppA蛋白特異的細胞免疫更有助于產生更廣泛的保護。接下來的攻毒試驗也初步說明了這一點，CF7066和ΔnanH：：oppAR提供了100%的保護，而ΔnanH僅提供了85%的保護。

在本研究中，通過小鼠的免疫保護試驗，對OppA過表達株ΔnanH：：oppAR的免疫保護性進行了初步評價，證明其可誘導小鼠產生針對OppA蛋白特異性的體液免疫和細胞免疫，并對小鼠提供有效的免疫保護。但是，由于副株格拉瑟菌的致病力較弱，對小鼠的免疫和攻毒菌量都較高，而且小鼠也不是格拉瑟病理想的動物感染和攻毒模型，所以更應該進行仔豬的動物試驗，對其免疫保護性進行更進一步的評價。

4 結 論

1）構建的3株過表達OppA蛋白的GPS菌株在體外分泌表達OppA的量顯著高于親本株。2）過表達株ΔnanH：：oppAR株誘導小鼠產生的OppA特異性的體液免疫和細胞免疫。3）過表達株ΔnanH：：oppAR免疫小鼠可能產生有效的免疫保護。

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（編輯 白永平）