豬流行性腹瀉病毒S1蛋白的原核表達及其核酸適配體的篩選

摘 要：

本文旨在可溶性原核表達豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）S1蛋白的C端結合域（S1-CTD），并利用指數富集的配體系統進化技術篩選靶向S1-CTD蛋白的DNA適配體，為該病毒治療藥物的開發以及檢測方法的建立奠定基礎。采用大腸桿菌原核表達系統，將PEDV-S1-CTD質粒與帶有麥芽糖結合蛋白（MBP）、小分子泛素樣修飾蛋白（SUMO）、反轉錄終止因子（NusA）、谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）四種促溶標簽的原核表達載體pET21b連接，構建重組質粒pET21b-MBP-S1、pET21b-SUMO-S1、pET21b-NusA-S1、pET21b-GST-S1，將雙酶切鑒定和測序正確的重組質粒轉入大腸桿菌BL21進行誘導表達，選擇可溶性好且表達量高的rMBP-S1重組蛋白進行后續試驗，Western blot結果顯示該重組蛋白正確表達，間接免疫熒光試驗（IFA）結果表明rMBP-S1能與細胞表面受體結合。隨后經磁珠法篩選得到111條靶向rMBP-S1重組蛋白的候選DNA適配體，其中Apt-S1-3、Apt-S1-11富集程度最高，分別是18%和16.2%，酶聯適配體吸附試驗ELASA（enzyme-linked aptamer sorbent assays，ELASA）測定適配體Apt-S1-3的解離常數為2.09 nmol，并且該適配體不與rMBP蛋白、rMBP-gD蛋白、rMBP-GP5蛋白以及BSA蛋白發生交叉反應，表明該適配體具有高親和力與高特異性。此外，使用在線軟件Mfold分析適配體Apt-S1-3形成的二級結構，并且通過分子對接模擬，發現該適配體能夠與靶標蛋白形成穩定的復合物。最后的間接免疫熒光試驗表明適配體Apt-S1-3能夠識別PEDV，流式細胞術試驗證實該適配體能夠抑制PEDV感染宿主細胞。本研究篩選得到的DNA適配體能夠與豬流行性腹瀉病毒S1-CTD蛋白高親和力、高特異性結合，而且能夠抑制豬流行性腹瀉病毒感染細胞，為PEDV的靶向治療和檢測方法開發奠定基礎。

關鍵詞：

豬流行性腹瀉病毒；S1-CTD蛋白；磁珠法；核酸適配體；親和力

中圖分類號：S852.659.6

文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0839-12

收稿日期：2024-03-13

基金項目：河南省科技攻關（242102110019）；國家自然科學基金（31972672）

作者簡介：張冬萱（1999-），女，河南三門峽人，主要從事動物生物技術研究，E-mail 15138163667@163.com

*通信作者：張 超，主要從事動物生物技術研究，E-mail：chaozhang@henau.edu.cn

Prokaryotic Expression of S1 Protein in Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Screening of Its Aptamers

ZHANG" Dongxuan， WANG" Zhihao， QIAO" Yan， ZHAO" Xiaoxiao， FAN" Songjie， ZHANG" Chao*

（Key Laboratory of Animal Biochemistry and Nutrition， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

College of Veterinary Medicine， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China）

Abstract：

This study aimed to express the C-terminal binding domain （S1-CTD） of the porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） S1 protein in a soluble prokaryotic system and to screen DNA aptamers targeting S1-CTD using the systematic evolution of ligands by exponential enrichment （SELEX） technique， laying the foundation for the development of therapeutic drugs and detection methods for the PEDV. The PEDV-S1-CTD plasmid was cloned into prokaryotic expression vectors containing maltose-binding protein （MBP）， small ubiquitin-like modifier （SUMO）， transcription termination factor （NusA）， and glutathione S-transferase （GST） tags. Recombinant plasmids pET21b-MBP-S1， pET21b-SUMO-S1， pET21b-NusA-S1， and pET21b-GST-S1 were constructed and transformed into E. coli BL21 for expression. The rMBP-S1 recombinant protein with good solubility and high expression was selected for further experiments. Western blot and indirect immunofluorescence assay （IFA） confirmed the correct expression and receptor binding of the protein. Aptamer Apt-S1-3 and Apt-S1-11 were enriched with the highest affinity （18% and 16.2%， respectively） and specificity， respectively. ELASA determined a dissociation constant of 2.09 nmol for Apt-S1-3， which showed no cross-reactivity with rMBP， rMBP-gD， rMBP-GP5， or BSA proteins. Mfold analysis and molecular docking simulations revealed the aptamer’s ability to form stable complexes with the target protein. IFA and flow cytometry confirmed the aptamer’s recognition and inhibition of PEDV infection. This study successfully screened a DNA aptamer that binds to the PEDV S1-CTD protein with high affinity and specificity， inhibiting virus infection and providing a foundation for targeted therapy and detection methods for PEDV.

Key words：

porcine epidemic diarrhea virus; S1-CTD protein; magnetic bead method; aptamer; affinity

*Corresponding author：" ZHANG Chao， E-mail： chaozhang@henau.edu.cn

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea， PED），是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）引起的豬腸道傳染性疾病［1］，自20世紀90年代以來一直在世界范圍內流行，給我國養豬業，特別是仔豬養殖造成了巨大的經濟損失［2-3］。目前無論是滅活疫苗還是減毒疫苗，都不能對當前流行的PEDV變異毒株提供足夠的保護［4-5］，早期診斷并加以防治是減少損失的方法。PEDV是一種具有囊膜的正股單鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），α-冠狀病毒屬（Alphacoronavirus），基因組大小約28 kb，編碼4種結構蛋白，即刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣殼（N）蛋白；16個非結構蛋白（nsp1-nsp16）和輔助蛋白ORF3［6］。

S蛋白介導病毒進入靶細胞［7］，并在組織和細胞嗜性中起主要作用［8］，并且S基因的突變通常與病毒嗜性改變和病毒毒力變化相關，是影響病毒跨物種傳播的潛在危險因素［9］。PEDV通過兩種方式進入靶細胞：病毒粒子與質膜融合后直接進入［10-11］以及受體介導的內吞作用，隨后病毒膜與內核體融合［12］。S蛋白包括S1亞基和S2亞基［13］，S1介導病毒與細胞受體結合，包括C端結合域（S1-CTD）和N端結合域（S1-NTD）兩個亞基，S1-CTD能識別病毒受體充當主要的受體結合域，S1-NTD能識別多糖作為其潛在受體［14］，S2介導膜融合的過程。S蛋白通過和宿主蛋白相互作用在病毒入侵和感染過程中發揮重要作用［15］。綜合S1-CTD在病毒受體識別過程中的重要作用，以及能夠誘導宿主產生中和抗體，本研究以PEDV的S1-CTD蛋白為研究對象開展后續研究。

核酸適配體是基于指數富集配體進化技術（SELEX）從人工合成的寡核苷酸文庫中篩選出與靶標高特異性、高親和力結合的單鏈DNA或者RNA，也被稱為“化學抗體”，與傳統蛋白抗體相似，核酸適配體能與靶標高特異性、高親和力結合，并且核酸適配體容易人工合成和修飾，且可以常溫儲存，因此在病毒檢測和抗病毒治療中具有廣闊的應用前景［16］。

本試驗通過添加促溶標簽，實現了PEDV-S1-CTD蛋白的可溶性原核表達，并且純化得到純度高、具有生物活性的重組S1-CTD蛋白。經磁珠法篩選得到靶向S1-CTD蛋白的111條DNA適配體，ELASA（enzyme-linked aptamer sorbent assays， ELASA）測定發現Apt-S1-3不僅能夠與S1-CTD蛋白高特異性、高親和力結合，而且能夠識別、結合病毒粒子進而影響PEDV感染細胞。該適配體為抗病毒藥物研發以及PEDV檢測方法的建立打下基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

Ni-NTA親和層析填料購自GenScript公司；Ni磁珠購自金斯瑞生物公司；鏈霉親和素糖珠購自Merck生物公司；TOP10感受態細胞由河南農業大學農業農村部動物生化與營養重點實驗室保存；BL21感受態細胞購于TOLOBIO；BCA試劑盒購自鼎國生物公司；膠回收試劑盒、質粒DNA小量抽提試劑盒、瓊脂糖和HRP標記的鏈霉親和素二抗購自生工生物公司；T4連接酶、限制性核酸內切酶購自NEB公司；PVDF轉印膜和ECL化學發光顯色液購自millipore公司；細胞膜紅色熒光染色試劑盒（Dil）購自碧云天生物技術有限公司；CoraLite 488-Conjuggated Goat Anti-Mouse IgG（H+L）購自三鷹生物技術有限公司；初始寡核苷酸隨機文庫、普通引物以及上游FAM標記和下游Biotin標記引物由金斯瑞生物公司合成，序列見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體構建

參考NCBI上PEDV毒株（NC_003436.1： 20638-24789）的S1基因序列，將S1-CTD區域的密碼子進行優化，并在序列兩端引入酶切位點BamH Ⅰ和Xho Ⅰ，該序列由南京金斯瑞公司合成。將合成的PEDV-S1-CTD甘油菌接于含氨芐抗性的液體培養基中過夜培養，收集菌體沉淀，使用小提質粒試劑盒進行提取，限制性核酸內切酶BamHⅠ和XhoⅠ分別酶切PEDV-S1-CTD質粒與pET21b-MBP、pET21b-GST、pET21b-SUMO、pET21b-NusA載體質粒，對預期位置處條帶進行切膠回收，回收純化的目的基因與帶不同標簽的載體通過T4 DNA連接酶連接，構建重組原核表達質粒，連接產物轉化至大腸桿菌Top10感受態中，通過雙酶切和測序進行重組質粒的鑒定，將測序正確的質粒分別命名為pET21b-MBP-S1、pET21b-GST-S1、pET21b-SUMO-S1、pET21b-NusA-S1。

1.2.2 重組蛋白可溶性檢測

將測序正確的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21感受態中，涂板挑菌，接種于100 mL氨芐抗性液體培養基中擴培，在OD值0.4時加入終濃度0.1 mmol·L-1 IPTG，18℃，200 r·min-1誘導過夜。誘導結束后收集菌體沉淀，加入9 mL含有5 mmol·L-1咪唑的LE Buffer，1 mL甘油（10%）和20 μL PMSF重懸，冰浴超聲破碎完全后，4℃高速離心分離上清沉淀，上清沉淀分別取樣進行SDS-PAGE電泳鑒定可溶性，綜合考慮后選擇pET21b-MBP-S1進行后續試驗，后文簡稱為rMBP-S1。

1.2.3 純化目的蛋白 "用Ni-NTA親和層析法純化重組蛋白rMBP-S1。吸取2 mL混勻介質加入重力柱自由沉降，取10倍柱體積的LE Buffer平衡柱子兩次，10倍柱體積含5 mmol·L-1咪唑的LE Buffer平衡柱子兩次，過濾后上清重復上樣三次，20倍柱體積洗滌緩沖液洗去雜蛋白，20倍柱體積洗脫緩沖液洗脫目的蛋白并收集洗脫液，取樣進行SDS-PAGE電泳檢測。洗脫液用50 ku超濾管進行超濾濃縮，4℃離心時不宜使用過大轉速，以免損壞超濾管，4 000 r·min-1超濾20 min后根據所剩洗脫液體積加入適量透析液多次離心稀釋咪唑，將得到的目的蛋白使用BSA試劑盒檢測蛋白濃度，分裝后保存至-80 ℃冰箱。

1.2.4 驗證目的蛋白

利用蛋白免疫印跡法（WB）檢測目的蛋白。取變性后的蛋白樣品進行10%的SDS-PAGE電泳，電泳后通過濕轉法將蛋白轉印于PVDF膜上，5%脫脂奶封閉1 h，以鼠抗MBP的單抗（1∶1 000）作為一抗4℃過夜孵育。HRP標記山羊抗小鼠單抗（1∶5 000）作為二抗室溫震蕩孵育1 h，洗膜四次后采用Thermo的ECL顯色試劑盒進行顯色，并且用多功能成像儀記錄結果。

1.2.5 檢測蛋白活性

間接免疫熒光檢測蛋白活性，將細胞種24孔細胞培養板并在底部放入細胞爬片，細胞長至50%左右，取含終濃度為10 μmol·L-1的rMBP-S1蛋白、rMBP蛋白的DMEM置于4℃分別孵育1 h，并設置空白對照，然后使用細胞膜染色試劑Dil處理細胞，固定封閉，以鼠源抗MBP蛋白單克隆抗體作為一抗，CoraLite 488-Conjuggated Goat Anti-Mouse IgG（H+L）作為二抗，進行IFA試驗，DAPI染核后制片，用共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6 S1蛋白適配體篩選

將適量重組rMBP-S1蛋白與Ni磁珠置于4℃旋轉孵育過夜，取5 nmol隨機文庫加500 μL結合緩沖液（含0.55 mmol·L-1 MgCl2的PBS），95℃ 5 min，立即冰上10 min，室溫靜置10 min，處理后的文庫與過夜結合的S1-磁珠室溫孵育，孵育結束后Wash Buffer清洗磁珠，隨后加入200 μL DEPC水，95℃ 5 min后收集上清得到能與靶標蛋白結合的隨機序列，優化PCR擴增條件，在最優條件下使用FAM標記上游引物和Biotin標記下游引物進行大量擴增用于制備次級ssDNA文庫。

1.2.7 ssDNA次級文庫制備

取適量混勻鏈霉親和素糖珠加PBS洗兩次，與擴增產物室溫旋轉孵育90 min。PBS潤洗空芯柱，將孵育后的擴增產物-糖珠過柱，PBS清洗糖珠，隨后加入0.1 mol·L-1 NaOH室溫堿變性5 min后收集，可適當重復幾次收集流穿液得到FAM-ssDNA，使用酚-氯仿抽提，乙醇共沉淀方法回收純化FAM-ssDNA用于下一輪篩選。篩選過程中為了得到高親和力、高特異性的序列，從第四輪正篩選前添加MBP蛋白進行負篩選，并在篩選過程中逐漸增加負篩選蛋白用量及孵育時間，減少正篩蛋白用量及孵育時間，增加洗滌次數及用量和時間，以此增加篩選壓力。

1.2.8 篩選進程的驗證

PCR產物的熔鏈溫度取決于其內部結構和雙鏈體穩定性，文庫在PCR過程中會形成異源雙鏈和同源雙鏈，其比例取決于序列的多樣性，隨著篩選的進行，與靶標結合的ssDNA不斷富集，次級文庫的序列多樣性下降，PCR過程中會形成更多較穩定的同源雙鏈，熔鏈溫度隨之上升，使用qPCR監測文庫的復雜程度。挑選3、7、11、15輪文庫為模板并用隨機文庫作為對照組進行qPCR。使用流式細胞數監測富集情況，選擇第3、7、11、15輪FAM標記的ssDNA文庫加500 μL結合緩沖液（含0.55 mmol·L-1 MgCl2的PBS），95℃ 5 min，立即冰上10 min，室溫靜置10 min處理后與靶蛋白或負篩蛋白磁珠室溫孵育1 h，棄去孵育液，結合緩沖液洗3次后各加500 μL結合緩沖液重懸，使用流式細胞儀計數1 000個事件來確定熒光強度，隨機文庫與第15輪文庫孵育作為陰性對照。

1.2.9 克隆與測序

將最后一輪篩選得到的ssDNA進行PCR擴增，3%瓊脂糖核酸膠80 V電泳40 min，得到預期80 bp的條帶，膠回收目的條帶，連接pMD18-T載體后轉化于DH5α，將轉化產物均勻涂布于含氨芐抗性的LB固體培養基上，37℃過夜培養。挑取單菌落培養，隨后進行菌液PCR鑒定，將菌液鑒定正確的送往擎科生物公司測序。

1.2.10 候選適配體親和力及特異性測定

使用磷酸鹽緩沖液將重組rMBP-S1蛋白稀釋至10 ng·μL-1，4℃包被過夜，不同濃度生物素標記的候選適配體（800、400、200、100、50、25、12.5、6.75、3.125、0 nmol·L-1）為一抗，HRP-SA（1∶10 000稀釋）為二抗，檢測適配體對重組蛋白的親和力，每組3個重復，特異性檢測使用磷酸鹽緩沖液將重組rMBP-S1蛋白、rMBP蛋白、rMBP-gD蛋白、rMBP-GP5蛋白、BSA蛋白稀釋至10 ng·μL-1，4℃包被過夜，分別加入終濃度為200 nmol·L-1生物素標記的候選適配體，以HRP-SA（1∶10 000稀釋）為二抗，檢測候選適配體的特異性。

1.2.11 候選適配體二級結構分析及其與靶標蛋白的分子對接

將篩選出的候選適配體使用在線軟件Mfold（http：//www.unafold.org/）分析其二級結構，隨后通過在線網站3dRNA/DNA分析該適配體的三級結構，最后將其與SWISS MODEL同源建模的靶標蛋白進行分子對接，模擬出適配體與靶蛋白形成的穩定復合物，并分析參與復合物形成的可能結合位點。

1.2.12 間接免疫熒光驗證適配體對病毒的識別

提前將細胞種24孔細胞培養板并在底部放入細胞爬片，次日，對細胞計數，加入MOI為0.05的PEDV-HW病毒液，4℃吸附1 h，設置未加病毒作為對照組，隨后與終濃度為500 nmol·L-1的適配體Apt-S1-3-FAM室溫孵育1 h，固定、通透、封閉后，以PEDV S蛋白抗體為一抗，Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG（H+L）作為二抗進行IFA試驗。

1.2.13 流式細胞術驗證適配體對病毒感染的影響

提前將細胞種24孔細胞培養板培養過夜，次日，對細胞計數，計算MOI為0.05時每孔應加入的PEDV-GFP病毒量。隨后配制終濃度為0、500、1 000、1 500 nmol·L-1的適配體Apt-S1-3各200 μL，對應濃度隨機文庫各200 μL為對照組，將處理后的試驗組和對照組與PEDV-GFP病毒液體外旋轉孵育，將病毒-適配體混合物與細胞室溫孵育，隨后加1%FBS-DMEM維持液培養過夜，第二天熒光顯微鏡觀察病毒感染情況，流式細胞儀進行檢測，分析適配體對病毒感染的影響。

2 結 果

2.1 重組質粒酶切鑒定

為了驗證連四個不同標簽重組質粒pET21b-MBP-S1、pET21b-NusA-S1、pET21b-GST-S1、pET21b-SUMO-S1是否構建成功，對重組質粒進行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1，酶切得到片段1 170 bp目的基因片段（紅色箭頭），與預期結果相符。進一步的測序結果表明重組質粒構建成功。

2.2 重組蛋白的原核表達及可溶性分析

為了鑒定重組蛋白表達情況，分別取誘導前、誘導后、超聲后上清、超聲后沉淀的蛋白樣品進行10% SDS-PAGE電泳分析，發現重組質粒pET21b-SUMO-S1和pET21b-GST-S1表達的重組蛋白主要以包涵體形式存在，上清中含量不多，與之不同的是，重組質粒pET21b-MBP-S1與pET21b-NusA-S1的重組蛋白主要以可溶形式在上清中存在，而且MBP-S1的純度要高于NusA-S1（圖2A、B，泳道3）。因此本研究以pET21b-MBP-S1進行后續的蛋白純化和研究，后續試驗中簡稱為rMBP-S1蛋白。

2.3 目的蛋白的純化及蛋白免疫印跡（Western blot）檢測

使用Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白，將重組質粒pET21b-MBP-S1轉入大腸桿菌BL21細胞，用0.1 mmol·L-1 IPTG誘導后，收集細胞超聲破碎，將破碎取樣進行10% SDS-PAGE電泳分析。考馬斯亮藍染色，脫色液脫色后結果如圖3A所示（紅色方框標識），得到目的蛋白大小與預期一致，且未見明顯雜蛋白，BCA試劑盒測定該蛋白濃度為1.2 mg·mL -1。隨后，為了檢測rMBP-S1蛋白是否正確表達，以抗MBP抗體為一抗進行Western blot 鑒定，結果顯示，rMBP-S1蛋白和rMBP蛋白分別在75 ku和45 ku附近顯色，如圖3B，與預期大小一致，進一步表明成功得到重組rMBP-S1蛋白。

2.4 免疫熒光鑒定重組蛋白的生物活性

為了鑒定rMBP-S1蛋白的生物學活性，將rMBP-S1、rMBP蛋白與細胞4℃吸附1 h，Dil染膜，以抗MBP抗體為一抗進行IFA試驗。結果證實，純化后的重組蛋白rMBP-S1可結合在細胞的膜表面（黃色顯示），而對照組MBP蛋白及空白對照組細胞膜均未見綠色熒光（如圖4），只有顯示細胞膜的紅色熒光。該結果表明該重組蛋白rMBP-S1具有生物活性，能與細胞膜表面受體結合，可用于后續研究。

2.5 靶向S1蛋白適配體篩選過程中的循環數優化

本文通過磁珠法篩選核酸適配體，為提高后續篩選過中PCR的擴增效率，確保PCR反應的高效性和特異性，提高適配體篩選的準確性和可靠性，我們對篩選過程中的PCR循環數進行優化。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。通過調整每輪擴增條件，得到特異性擴增產物，各輪最優循環數如表2。

2.6 篩選進程的監測

為了監測篩選進程，采用qPCR和流式細胞術對第3（淺綠色）、7（橙色）、11（藍色）、15（紅色）輪DNA文庫的復雜程度及結合能力進行分析，qPCR結果顯示隨著篩選進行，熔鏈溫度逐漸上升并穩定在86℃（圖5A），同時表明文庫復雜程度降低，與靶標結合的序列得到富集。進一步的流式細胞術分析表明隨著篩選的進行，熒光右移（圖5B），與靶標結合的ssDNA得到富集，而且11輪與15輪之間的差異縮小，考慮在15輪結束篩選。

2.7 菌液PCR鑒定及序列測定

為了得到篩選所得的與靶標蛋白結合的序列，將第15輪PCR擴增的膠回收產物與T載體連接后轉化的DH5α感受態細胞涂板培養，挑取單菌落進行菌液鑒定，通過瓊脂糖凝膠電泳，鑒定出119個陽性克隆，將陽性菌液送往擎科生物科技公司測序，共測出111條序列，其中S1-3、S1-11重復率最高，分別為18%和16.2%，作為候選適配體進行后續試驗，其核苷酸序列見表3。

2.8 適配體親和力和特異性檢測

為了檢測篩選所得適配體與靶標蛋白結合情況及其特異性，通過ELASA試驗測定適配體與靶標蛋白結合后在OD450 nm處的吸光值。利用Prism8.0對結果進行分析，擬合曲線如圖6A、B，結果表明S1-3、S1-11核酸適配體與靶蛋白結合的Kd值分別為2.09 nmol和22.94 nmol，均在納摩爾級，表明具有較強的親和力。進一步的試驗顯示適配體S1-3不與rMBP蛋白、rMBP-gD 蛋白、rMBP-GP5蛋白以及BSA蛋白發生交叉反應，具有高特異性（圖6C）。

2.9 適配體二級結構預測及其與靶標蛋白的分子對接

利用在線軟件對適配體Apt-S1-3進行二級結構分析，結果如圖7A所示，該核酸適配體具有穩定的莖環狀和發卡狀結構，是與靶標蛋白S1-CTD蛋白結合的基礎結構。分子對接結果顯示，靶標蛋白與核酸適配體形成緊密的復合體，青色顯示靶蛋白，橙色顯示適配體，進一步分析發現靶標蛋白的氨基酸ARG207、GLN-205與核酸適配體形成了氫鍵，進而穩定適配體與靶蛋白形成的復合體，如圖7B所示。

2.10 間接免疫熒光驗證適配體與PEDV的識別

為了驗證篩選所得適配體Apt-S1-3是否能夠識別病毒，利用間接免疫熒光檢測適配體與病毒的結合情況，紅色指示PEDV病毒粒子，綠色指示FAM標記的DNA適配體。與未攻毒細胞相比，適配體Apt-S1-3與PEDV發生共定位，黃色顯示，此結果說明適配體Apt-S1-3能夠識別、結合PEDV（圖8）

2.11 流式細胞術檢測適配體抑制病毒感染細胞效果

為了確定所得適配體對病毒感染細胞的影響，將不同濃度適配體與PEDV-GFP病毒孵育1 h后感染細胞，在5%二氧化碳，37℃細胞培養箱培養過夜。熒光顯微鏡結果顯示（圖9A），隨著適配體濃度的升高，病毒的增殖受到顯著抑制，而作為對照組的隨機文庫并未表現明顯抑制效果。流式細胞術的定量結果同樣顯示（圖9B），隨著濃度增加，與隨機文庫相比，適配體對病毒的抑制效果差異顯著。

3 討 論

2010年PED在中國大面積暴發，主要以7日齡以內的哺乳仔豬極高發病率和死亡率為主要特征，2周齡以上的豬出現不同程度的腹瀉和厭食等癥狀，PEDV嚴重威脅著養豬業的健康發展，但目前仍然缺乏針對PEDV的有效疫苗［17］，因此，急需新的診斷與治療手段防控PEDV的傳播。PEDV S蛋白在宿主親和力、病毒-細胞識別、膜融合和進入中起著關鍵作用，成為抗病毒藥物研發和疫苗設計的重要靶點；S1包含S1和S2兩個亞基，其中S1亞基包含信號肽（SP）、N端結構域（NTD）、C端結構域（CTD）、亞結構域1（SD1）和亞結構域2（SD2）［18］。相關研究表明，血管緊張素轉換酶2（ACE2）［19］和二肽基肽酶4（DPP4）［20］是SARS-CoV和MERS-CoV的宿主受體，病毒的受體結合域（RBD）位于S1亞基（S1-CTDs）的C末端結構域［21］。氨肽酶N（APN）是人冠狀病毒229E（HCoV-229E）［22］和TGEV［23］的宿主受體，其RBD也位于S1-CTD中。因此，S1亞基中的S1-CTD區域在病毒與宿主細胞受體的識別和相互作用中起著關鍵作用。已有研究證實PEDV的S1-CTD區域能夠與pAPN的外結構域產生相互作用［24］，盡管隨后的研究揭示了pAPN并非豬流行性腹瀉病毒的實際功能性受體［25］，但這并不影響我們對病毒入侵機制的理解。而且在變體PEDV中，S1-CTD結構域比S1-NTD結構域更保守。因此，PEDV的 S1-CTD成為抗病毒研究的重要靶點。

核酸適配體具有無免疫原性、穩定性強，成本低等優勢，在生物醫學領域具有重要潛在價值［26］。本文通過磁珠法篩選出的一條高親和力、高特異性的核酸適配體Apt-S1-3，對其進行生物學特性分析，發現該適配體與靶標S1-CTD蛋白的結合具有高的親和力和特異性，該適配體具有具有典型的莖環和發夾結構，是適配體與靶標蛋白結合的重要結構基礎［27］。分子對接模型圖中，當聚焦于結合區域時，發現靶標蛋白的ARG207和GLN206與核酸適配體形成氫鍵，這是二者形成穩定復合物的化學基礎。與以往的研究結果一致，氫鍵在核酸適配體與靶蛋白結合過程中具有重要作用［28］，隨后又通過間接免疫熒光試驗和流式細胞術試驗證實適配體Apt-S1-3能夠識別、結合PEDV并抑制病毒感染。本研究篩選得到的DNA適配體不僅能夠特異結合PEDV的S1-CTD蛋白，還能夠識別、結合PEDV病毒粒子，可以作為檢測和治療PEDV的試劑進行開發。

目前對病毒蛋白表達主要有真核表達系統或原核表達系統。真核系統在外源蛋白翻譯后可以對外源蛋白進行加工和修飾［29］，其構象更接近于外源蛋白本身的空間結構，但其成本高于原核表達系統，表達量也比原核表達系統低［30］。雖然大腸桿菌原核表達系統具有表達量高、價格低、易于批量生產等優點，但是目前對PEDV S蛋白的原核表達主要以包涵體形式存在表達［31-32］，雖然包涵體可以經過變性、復性操作，得到正確折疊的活性蛋白，但效率一般較低，只能達到30%左右［33］。本試驗通過添加促融標簽MBP使PEDV-S1-CTD蛋白實現可溶性表達，從而容易獲得大量PEDV-S1-CTD重組蛋白，降低了生產成本。而且為S1-CTD蛋白功能性研究、抗體的制備、新型疫苗研發及新型檢測方法的建立打下基礎。

4 結 論

本研究篩選得到的DNA適配體Apt-S1-3能夠與豬流行性腹瀉病毒S1-CTD蛋白高親和力、高特異性結合，而且能夠抑制豬流行性腹瀉病毒感染細胞，為PEDV的靶向治療和檢測方法開發奠定基礎。

參考文獻（References）：

［1］ 馬茹夢， 趙玉梁， 馬明爽， 等. 不同豬源受體菌表達豬流行性腹瀉病毒保護性抗原S1誘導免疫應答的比較研究［J］. 畜牧獸醫學報， 2024， 55（5）： 2090-2099.

MA R M， ZHAO Y L， MA M S， et al. Comparative study on the immune response induced by the different porcine receptor bacteria with expressing the protective antigen S1 of porcine epidemic diarrhea virus［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2024， 55（5）： 2090-2099. （in Chinese）

［2］ JUNG K， SAIF L J. Porcine epidemic diarrhea virus infection：etiology， epidemiology， pathogenesis and immunoprophylaxis［J］. Vet J， 2015， 204（2）：134-143.

［3］ JUNG K， SAIF L J， WANG Q H. Porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）： an update on etiology， transmission， pathogenesis， and prevention and control［J］. Virus Res， 2020， 286：198045.

［4］ LI W T， LI H， LIU Y B， et al. New variants of porcine epidemic diarrhea virus， China， 2011［J］. Emerg Infect Dis， 2012， 18（8）：1350-1353.

［5］ LEE C. Porcine epidemic diarrhea virus：an emerging and re-emerging epizootic swine virus［J］. Virol J， 2015， 12：193.

［6］ ANTAS M， OLECH M， SZCZOTKA-BOCHNIARZ A. Molecular characterization of porcine epidemic diarrhoea virus （PEDV） in Poland reveals the presence of swine enteric coronavirus （SeCoV） sequence in S gene［J］. PLoS One， 2021， 16（10）：e0258318.

［7］ LI W T， VAN KUPPEVELD F J M， HE Q G， et al. Cellular entry of the porcine epidemic diarrhea virus［J］. Virus Res， 2016， 226：117-127.

［8］ VAN DIEP N， CHOIJOOKHUU N， FUKE N， et al. New tropisms of porcine epidemic diarrhoea virus （PEDV） in pigs naturally coinfected by variants bearing large deletions in the spike （S） protein and PEDVs possessing an intact S protein［J］. Transbound Emerg Dis， 2020， 67（6）：2589-2601.

［9］ LI Z W， MA Z Q， DONG L F， et al. Molecular mechanism of porcine epidemic diarrhea virus cell tropism［J］. mBio， 2022， 13（2）：e0373921.

［10］ PARK J E， CRUZ D J M， SHIN H J. Receptor-bound porcine epidemic diarrhea virus spike protein cleaved by trypsin induces membrane fusion［J］. Arch Virol， 2011， 156（10）：1749-1756.

［11］ HEALD-SARGENT T， GALLAGHER T. Ready， set， fuse！ The coronavirus spike protein and acquisition of fusion competence［J］. Viruses， 2012， 4（4）：557-580.

［12］ WHITE J M， WHITTAKER G R. Fusion of enveloped viruses in endosomes［J］. Traffic， 2016， 17（6）：593-614.

［13］ XIONG X L， TORTORICI M A， SNIJDER J， et al. Glycan shield and fusion activation of a deltacoronavirus spike glycoprotein fine-tuned for enteric infections［J］. J Virol， 2018， 92（4）：e01628-17.

［14］ SHANG J， ZHENG Y， YANG Y， et al. Cryo-electron microscopy structure of porcine deltacoronavirus spike protein in the prefusion state［J］. J Virol， 2018， 92（4）：e01556-17.

［15］ 尹寶英， 朱小甫， 鄭紅青， 等. 豬流行性腹瀉病毒逃逸宿主天然免疫研究進展［J］. 動物醫學進展， 2023， 44（10）：89-94.

YIN B Y， ZHU X F， ZHENG H Q， et al. Progress on porcine epidemic diarrhea virus escaping from host innate immunity［J］. Progress in Veterinary Medicine， 2023， 44（10）：89-94. （in Chinese）

［16］ 王 巍， 賈凌云. 適配體篩選方法研究進展［J］. 分析化學， 2009， 37（3）：454-460.

WANG W， JIA L Y. Progress in aptamer screening methods［J］. Chinese Journal of Analytical Chemistry， 2009， 37（3）：454-460. （in Chinese）

［17］ 梁雨萱， 龐勝美， 劉 梅， 等. 豬流行性腹瀉疫苗研究進展［J］. 河南農業科學， 2023， 52（8）：1-10.

LIANG Y X， PANG S M， LIU M， et al. Research progress of porcine epidemic diarrhea vaccine for pigs［J］. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2023， 52（8）：1-10. （in Chinese）

［18］ WRAPP D， MCLELLAN J S. The 3. 1-angstrom cryo-electron microscopy structure of the porcine epidemic diarrhea virus spike protein in the prefusion conformation［J］. J Virol， 2019， 93（23）：e00923-19.

［19］ LI F， LI W H， FARZAN M， et al. Structure of SARS coronavirus spike receptor-binding domain complexed with receptor［J］. Science， 2005， 309（5742）：1864-1868.

［20］ LU G W， HU Y W， WANG Q H， et al. Molecular basis of binding between novel human coronavirus MERS-CoV and its receptor CD26［J］. Nature， 2013， 500（7461）：227-231.

［21］ WANG N S， SHI X L， JIANG L W， et al. Structure of MERS-CoV spike receptor-binding domain complexed with human receptor DPP4［J］. Cell Res， 2013， 23（8）：986-993.

［22］ WONG A H M， TOMLINSON A C A， ZHOU D X， et al. Receptor-binding loops in alphacoronavirus adaptation and evolution［J］. Nat Commun， 2017， 8（1）：1735.

［23］ REGUERA J， SANTIAGO C， MUDGAL G， et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies［J］. PLoS Pathog， 2012， 8（8）：e1002859.

［24］ DENG F， YE G， LIU Q Q， et al. Identification and comparison of receptor binding characteristics of the spike protein of two porcine epidemic diarrhea virus strains［J］. Viruses， 2016， 8（3）：55.

［25］ SHIRATO K， MAEJIMA M， ISLAM MT， et al. Porcine aminopeptidase N is not a cellular receptor of porcine epidemic diarrhea virus， but promotes its infectivity via aminopeptidase activity［J］. J Gen Virol， 2016， 97（10）：2528-2539.

［26］ SILWAL A P， THENNAKOON S K S， ARYA S P， et al. DNA aptamers inhibit SARS-CoV-2 spike-protein binding to hACE2 by an RBD-independent or dependent approach［J］. Theranostics， 2022， 12（12）：5522-5536.

［27］ 李衛濱， 王開宇， 趙 猛， 等. 人FcγRI特異性核酸適配體的體外篩選及鑒定［J］. 中國生物化學與分子生物學報， 2017， 33（8）：818-825.

LI W B， WANG K Y， ZHAO M， et al. In vitro selection and identification of aptamers against human FcγRI［J］. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 2017， 33（8）：818-825. （in Chinese）

［28］ SUN M， LIU S W， WEI X Y， et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection［J］. Angew Chem Int Ed Engl， 2021， 60（18）：10266-10272.

［29］ 鄒靜嫻， 孟 慧， 潘朔楠， 等. 表達PEDV S蛋白重組仙臺病毒的構建及其免疫原性研究［J］. 揚州大學學報：農業與生命科學版， 2023， 44（4）：43-50， 67.

ZOU J X， MENG H， PAN S N， et al. Construction and immunogenicity of a recombinant Sendai virus expressing S protein of PEDV［J］. Journal of Yangzhou University： Agricultural and Life Science Edition， 2023， 44（4）：43-50， 67. （in Chinese）

［30］ 李潔森， 孫榮航， 鄺燕齊， 等. 豬流行性腹瀉病毒S1D蛋白的優化表達及其單克隆抗體的制備［J］. 中國畜牧獸醫， 2021， 48（12）：4641-4651.

LI J S， SUN R H， KUANG Y Q， et al. Optimal expression of porcine epidemic diarrhea virus S1D protein and preparation of its monoclonal antibody［J］. China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2021， 48（12）：4641-4651. （in Chinese）

［31］ 張天愛， 李婷婷， 陶曉莉， 等. 豬流行性腹瀉病毒S蛋白原核表達及多克隆抗體的制備與鑒定［J］. 中國畜牧獸醫， 2022， 49（11）：4383-4391.

ZHANG T A， LI T T， TAO X L， et al. Prokaryotic expression of porcine epidemic diarrhea virus S protein and preparation and identification of its polyclonal antibody［J］. China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2022， 49（11）：4383-4391. （in Chinese）

［32］ 柏家果， 劉思雨， 杜 琛， 等. 豬流行性腹瀉病毒S蛋白的原核表達及其多克隆抗體的制備［J］. 中國獸醫科學， 2022， 52（11）：1415-1421.

BAI J G， LIU S Y， DU C， et al. Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of spike protein of porcine epidemic diarrhea virus［J］. Chinese Veterinary Science， 2022， 52（11）：1415-1421. （in Chinese）

［33］ 郭曉輝. 豬流行性腹瀉病毒S重組蛋白的大腸桿菌表達及其免疫學評價的初步研究［D］. 沈陽：沈陽農業大學， 2023.

GUO X H. Expression and immunological evaluation of porcine epidemic diarrhea virus S recombinant protein in Escherichia coli［D］. Shenyang： Shenyang Agricultural University， 2023. （in Chinese）

（編輯 白永平）