體外對牛冠狀病毒復制具有抑制效應藏藥的篩選

摘 要：

本研究旨在篩選出對牛冠狀病毒（BCoV）體外復制具有抑制效應的藏藥。構建BCoV核衣殼（N）蛋白原核表達載體，誘導表達后將純化的蛋白分別免疫小鼠和兔，獲得鼠抗和兔抗N蛋白多克隆抗體，建立用于測定BCoV復制的Western blot和間接免疫熒光法（IFA）；水煎法獲得21種候選藏藥的水提物，CCK-8法測定水提物對人結直腸腺癌細胞（HCT-8）的最大安全濃度，以BCoV感染HCT-8細胞為研究對象，分別設置BCoV感染組、藏藥水提物處理組、利巴韋林處理組，在BCoV感染24 h后分別應用實時熒光定量PCR、Western blot、IFA測定細胞中BCoV復制量，統計分析藏藥水提物對病毒復制的抑制作用，篩選對BCoV具有顯著抑制作用的藏藥。結果顯示：分別制備鼠抗與兔抗BCoV N蛋白多克隆抗體，建立了檢測BCoV的Western blot與IFA方法；21種藏藥中的15種具有顯著抑制BCoV復制效應（P＜0.01），其中青藏大戟、訶子、瑞香狼毒3種藏藥對BCoV復制的抑制作用優于利巴韋林。本研究篩選到15種對BCoV體外復制具有抑制效應的藏藥，其中青藏大戟、訶子、瑞香狼毒3種藏藥抑制作用效果顯著，為BCoV防治藥物的開發奠定了基礎。

關鍵詞：

牛冠狀病毒；核衣殼蛋白；多克隆抗體；藏藥；病毒復制

中圖分類號：S852.659.6;S85331

文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0826-13

收稿日期：2024-04-02

基金項目：西藏自治區科技計劃項目（XZ202101YD0001C）；寧夏回族自治區重點研發計劃（2021BEF03005）；青海省科技計劃項目（2022-NK-118）

作者簡介：趙 龍（1994-），男，四川德陽人，博士生，主要從事動物疫病致病機制和防控技術研究，E-mail：448069517@qq.com

*通信作者：郭抗抗，主要從事動物疫病致病機制和防控技術研究，E-mail：guokk2007@nwsuaf.edu.cn；李生慶，主要從事高原動物疫病診斷與防控技術研究，E-mail：lsq.8008@163.com

In vitro Screening of Tibetan Medicine with Inhibitory Effects on Bovine Coronavirus

Replication

ZHAO" Long1， LIN" Jingyi1， DOU" Wei1， XU" Tingxuan1， GU" Qingyun2， GAO" Haihui1， 3， LI" Shengqing4*， GUO" Kangkang1*

（1.College of Veterinary Medicine， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi 712100，" China;

2.Tibet Veterinary Medicine Key Laboratory of Xizang Vocational and Technical College， Lhasa， Tibet 850030，" China;

3.Institute of Animal Science， Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan， Ningxia 750002，" China;

4.Qinghai Academy of Animal and Veterinary Sciences， Xining， Qinghai 810016，" China）

Abstract：

This study was aimed at screening Tibetan medicines exerting inhibitory effects on the in vitro replication of Bovine coronavirus （BCoV）. To achieve this， a prokaryotic expression vector encoding the BCoV nucleocapsid （N） protein was constructed. Following induced expression， the purified N protein was used to immunize mice and rabbits， resulting in the production of mouse anti-N protein polyclonal antibodies and rabbit anti-N protein antibodies. Western blot and indirect immunofluorescence assay （IFA） techniques were subsequently developed to assess BCoV replication. The water extract of 21 candidate Tibetan medicines was obtained by water decoction method. The maximum safe concentration of water extract on human colorectal adenocarcinoma cells （HCT-8） was determined by CCK-8. HCT-8 cells infected with BCoV were used as the research object， and BCoV infection group， Tibetan medicine water extract treatment group and ribavirin treatment group were set up respectively. After 24 h of BCoV infection， real-time fluorescence quantitative PCR， Western blot and IFA were used to determine the replication of BCoV in cells. The inhibitory effect of Tibetan medicine on virus replication was statistically analyzed， and Tibetan medicine with significant inhibitory effect on BCoV was screened. The polyclonal antibodies of mouse anti-BCoV N protein and rabbit anti-BCoV N protein were prepared respectively， and the Western blot and IFA methods for detecting BCoV were established. Among the 21 Tibetan medicines， 15 had significant inhibitory effects on BCoV replication （Plt;0.01）. Among them， the inhibitory effects of three Tibetan medicines， Euphorbia altotibetica Paulsen， Terminalia chebula Retz.， and Stellera chamaejasme L. on BCoV replication were better than those of ribavirin. In this study， 15 Tibetan medicines with inhibitory effects on BCoV replication in vitro were screened. Among them， three Tibetan medicines， Euphorbia altotibetica Paulsen， Terminalia chebula Retz.， and Stellera chamaejasme L. had significant inhibitory effects， which laid a foundation for the development of BCoV prevention and treatment drugs.

Key words：

bovine coronavirus; N protein; polyclonal antibody; Tibetan medicine; viral replication

*Corresponding authors：" GUO Kangkang， E-mail： guokk2007@nwsuaf.edu.cn; LI Shengqing， E-mail： lsq.8008@163.com

牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）廣泛流行于我國各地區的不同牛群中［1-2］。該病毒主要引起犢牛腹瀉或呼吸道病癥，還可引起成年牛冬季痢疾［3］。病牛可長期帶毒排毒，引發大規模感染，導致犢牛發育遲緩，飼料利用率降低，給養牛業造成嚴重的經濟損失［4］。BCoV是單股正鏈RNA病毒，具有5種結構蛋白：纖突蛋白（S蛋白）、血凝素酯酶蛋白（HE蛋白）、小衣殼蛋白（E蛋白）、跨膜蛋白（M蛋白）以及核衣殼蛋白（N蛋白）［5］。N蛋白是病毒編碼蛋白中表達量最高的蛋白［6］，并且高度保守，具有良好的免疫原性，是冠狀病毒診斷與抗體制備的主要靶標［7-9］。對于BCoV感染的防治目前暫無有效藥物，制備相關抗體對開展抗BCoV藥物的研究具有重要意義。

篩選、鑒定抗病毒天然產物是近些年來研究熱點，藏藥是發源于青藏高原的古老民族藥，藥物種類繁多，資源豐富，也是開發新型抗病毒、抗菌新產品的重要研究對象。有大量的臨床實踐證明藏藥在預防和治療病毒性疾病方面具有顯著的療效［10］，有研究發現藏藥訶子提取物對單純皰疹病毒（HSV）、人免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）等病毒均具有較好的體外抑制作用［11-13］；甘青烏頭提取物對HSV和BVDV具有體外抑制作用［12，14］；矮紫堇提取物對BVDV也有較好的體外抑制作用［12］。這些研究說明，從藏藥中篩選抗病毒物質具有可行性和良好前景。目前國內暫無可用于防治BCoV的特效藥物或疫苗，臨床上大多使用抗生素治療防止繼發感染，導致細菌耐藥性日益嚴重。隨著我國“禁抗減抗”政策施行，迫切需要從傳統藏藥中開發出新的可用于畜牧業的天然、綠色、高效抗病毒天然產物［15］。本研究團隊近年來在寧夏、青海等地腹瀉牛主要病原檢測中發現BCoV的檢出率平均達到50%左右，部分區域甚至可以達到70%左右，提示BCoV在誘導犢牛腹瀉中具有重要作用。在前期研究中發現部分藏藥水提物在體外對BCoV的復制具有抑制作用，為此開展了抗BCoV藏藥的篩選研究。本研究基于前期初選的21種藏藥，對其體外抑制BCoV復制作用進行研究，以期篩選到對BCoV復制具有顯著抑制效應的藏藥，為下一步抗病毒藏藥篩選及產品的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物、細胞、病毒等

新西蘭大白兔2只、SPF昆明小鼠5只（18～22g）由西北農林科技大學實驗動物中心提供，動物試驗經西北農林科技大學實驗動物倫理審查委員會審核通過（XN2021-0601）；HCT-8傳代細胞系、BCoV毒株（105.50 TCID50·mL-1）由西北農林科技大學動物醫學院獸醫公共衛生與畜禽產品安全實驗室分離鑒定并命名保存（GenBank： OP866727.1），HCT-8傳代細胞系也由該實驗室保存并提供；大腸桿菌（E. coli）BL21 （DE3）感受態細胞購于擎科生物有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑AG RNAex Pro Reagent、Evo M-MLV反轉錄試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS購自艾科瑞生物公司；高保真Taq 酶Prime STARMax DNA Polymerase購自TaKaRa生物有限公司；XhoⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶購自NEB（北京）有限公司；HRP-linked Antibody、FITC熒光標記IgG購自Cell Signaling Technology（CST）公司；佐劑購自麥克林公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清（FBS）購自賽澳美細胞技術有限公司；Anti-His Tag Monoclonal Antibody、Ni-TED Beads 6FF重力柱、利巴韋林標準品（貨號：SR8570）、pET-28a原核表達質粒購自北京索萊寶科技有限公司；鼠抗GAPDH抗體購買自武漢三鷹生物技術有限公司；蛋白超濾濃縮管購自Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒購自ZHHC公司；CCK-8細胞增殖毒性檢測試劑盒購買于米鼠生物科技公司。超聲細胞破碎儀購于寧波新芝生物科技股份有限公司；凝膠成像系統Doc2000與蛋白質電泳儀購于Bio-Rad公司；基因擴增儀購于Applied Biosystem公司；熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司。

1.1.3 藏藥

藏藥瑞香狼毒、五脈綠絨蒿、長松蘿、盤花垂頭菊、青藏大戟、烏奴龍膽、獨一味、甘青烏頭、矮紫堇、螃蟹甲、甘青青蘭、綠蘿花、蒺藜、鐵棒錘、余甘子、川西獐牙菜、短穗兔耳草、藍花荊芥、訶子、藏木香、虎耳草，共21種，采購自拉薩市西藏睿俊芳生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 BCoV N蛋白多克隆抗體制備

1.2.1.1 N基因原核表達質粒構建：

以BCoV cattle_F226/2021毒株基因組（GenBank登錄號： OP866727.1）為參考，使用Primer Premier 5.0設計引物擴增完整N基因（1344 bp），引物分別帶有酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ（下劃線處），由西安擎科生物有限公司進行合成。引物序列為BCN-EcoRⅠ： CCGGAATTCATGTCTTTTACTCCTGGTAAG，BCN-XhoⅠ： CCGCTCGAGTATTTCTGAGGTGTCTTC-AGT。根據RNA提取試劑盒與RNA反轉錄試劑盒說明書提取BCoV病毒總RNA并制備成cDNA用于擴增N基因。按照高保真Taq 酶Prime STARMax DNA Polymerase說明書反應程序與體系擴增N基因。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后使用膠回收試劑盒進行PCR產物回收。參照XhoⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶說明書將PCR產物與pET-28a原核表達載體的質粒分別進行雙酶切后連接，連接產物轉化至E. coli BL21 （DE3）感受態細胞，培養后挑取單克隆菌落進行PCR、雙酶切和測序鑒定。

1.2.1.2 重組N蛋白的表達與純化：

將鑒定正確的重組表達菌液培養至OD值為0.6，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG在37℃，220 r·min-1的條件下培養誘導6 h后4000 r·min-1離心10 min，棄上清收集菌體，適量PBS重懸超聲破碎，12 000 r·min-1離心15 min后收集上清和沉淀（包涵體）。上清與沉淀經SDS-PAGE電泳后轉印至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次后加入Anti-His抗體（1∶4 000）室溫孵育2 h，洗膜后加入HRP標記二抗室溫孵育1 h，洗膜后加顯色液使用蛋白凝膠成像系統進行印跡分析。根據Ni-TED Beads 6FF說明書采用鎳柱親和層析法純化重組N蛋白。將純化后的重組N蛋白轉入超濾離心管，4 000 r·min-1，4℃離心至濃縮液體積為1 mL，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測濃度。

1.2.1.3 重組N蛋白多克隆抗體制備：

將濃縮后的重組N蛋白與佐劑乳化。新西蘭大白兔與昆明小鼠采取背部皮下分點注射免疫4次，首免為弗氏完全佐劑，剩余3次免疫均為弗氏不完全佐劑。首次免疫后14、24、34 d進行免疫，每次免疫劑量新西蘭大白兔為300 μg·只-1，小鼠為50 μg·只-1，最后一次免疫結束后10 d采集動物血清。

1.2.1.4 Western blot鑒定N蛋白多克隆抗體：

將HCT-8細胞接種于12孔板，常規培養至細胞貼壁生長至80%，接種BCoV cattle_F226/2021毒株（MOI=1）后置于37℃，5% CO2細胞培養箱中培養12、24、36、48 h。收集細胞后加入200 μL RIPA（含1% PSMF）冰上裂解細胞30 min，12 000 r·min-1，4℃離心15 min取上清制備細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉印至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次后分別加入鼠抗N蛋白多克隆抗體（1∶12 000）、兔抗N蛋白多克隆抗體（1∶4 000）、GAPDH抗體（1∶12 000），室溫孵育2 h，洗膜后加入抗鼠或抗兔HRP標記二抗室溫孵育1 h，洗膜后加顯色液使用蛋白凝膠成像系統進行印跡分析。

1.2.1.5 IFA鑒定N蛋白多克隆抗體：

HCT-8細胞接種病毒24 h后經5%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次后加入0.5% Triton-100室溫穿透15 min，加入5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，洗板后加入鼠抗N蛋白多克隆抗體（1∶100）或兔抗N蛋白多克隆抗體（1∶100）室溫孵育1 h，洗板后加入抗兔或抗鼠FITC熒光標記抗體（1∶500）孵育1 h，洗板后加入10 μg·mL-1 DAPI染核10 min，洗板后觀察熒光。

1.2.2 抗BCoV藏藥體外篩選

1.2.2.1 藏藥水提取物的制備與稀釋：

采用傳統水煎法提取藏藥有效成分。將藏藥取50 g粉碎后加入500 mL去離子水于4 ℃浸泡12 h，轉入砂鍋中大火煮沸，然后用文火煎煮1 h，用4層紗布過濾，收集濾液，重復3次后混合濾液，以5 000 r·min-1離心10 min，取上清液真空干燥制成干粉后密封，4℃避光保存。根據各種藏藥水提物干燥粉末的物理狀態，選擇不同體積DMEM培養基進行溶解，以此為原始濃度進行倍比梯度稀釋。稀釋后的藥液經0.45 μm濾器過濾，4℃避光保存備用。

1.2.2.2 藥物對HCT-8細胞最大安全濃度測定：

HCT-8細胞常規培養接種于96孔板，生長至單層細胞后加入不同稀釋梯度藥物，每孔100 μL，每個稀釋度設8個復孔，同時設立正常細胞和無細胞對照，待細胞病變不再繼續時，用PBS液洗板3次，每孔加入10% CCK-8后將96孔板在細胞培養箱中繼續培養1 h，使用酶標儀測定波長為450 nm處OD值，根據公式計算細胞的存活率。細胞存活率=［ （As-Ab） / （Ac-Ab） ］ × 100%，As=加藥組OD值，Ab=無細胞組OD值，Ac=正常細胞組OD值。90%以上的細胞存活的藥物濃度為最大安全濃度。

1.2.2.3 抑制病毒藏藥體外篩選試驗設計：

將HCT-8細胞常規培養接種于12孔板，細胞貼壁生長至80%密度后棄去培養液，洗板后加入安全濃度的藥物置于37℃，5% CO2細胞培養箱中預處理1 h，同時取BCoV cattle_F226/2021毒株等體積與藥物混合，置于細胞培養箱中滅活處理1 h，使得藥物終濃度為最大安全濃度，病毒MOI=0.1。隨后將滅活處理后的病毒混合物接種預處理細胞置于細胞培養箱中孵育1 h后棄去病毒液，加入含最大安全濃度藥物培養基繼續培養24 h后收集細胞樣本，用于測定藏藥的抑制病毒復制效應。同時設置利巴韋林治療組、未用藥組（BCoV組），每組設置3個重復孔。

1.2.2.4 藏藥抑制胞內BCoV增殖測定：

使用本研究制備的多克隆抗體按照“1.2.1.4”與“1.2.1.5”進行Western blot與IFA檢測藥物處理后胞內病毒增殖感染情況，并使用熒光定量PCR對胞內病毒N相對表達量進行測定。根據SYBR Green Pro Taq HS說明書反應程序與體系，以BCoV N基因為靶基因設計引物：N-F：CGTTCTGGTAATGGCATCCTTA，N-R：GTTTGCTTGGGTTGAGC-TCTTCTA；以GAPDH作為內參基因設計引物：AAGGCTGTGGGCAAGG，GAPDH-R：TGGAGGAGTGGGTGTCG。

1.2.2.5 藏藥對病毒滴度影響測定：

將BCoV（MOI=0.1）接種于常規培養的12孔板HCT-8細胞，置于細胞培養箱1 h后棄去病毒液，使用PBS清洗3次，加入含最大安全濃度藥物培養基，培養24 h后收集細胞培養上清，測定上清液中病毒滴度。同時設置利巴韋林治療組、未用藥組（BCoV組），每組設置3個重復孔。對細胞培養上清液中的病毒使用96孔培養板進行滴度測定，使用本研究制備的多克隆抗體，參照“1.2.1.5” IFA進行病毒陽性感染孔判定，按照Reed-Muench氏法計算病毒TCID50。

1.2.3 數據統計與分析

采用2-ΔΔCt法計算胞內病毒N基因的相對表達量；使用GraphPad Prism 8.02進行統計學分析與制圖；使用ImageJ對蛋白質印跡進行灰度值分析。數據以均數±標準差表示，采用Student’s t檢驗進行各組的差異顯著性分析：*. Plt;0.05，**. Plt;0.01，***. Plt;0.001，ns 表示無統計學意義。

2 結 果

2.1 BCoV N基因的擴增及重組質粒構建

使用特異性引物對N基因進行擴增，擴增產物經電泳鑒定出目的條帶與預期的1 344 bp一致（圖1A）。將PCR產物與pET-28a質粒分別進行雙酶切，連接構建pET-28a-BCoV-N重組原核表達載體，將構建完成的pET-28a-BCoV-N載體成功轉化至E. coli BL21（DE3）感受態細胞，挑取單菌落進行PCR鑒定（圖1B）。菌液質粒經EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切后pET-28a-BCoV-N載體較小目的條帶與預期1 344 bp一致，較大目的條帶與pET-28a 載體片段大小吻合（圖1C），測序比對顯示序列無突變，成功構建了BCoV N基因原核表達載體。

2.2 重組N蛋白表達及其多克隆抗體鑒定

將菌液以0.5 mmol·L-1的IPTG誘導6 h后，使用His標簽抗體在破碎菌體的上清與沉淀中均鑒定出重組N蛋白正確表達（圖2A）。由于上清中的可溶性蛋白具有更好的生物活性，因此選擇上清中的可溶性蛋白進行后續試驗。將破碎菌體上清通過鎳柱親和層析法純化出重組N蛋白，SDS-PAGE結果顯示，在0.1 mol·L-1咪唑洗脫液位置出現單一目的蛋白條帶，與預期60 ku相符（圖2B）。純化后的重組N蛋白濃縮后經BCA試劑盒測定蛋白濃度為0.68 mg·mL-1。

Western blot結果表明，免疫兔與小鼠制備的重組N蛋白多克隆抗體均可有效識別BCoV感染HCT-8細胞中表達的天然N蛋白，并且在感染后12～48 h，N蛋白表達量隨時間逐漸增加（圖2C）；同時IFA結果表明，在BCoV感染24 h后的細胞內能觀察到綠色的病毒特異性熒光（圖2D），說明制備的鼠源和兔源抗體均能有效識別病毒感染過程中表達的N蛋白。表明制備的鼠源和兔源N蛋白多克隆抗體具有良好的反應性，可用于后續抗病毒藥物的篩選。

2.3 藏藥對HCT-8細胞最大安全濃度測定

21種藏藥水提物經濃縮干燥后，所得干粉重量為9.32～18.39 g（表1）。根據不同藥物粉末狀態稀釋得到不同藥物初始濃度，使用CCK-8測得每種藥物在HCT-8細胞上的最大安全濃度為0.024～111.61 mg·mL-1，詳見圖3。

2.4 藏藥抑制病毒基因轉錄測定

實時熒光定量PCR結果表明，在21種藏藥的最大安全濃度作用下，余甘子、綠蘿花、烏奴龍膽、訶子、藏木香、青藏大戟、藍花荊芥、瑞香狼毒共8種藏藥以及利巴韋林組病毒N基因相對轉錄水平極顯著低于BCoV感染組（P＜0.01）（圖4），各組N基因轉錄水平依次為：青藏大戟＜瑞香狼毒＜利巴韋林＜訶子＜綠蘿花＜藏木香＜余甘子＜藍花荊芥＜烏奴龍膽＜BCoV感染組。其中青藏大戟、瑞香狼毒對病毒基因轉錄抑制作用優于利巴韋林。

2.5 藏藥抑制病毒蛋白表達測定

進一步對胞內病毒N蛋白表達的Western blot測定結果表明，在21種藏藥的最大安全濃度作用下，余甘子、綠蘿花、烏奴龍膽、訶子、青藏大戟、藍花荊芥、瑞香狼毒、甘青烏頭、矮紫堇、盤花垂頭菊、五脈綠絨蒿共11種藏藥以及利巴韋林組病毒N蛋白表達量極顯著低于BCoV感染組（P＜0.01）（圖5）。余甘子、綠蘿花、烏奴龍膽、訶子、青藏大戟、藍花荊芥、瑞香狼毒對病毒蛋白表達抑制作用與基因轉錄結果一致。藏木香處理組N蛋白表達量也略低于BCoV感染組，但無顯著性差異。甘青烏頭、矮紫堇、盤花垂頭菊、五脈綠絨蒿對病毒基因轉錄無抑制作用，但對病毒蛋白的表達卻表現出顯著的抑制作用。各組N蛋白表達量依次為：瑞香狼毒＜青藏大戟＜訶子＜烏奴龍膽＜利巴韋林＜五脈綠絨蒿＜藍花荊芥＜甘青烏頭＜矮紫堇＜余甘子＜綠蘿花＜盤花垂頭菊＜BCoV感染組。其中瑞香狼毒、青藏大戟、訶子、烏奴龍膽對病毒N蛋白表達的抑制作用優于利巴韋林。

2.6 藏藥抑制病毒滴度測定

在21種藏藥的最大安全濃度作用下，余甘子、綠蘿花、烏奴龍膽、訶子、甘青青蘭、藏木香、青藏大戟、瑞香狼毒、甘青烏頭、矮紫堇、短穗兔耳草共11種藏藥以及利巴韋林組病毒滴度極顯著低于BCoV感染組（P＜0.01）（圖6），各組病毒滴度依次為：青藏大戟＜訶子＜瑞香狼毒＜利巴韋林＜甘青烏頭＜藏木香＜烏奴龍膽＜矮紫堇＜綠蘿花＜甘青青蘭＜余甘子＜短穗兔耳草＜BCoV感染組，其中青藏大戟、訶子、瑞香狼毒對病毒滴度抑制作用優于利巴韋林。

綜上可知，本研究成功從21種藏藥種篩選出余甘子、綠蘿花、烏奴龍膽、訶子、甘青青蘭、藏木香、青藏大戟、瑞香狼毒、甘青烏頭、矮紫堇、藍花荊芥、短穗兔耳草、甘青烏頭、盤花垂頭菊、五脈綠絨蒿共15種藏藥水提物具有極顯著抑制BCoV復制效應（P＜0.01），而鐵棒錘、虎耳草、螃蟹甲、川西獐牙菜、長松蘿、蒺藜6種藏藥未表現出抑制作用，其中青藏大戟、訶子、瑞香狼毒這3種藏藥在抑制BCoV N蛋白表達以及降低病毒滴度效果均優于利巴韋林，表明這3種藏藥抑制病毒復制作用最為顯著。

3 討 論

BCoV與當前全球流行的SARS-CoV-2均屬于 β 冠狀病毒屬成員，由于生物安全限制SARS-CoV-2病原培養，因此BCoV是用于替代SARS-CoV-2篩選抗冠狀病毒藥物的理想模型［16-18］。但目前可用于藥物篩選的BCoV商品抗體較少，極大地限制了BCoV作為模式病毒的研究。因此，鑒于N蛋白的高保守性和良好的免疫原性，本研究選擇N蛋白為靶標成功表達了可溶性重組N蛋白，試驗結果證實了該重組蛋白具有良好的生物活性，值得進一步用于ELISA診斷試劑盒的研發。隨后我們成功制備了N蛋白多克隆抗體，Western blot與IFA鑒定表明兩種不同來源的動物抗體均具特異性結合BCoV N蛋白，但免疫昆明小鼠獲得的多克隆抗體稀釋比更高，這可能是由于免疫劑量與不同物種差異所致［19］，本研究制備的N蛋白多克隆抗體為BCoV的基礎研究以及抗病毒藥物篩選提供了重要的基礎材料。

病毒性感染引起的傳染病因具有種類繁多、傳染性強、病死率高、變異速度快等特點，一直持續威脅著人體健康及養殖業的發展。例如由SARS-CoV-2引起的新型冠狀病毒肺炎［20］、非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的非洲豬瘟等［21］，均造成巨大的經濟損失。由于畜牧業疫苗研發欠缺和抗病毒藥物使用限制，許多病毒性疫病仍缺乏有效的預防措施和治療藥物［22-24］，因此迫切需要尋找和開發可用于畜牧養殖業中高效、低毒、抗耐藥性的抗病毒藥物。本研究以BCoV為靶標病原，使用制備的多克隆抗體對病毒的增殖情況進行測定，對病毒基因表達、蛋白表達、病毒滴度3個方面進行測定，選擇21種價格低廉且具有抗病毒潛力的藏藥，成功篩選出15種藏藥水提物對BCoV復制具有抑制效應，其中訶子、矮紫堇、甘青烏頭的抑制作用與王丹陽等［12］的研究結果一致，余甘子的抑制作用與吉守祥等［25］研究結果一致，進一步證實了這些藏藥對病毒復制的抑制作用。并且青藏大戟、訶子、瑞香狼毒這3種藏藥在體外抑制BCoV N蛋白表達以及降低病毒滴度效果均優于利巴韋林，值得進一步開展臨床靶動物體內抗病毒作用測定，為新型抗病毒藏藥的研發提供參考。

本研采取傳統水煎法對藏藥進行提取，水煎法操作簡單，成本低，但有效成分提取率相對較低［26］，用水煎法得到的水提物并不能代表藏藥的全部有效成分［27］。此外，本研究在藥物篩選的試驗設計中包含了藥物對病毒的直接殺滅作用、藥物對宿主細胞影響、以及藥物對病毒復制周期的影響測定，適用于抗病毒藥物大量初步篩選。后續將進一步對藏藥提取工藝以及對抑制病毒復制機制進一步研究，從而挖掘出更多具有抗病毒潛力的藏藥。

4 結 論

本研究篩選出15種對BCoV體外復制具有極顯著抑制效應的藏藥，其中青藏大戟、訶子、瑞香狼毒這3種藏藥抑制作用最佳，可作為開發防治BCoV感染的候選藥物。

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