豬肺炎支原體強弱毒株的生物學特性及比較基因組學分析

摘 要：

旨在為更好地理解豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）強弱毒株在物質代謝、毒力變化的差異，本研究基于Mhp強毒株ES-2株及其傳代致弱株ES-2L株，開展二者的生長特性、黏附細胞能力、代謝產生過氧化氫水平、生物被膜形成能力等生物學特性及比較基因組學研究。在生長特性方面，ES-2L株的生長速度和滴度要高于ES-2株，其顏色改變單位（color change unit，CCU）為1.0×1010 CCU·mL-1，在培養基上具有更好的適應性。在與毒力變化相關的特性方面，ES-2和ES-2L株均可以形成生物被膜，但ES-2L株的生物被膜形成能力要弱于ES-2株。ES-2L株代謝甘油產生過氧化氫的水平要低于ES-2株，且其對支氣管上皮細胞的黏附能力要弱于ES-2株。ES-2和ES-2L基因組共線性比對分析結果表明，二者的總體共線性良好，但ES-2L株存在幾處基因的缺失、倒位現象，對ES-2L株中的缺失基因進行定位分析，共檢測到9個大片段（gt;500 bp）的基因缺失，這9個片段共包含18個缺失基因。SNP（單核苷酸多態性）和Indel（插入與缺失突變）分析表明，共檢測到348個SNVs（單核苷酸突變），這些SNVs主要分布于99個基因上，并且有22個dels（缺失突變）主要分布于19個基因上。基因島分析結果表明，ES-2L株在395～425 kb有一個基因島編碼序列，ES-2株在354～364、920～945 kb有兩個基因島編碼序列。這些缺失或發生SNP的基因、基因島的變化可能與ES-2L毒力下降及生長特性改變有關。綜上，本研究闡明了Mhp強弱毒株在物質代謝、毒力變化的差異，并采用比較基因組學的方法，分析了二者在基因水平的變化，為進一步理解Mhp致病機制和毒力因子挖掘提供一種視角。

關鍵詞：

豬肺炎支原體；毒力；比較基因組學；生物被膜

中圖分類號：S852.62

文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0851-09

收稿日期：2024-03-13

基金項目：河南省高等教育教學改革研究與實踐重大項目（2021SJGLX652）

作者簡介：李真亞（1992-），男，河南鄲城人，講師，博士，主要從事動物傳染病研究，E-mail：1906981786@qq.com

*通信作者：賈榮玲，主要從事動物傳染病研究，E-mail：jrlplay@163.com

Biological Characteristics and Comparative Genomic Analysis of Virulent and Attenuated

Strains of Mycoplasma hyopneumoniae

LI" Zhenya1，2，3， LIU" Jie 1， LI" Yun1， WANG" Fei1， KONG" Yuanyuan1， LI" Yong1， JIA" Rongling1，2，3*

（1.Nanyang Agricultural Vocational College， Nanyang 473000，" China;

2.Henan Normal University，

Xinxiang 453007，" China;

3.Nanyang Key Laboratory of Animal Disease Prevention and Control， Nanyang 473000，" China）

Abstract：

In order to better understand the differences in material metabolism and virulence changes between virulent and attenuated strains of Mycoplasma hyopneumoniae （Mhp）， this study was based on the virulent strain ES-2 and the attenuated strain ES-2L induced by passaging of strain ES-2.The growth characteristics， cell adhesion ability， metabolic production of hydrogen peroxide level， biofilm formation ability and other biological characteristics and comparative genomics of the two strains were studied. In terms of growth characteristics， the growth rate and titer of ES-2L strain were higher than that of ES-2 strain， and its color change unit （CCU） was 1.0×1010 CCU·mL-1， which had better adaptability on medium. In terms of virulence changes， both ES-2 and ES-2L strains could form biofilm， but the biofilm formation capacity of ES-2L strain was weaker than that of ES-2 strain. The level of metabolizing glycerol to produce hydrogen peroxide of ES-2L strain was lower than that of ES-2 strain， and its adhesion ability to bronchial epithelial cells was weaker than that of ES-2 strain. The results of genome collinearity comparison between ES-2 and ES-2L showed that the overall collinearity of the two strains was good， but there were several gene deletion and inversion in ES-2L strains. The localization analysis of the deletion genes in ES-2L strains showed that a total of 9 large fragments （gt;500 bp） of gene deletion were detected， and these 9 fragments contained a total of 18 deletion genes. Analysis of SNP （single nucleotide polymorphism） and Indel （Insertion and deletion variation） showed that 348 SNVs （single nucleotide variations） were detected， which were mainly distributed in 99 genes， and 22 dels （deletion variations） were mainly distributed in 19 genes. The results of gene island analysis showed that ES-2L had a gene island coding sequence ranging from 395 to 425 kb， and ES-2 had two gene island coding sequences ranging from 354 to 364 kb， and 920 to 945 kb.These deletion or SNP genes and gene island changes may be related to the decrease of virulence and the change of growth characteristics of ES-2L. In summary， this study clarified the differences in material metabolism and virulence changes between virulent and attenuated strains of Mhp， and analyzed the changes of the two strains at the gene level by using comparative genomics method， providing a perspective for further understanding the pathogenic mechanism of Mhp and mining virulence factors.

Key words：

Mycoplasma hyopneumoniae; virulence; comparative genomics; biofilm

*Corresponding author：" JIA Rongling， E-mail：jrlplay@163.com

Mhp是支原體屬中的一個重要成員，其可以引起豬的地方性肺炎（enzootic pneumonia，EP）［1］。EP是一種慢性呼吸道疾病，各個年齡階段的豬都能夠被感染，臨床癥狀表現為咳嗽和氣喘、消瘦，導致豬生長性能、飼料轉化率顯著降低［2-3］。在實際生產中，已經感染Mhp的豬群更容易繼發感染細菌性病原體，同時在與其他病毒性病原體的混合感染下，引起豬呼吸道疾病綜合征，使臨床上豬的呼吸道疾病更加復雜多變，難于防治。Mhp自二十世紀六十年代首次被鑒定以來，目前已經在世界范圍內廣泛流行和傳播，嚴重危害著集約化養豬業的健康發展［4-5］。

Mhp的表面黏附因子和代謝產物與其致病性密切相關［6-7］。不像其他細菌性病原，Mhp沒有內、外毒素這樣的毒力因子，其重要的毒力因子就是其表面的黏附蛋白。Mhp對呼吸道上皮細胞的黏附在其定植侵入宿主中具有關鍵作用，Mhp感染豬后，細菌表面的黏附因子首先與豬呼吸道纖毛上皮細胞進行結合，造成纖毛大面積脫落，呼吸道黏膜屏障結構完整性遭到破壞，并且激發機體炎癥反應［8-9］。Mhp黏附宿主細胞的能力往往與其毒力強弱密切相關。代謝甘油產生H2O2是Mhp致病的一個重要機制。Ferrarini等［10］研究比較了無毒力J菌株和高毒力7488菌株在代謝甘油產生H2O2水平的差異。細菌生物被膜的形成是抵抗抗生素殺菌和宿主免疫反應的一個重要機制，人的肺炎支原體可以通過釋放胞外DNA而形成生物被膜［11］。Raymond等［12］報道了Mhp可以在宿主細胞和無機質玻璃上形成生物被膜，但Mhp強弱毒株形成生物被膜的差異還不清楚。三代測序技術已被廣泛應用于基因組測序，比較基因組學方法也越來越多地被用來進行微生物毒力基因的挖掘及病原與宿主互作機制的研究［13-14］。為了更好地理解Mhp強弱毒株在物質代謝、毒力變化的差異，本研究基于Mhp強毒株ES-2株及其傳代致弱株ES-2L株，開展二者的生長特性、黏附細胞能力、生物被膜形成能力等生物學特性及比較基因組學研究，為理解其致病機制和毒力因子挖掘提供一種視角。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

Mhp強毒ES-2株及其傳代致弱株ES-2L株來自華中農業大學動物傳染病實驗室饋贈。

1.2 主要試劑

豬血清購自Gibco公司；PPLO肉湯粉、PPLO Agar均購自Difco公司；腦心浸出物購自青島高科園海博生物技術有限公司；水解乳蛋白、1%結晶紫溶液購自Sigma公司；酵母浸出物購自Oxoid公司；酚紅、甘油、丙酮酸鈉、葡萄糖及配制Hanks’平衡鹽緩沖液所需試劑購自中國醫藥（集團）上海化學試劑公司；青霉素鈉、DMEM培養基購自Biosharp公司。過氧化氫檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；支原體全基因組提取試劑盒購自Biomiga公司。

1.3 ES-2和ES-2L株生長特性和菌體形態的比較

不同于常規細菌的計數方法，Mhp一般采取顏色變化單位（colour change unit，CCU）的方法來進行計數，其原理是Mhp可以代謝葡萄糖產酸，從而可致培養基的pH發生變化，以培養基中的酚紅作為指示劑，便可間接測定培養物中的微生物含量，具體方法：將分離的Mhp菌液按1∶10的比例接種于改良Friis液體培養基，置于37 ℃ 5% CO2培養2～3 d，待培養基顏色變黃時，此時pH下降至6.8左右（處于對數期），準備13個7 mL的無菌西林瓶，每個瓶中先加入1.8 mL的培養基，取長至穩定期的菌液200 μL，10倍倍比稀釋至1013，同時以未加入菌液的培養基作為陰性對照，放置37 ℃ 5% CO2中培養并觀察14 d，每天記錄培養基顏色變化情況。以第14天最后一個西林瓶中的培養基顏色發生變化的稀釋倍數為最終判定結果。

將長至對數期的 ES-2和ES-2L株菌液100 mL，6 000 ×g離心15 min，離心后棄掉上清，經PBS洗滌3次后，收集菌體沉淀，沉淀用電鏡固定液于4 ℃固定24 h后，送武塞維爾生物科技有限公司進行透射電鏡觀察。

1.4 生物被膜的檢測

2 mL ES-2和ES-2L株菌液分別在共聚焦培養皿上連續培養4～5代［15］，同時進行培養基對照，每個菌株做3個重復。培養結束后，將菌液棄掉，用無菌PBS洗滌3次，然后加入1mL甲醛進行固定10 min，棄去甲醛，再用PBS洗滌3次，拍干。加入1 mL 1%結晶紫染液，染色30 min，棄掉染色液，用PBS洗滌3次，拍干。最后于每個培養皿中加入1 mL無水乙醇，吹打培養皿底部4～5次，靜置10 min，取200 μL置于96孔板中，測定590 nm波長吸光度，統計分析通過GraphPad Prism 7軟件進行，數據采用方差分析和t檢驗進行評估，P值lt;0.05為有統計學意義（*）。

1.5 H2O2水平的檢測

2 mL ES-2和ES-2L株菌液置于37 ℃ 5% CO2環境中培養48～60 h至對數期，每個菌株做3個重復，同時做培養基對照。將生長至對數期菌液以4 000 ×g離心15 min，收獲菌體，PBS洗滌一次。然后用PBS重懸菌體。加入甘油至其終濃度為1 mmol·L-1，在37 ℃，5% CO2溫箱中孵育6 h，并進行CCU測定。孵育結束后，取出100 μL液體，進行過氧化氫水平檢測，具體檢測步驟參考試劑盒說明書，統計分析通過GraphPad Prism 7軟件進行，數據采用方差分析和t檢驗進行評估，P值lt;0.05為有統計學意義（*）。

1.6 細胞黏附能力的檢測

將豬氣管上皮細胞（STEC 細胞）接種于6孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培養基進行過夜培養，待細胞長滿50%時，用2 mL含2%胎牛血清的DMEM 維持液重懸Mhp菌株，然后接種于鋪細胞的孔，接種劑量均為1×108CCU。待Mhp 和STEC 細胞互作24h，棄培養液，PBS洗2 次。加入1 mL含0.5%胰蛋白酶消化液，在37℃培養箱消化2min，消化完成后，加入1 mL PBS吹打混懸細胞液，對混勻后的細胞懸液采用支原體全基因組提取試劑盒提取基因組（具體步驟參考試劑盒說明書），采用前期已經建立的熒光定量PCR方法［16］，進行細胞載菌量的檢測比較。數據采用方差分析，P值lt;0.05為有統計學意義（*）。

1.7 ES-2與ES-2L株的比較基因組學分析

從NCBI上分別下載ES-2株（GenBank：CP038641.1），ES-2L株（GenBank：CP058578.1）全基因序列，運用Mauve 2.3.1 genome alignment software對二者進行共線性比對分析。用 GATK Haplotype Caller、FreeBayes和samtools mpileup三種軟件對ES-2和ES-2L株進行SNP（單核苷酸多態性）和Indel（插入與缺失）變異分析。采IslandViewer 4軟件對ES-2L和ES-2株進行基因島結構預測分析。

2 結 果

2.1 ES-2和ES-2L株生長特性和菌體形態的比較

CCU測定結果顯示，相比于ES-2株，ES-2L株在培養的第24小時開始變色，在第48小時即可達到生長的最高峰，其CCU為1.0×1010 CCU·mL-1。ES-2株在培養的第36小時開始變色，在第72小時達到生長的最高峰，其CCU為1.0×108CCU·mL-1。透射電鏡結果顯示，ES-2L株和ES-2株菌體形態基本相似，都呈圓形或橢圓形，且細胞大小不等，無細胞壁結構，胞內含有多種胞質顆粒。相比于ES-2株，ES-2L株存在少許大細胞突變體，見圖1。這些大細胞突變體利用代謝營養物質的能力強于正常細胞體，推測這可能與ES-2L株在培養基中具有更好的適應性有關。

2.2 生物被膜的檢測

生物被膜的形成與細菌毒力密切相關，結果顯示，ES-2和ES-2L株均可以形成生物被膜，二者的OD590 nm吸光值相比于培養基對照組均具有顯著差異；并且相比于ES-2株，ES-2L株的生物被膜形成能力要弱于ES-2株，二者具有顯著差異（圖2）。

2.3 H2O2水平的檢測

H2O2水平檢測結果顯示，在甘油存在的情況下，相比于ES-2株，ES-2L株產生過氧化氫的水平要低于ES-2株，二者具有顯著差異（圖3）。這說明Mhp菌株毒力的強弱與其代謝產生的H2O2水平具有相關性。

2.4 細胞黏附能力的檢測

利用qPCR方法分別檢測ES-2ES-2L感染STEC細胞后的菌體載量，ES-2組平均菌體載量為1×106.17copy·mL-1；ES-2L組平均菌體載量為1×104.73copy·mL-1，二者有顯著差異（P＜0.05），詳見圖4。表明ES-2L株對STEC細胞的黏附能力弱于ES-2株。

2.5 ES-2和ES-2L共線性比對分析

ES-2L株相比于ES-2株，二者的總體共線性良好，但存在幾處基因缺失、倒位現象（圖5）。進一步地對ES-2L株中的缺失基因進行定位分析，共檢測到9個大片段（gt;500 bp）的基因缺失，這9個片段共包含18個缺失基因（表1）。

2.6 SNP和Indel變異分析

SNP和Indel分析顯示，共檢測到348個SNVs，這些SNVs主要分布于99個基因上。并且有22個dels主要分布于19個基因上。這些缺失或SNVs的基因，會影響基因功能的表達，這可能跟ES-2L株毒力下降及生長特性的改變有關。

2.7 基因島分析

IslandViewer 4分析結果顯示，ES-2L株在395～425 kb有1個基因島編碼序列，ES-2株在354 ～364、920～945 kb有2個基因島編碼序列（圖6）。

3 討 論

ES-2L株由ES-2株通過連續體外傳代致弱而來［15-17］，在二者的生長特性方面，CCU生長曲線結果說明：相比于ES-2株，ES-2L生長速度更快且生長滴度更高，ES-2L株對培養基具有更好的適應性。此外，少數ES-2L株菌體細胞發生變化產生大細胞突變體，這些大細胞突變體對培養基營養物質的攝取和代謝能力更強，與典型的菌體形態相比，這些大細胞突變包含更多的DNA，推測這可能與ES-2L株在培養基中具有更好的適應性有關，但也有可能與生物被膜的形成有關［18］。生物被膜的形成與細菌毒力密切相關，Tassew等［19］報道指出Mhp可以在非生物表面和呼吸道單層上皮細胞表面形成生物被膜，生物被膜參與了Mhp的抗生素抵抗，增強了其體外生存能力，但關于Mhp生物被膜的形成機制還未闡明。有研究指出，在生物被膜形成的過程中，會出現一種不穩定的大細胞突變體，其包含更多的DNA，裂解釋放的DNA是形成生物被膜所必須的［12］。目前，還沒有關于Mhp強弱毒株之間生物被膜形成能力的其他研究，本研究為理解生物被膜的形成及其所扮演的毒力重要性提供了一個新的視角。ES-2L弱毒株代謝甘油產生過氧化氫的水平和生物被膜形成能力都要低于ES-2株。Ferrarini等［10］研究比較了Mhp強毒株7488株，弱毒J株在代謝甘油產生過氧化氫的水平的差異：強毒株7488株產生過氧化氫的水平要遠高于弱毒J株。Rasheed等［20］研究也表明牛支原體與其傳代致弱株在產生過氧化氫水平能力上具有顯著差異，這與本研究結果是一致的。黏附定植宿主細胞是Mhp入侵細胞的第一步，對宿主細胞的黏附能力大小，往往與其毒力密切相關，ES-2L黏附能力的下降，可能與相關黏附基因缺失或黏附蛋白表達量下降有關［17］。

ES-2L和ES-2株全基因組大小分別為918 900、956 514 bp，相比于ES-2，其少了 37 614 bp。在連續傳達的過程中，基因的缺失是經常發生的。Rasheed等［20］研究報道，牛支原體HB0801株在連續體外傳代時，發生了一個14.2 kb大小的基因片段的缺失。ES-2L和ES-2株比較基因組學結果表明，相比于ES-2，ES-2L株有3個大的基因片段缺失，這些片段包含18個基因，遺憾的是，這些基因的功能大都是未知的，還需要進一步研究。其中的1個缺失基因E5E95_01860，編碼乙醇脫氫酶 （AdhE），是乙醇厭氧發酵途徑中的一個關鍵酶，調節細菌中乙醇的產生［21-22］。在氧缺乏條件下，AdhE的缺失能夠減少乙醇的合成，進而減少過氧化氫的產生，而過氧化氫被認為與支原體毒力密切相關［23-24］。Liu等［14］進行了168株及其弱毒株168L之間的共線性分析，其二者之間也存在基因大片段的缺失、倒位等基因重排現象。這些結構變化的基因應當是以后人們重點關注和研究的基因。基因島被認為與基因間的水平轉移密切相關，目前的研究表明，基因島上編碼的基因主要與微生物的毒力、致病性、代謝和抗生素抵抗等相關［25-26］。ES-2L和ES-2株的基因島結構分析表明，ES-2株有2個基因島編碼序列。在ES-2株的2個基因島中，其中一個基因島位于920 852～943 294 bp位點，其編碼10個基因。其中的2個基因E5E95_03750和E5E95_03795分別編碼LppA 家族脂蛋白和轉錄延伸因子GreA，其他的研究已指出，Mhp表面的LppA家族脂蛋白和轉錄延伸因子在Mhp黏附和入侵宿主細胞中起重要作用［27-29］。因此，作者推測，基因島上的編碼基因可能與ES-2毒力和生長特性的改變有直接關系。SNP分析結果表明，ES-2L株存在348個 SNVs，這些 SNVs主要分布于99個基因上并可能影響了這些基因的功能。其中1個基因E5E95_00610被NCBI數據庫注釋為一個黏附素蛋白基因，該基因在傳代過程中經歷了兩處非同義基因突變（C-G和C-T），這些核苷酸突變可能影響了其正常黏附功能的發揮。Liu等［14］通過對Mhp菌株168和168L的比較基因組學分析，結果發現168L有大量的SNVs，而這些 SNVs影響了一些重要黏附素基因的功能表達，例如 P97、P102、P46和P65等。在本研究中，由于缺乏成熟的基因操作平臺，Mhp蛋白體外表達的困難［30-31］，目前在技術上還不能通過構建基因缺失株的方法來證實Mhp強弱毒株之間這些缺失基因的功能。但隨著相關技術的成熟及研究的不斷深入，人們對這些基因功能的認識也會越來越清晰。

4 結 論

本研究對Mhp強毒株ES-2株和弱毒株ES-2L株進行生物學特性及比較基因組學析。結果表明ES-2和ES-2L株均可以形成生物被膜，ES-2L株的生物被膜形成能力要弱于ES-2株。ES-2L株代謝甘油產生過氧化氫的水平要低于ES-2株，且其對支氣管上皮細胞的黏附能力要弱于ES-2株。比較基因組學結果表明，相對于ES-2，ES-2L共計存在9個大片段，18個基因的缺失。348個SNVs和22個Indel主要分布于ES-2L的118個基因中，而這些缺失或變異的基因可能與ES-2L株的毒力下降及生長特性改變有關。本研究為進一步理解Mhp致病機制和毒力因子挖掘提供一種視角。

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（編輯 白永平）