貓傳染性腹膜炎病毒mRNA疫苗轉錄載體的構建與鑒定

摘 要：

本研究旨在設計貓傳染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，FIPV）mRNA疫苗體外轉錄載體，并評估其轉錄出的FIPV mRNA疫苗的免疫原性。選取FIPV的核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白，通過序列優化，結合CureVac mRNA技術平臺，選擇合適的非編碼序列、信號肽序列和poly A尾部。將構建完成的目的序列克隆到pBluescript II KS（+）載體上，經過載體的線性化單酶切后，在體外進行轉錄，合成編碼FIPV N 基因的mRNA，并經過加帽、純化和瓊脂糖凝膠電泳分析。通過體外轉染試驗驗證抗原蛋白在細胞內的表達情況。在小鼠體內接種FIPV N-mRNA疫苗后，檢測其體液免疫和細胞免疫反應。瓊脂糖凝膠試驗表明，設計的mRNA體外轉錄載體成功制備出穩定單一的mRNA序列。轉染進細胞后，可在12～24 h內穩定表達目標抗原蛋白。ELISA試驗結果顯示FIPV N-mRNA疫苗在小鼠體內引起了強烈的體液免疫反應，其特異性抗體、IL-4、TNF-α水平明顯高于對照組。Elispot試驗結果顯示FIPV N-mRNA組脾細胞分泌的IFN-γ的含量顯著高于對照組。以FIPV N蛋白為抗原的體外轉錄載體所轉錄的mRNA疫苗，在細胞內能夠高效表達目的蛋白，具有良好的免疫原性，有效引起小鼠的體液免疫和細胞免疫反應。FIPV N-mRNA疫苗有望成為貓傳染性腹膜炎的潛在候選疫苗，mRNA體外轉錄載體的制備為傳染性疾病mRNA疫苗的設計與研發提供了重要的參考價值。

關鍵詞：

貓傳染性腹膜炎；貓傳染性腹膜炎病毒N蛋白；mRNA疫苗；體外轉錄載體

中圖分類號：

R318 """"文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0803-11

收稿日期：2024-04-01

作者簡介：盧 娜（1997-），女，漢族，安徽界首人，碩士，主要從事冠狀病毒mRNA疫苗及遞送載體的研究，E-mail：lunar@stu.cqmu.edu.cn

*通信作者： 羅忠禮，教授，主要從事納米生物醫學、創傷修復、組織工程、特種醫學、膜蛋白穩定及晶體解析研究，E-mail：Zhongli luo@163.com

Construction and Characterization of Transcription Vectors for Feline Infectious Peritonitis Virus mRNA Vaccines

LU" Na， GAO" Yu， ZHAO" Jiawei， SU" Di， CHEN" Jialei， LUO" Zhongli*

（College of Basic Medical Sciences， Molecular Medicine and Cancer Research Center， Chongqing Medical University， Chongqing 400016，" China）

Abstract：

This study aimed to design an mRNA vaccine vector for feline infectious peritonitis virus （FIPV） and evaluate the immunogenicity of the transcribed FIPV mRNA vaccines. The nucleocapsid （N） protein of FIPV was selected， and its sequence was optimized， Using CureVac′s mRNA technology platform， appropriate non-coding sequence， signal peptide sequences， and poly A tails were chosen. The synthesized target sequence was cloned into the pBluescript II KS（+） vector， linearized by a single enzyme digestion， and transcribed in vitro to synthesize mRNA encoding the FIPV N gene. The transcribed mRNA sequence was capped， purified， and analyzed by agarose gel electrophoresis. In vitro transfection assays were used to verify the expression of antigen proteins in cells. Subsequently， mice were immunized with the FIPV N-mRNA vaccine and their humoral and cellular immune responses were assessed. Agarose gel electrophoresis confirmed the successful preparation of a stable single mRNA sequence using the designed mRNA transcription vector. After transfection into cells， the target antigen protein could be expressed stably within 12-24 hours. ELISA results showed a robust humoral immune response to the FIPV N-mRNA vaccine in mice， with significantly higher levels of specific antibodies， IL-4， and TNF-α compared to the control groups. Elispot assay results demonstrated significantly higher levels of IFN-γ secreted by spleen cells in the FIPV N-mRNA group compared to the control groups. The mRNA vaccine transcribed by the vector targeting the FIPV N protein efficiently expressrs the desired protein in cells and exhibits good immunogenicity， eliciting both humoral and cellular immune response in mice. The FIPV N-mRNA vaccine may be a preparation of mRNA transcription vector provides important reference value for the design and development of mRNA vaccines against infectious diseases.

Key words：

feline infectious peritonitis virus; nucleocapsid protein; mRNA vaccines; in vitro transcription vectors

*Corresponding author：" LUO Zhongli， E-mail： Zhongli luo@163.com

貓傳染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，FIPV）是一種單股正鏈RNA冠狀病毒［1］，能引起貓群中高致死率的傳染病，可在貓任何年齡階段被感染發病［1］。通常情況下，病毒在患貓中反復感染，會導致病毒基因獲得持續性突變，從而引發患貓全身炎癥反應，其特征性病變為滲出性肉芽腫［2］。目前針對貓傳染性腹膜炎（feline infectious peritonitis， FIP）尚無安全有效、統一的治療方法，多數治療方案側重于對癥治療和減輕炎癥。盡管多種抗病毒藥物，如：GC376、GS-441524、貓ω感染素被使用治療FIP，但由于用藥量不規范，用藥效果并不理想［1，3］。

因此，當前的研究熱點集中在貓傳染性腹膜炎的預防上，早在1990年，針對FIPV的減毒疫苗—Primucell FIP被研發出來，但在后續的市場驗證中，該疫苗的保護性存在很大的爭議［4］。因此該疫苗并不被推薦使用［5］。后續的研究發現，刺突蛋白（spike protein， SP）的單克隆抗體能夠介導機體引起嚴重的抗體依賴增強效應（antibody-dependent potentiating effects，ADE）［6-7］。兩種重組亞單位疫苗PBFIPV-DF-2和PBFIPV-DF-2-R3i僅能引起部分保護作用，均會導致ADE效應的產生，這使得安全有效的FIPV疫苗的研發面臨著巨大的挑戰［8］。對ADE機制的研究表明，IgG的Fc段與白細胞表面的Fcγ受體相互作用，病毒與IgG形成免疫復合物，促進了病毒附著于白細胞表面，加速病毒內吞過程，導致病毒感染的增強［9］。后續感染中，機體所觸發的細胞免疫是病毒ADE效應的重要平衡因素［2］。mRNA疫苗已經被證明可誘發強大的細胞免疫，近期的研究表明，貓傳染性腹膜炎病毒的核衣殼蛋白能夠有效誘導貓的細胞免疫水平，且在貓中不會產生ADE［10-11］。

因此本研究基于mRNA疫苗平臺技術［12-14］，根據mRNA序列設計要求，選擇了FIPV N蛋白基因序列作為抗原，并構建了mRNA體外轉錄的載體，驗證了體外轉錄載體制備出mRNA，在細胞內表達目的蛋白的情況，并評估了FIPV N-mRNA疫苗在小鼠體內的免疫原性。這些數據為FIP疫苗的開發提供了基礎。同時，mRNA體外轉錄載體的構建也為傳染性疾病mRNA疫苗的設計和制備提供了一定的思路和參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、載體、主要試劑

293T 細胞、pUC57-EGFP質粒由本實驗室常規保存以確保其正常和可用性，快速性限制性核酸內切酶SacⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、FIPV N特異性單克隆抗體、T4 DNA Ligase、Lipofectamine 3000轉染試劑和LiCl等實驗試劑產品均購自上海賽默飛世爾科技有限公司，NEB公司的產品試劑盒有：HiScribeTM T7 高產量優化 RNA Synthesis Kit、Vaccinia Capping System和mRNA Cap 2′-O-甲基轉移酶試劑盒。DNA膠純化回收試劑盒，無內毒素的質粒大提試劑盒，普通DNA純化試劑盒選購自北京天根生化科技有限公司，HRP-Goat Anti-Rabbit IgG抗體，FITC-Goat Anti-Rabbit IgG抗體和大腸桿菌TOP10感受態細胞購自上海生工生物工程有限公司，2×Es Taq MasterMix （Dye）試劑購自康寧生物技術康寧生物科技公司，BeyoECL Plus和5 × SDS-PAGE Sample Loading Buffe和DAPI染液采購于Shanghai Biotechnology。GoldenTran-mV動物活體轉染試劑購買自長春金傳科技有限公司，小鼠貓傳染性腹膜炎核衣殼蛋白抗體ELISA試劑盒、小鼠IL-4 ELISA試劑盒、小鼠TNF-α ELISA試劑盒均購買自江蘇酶免實業有限公司，小鼠IFN-γ Elispot試劑盒選購于深圳市達科維生物技術股份有限公司。

1.1.2 實驗動物

本試驗所用的BALB/c小鼠購買自重慶醫科大學實驗動物中心，并交由重慶醫科大學實驗動物中心在最佳環境下進行飼養。動物實驗的設計方案和實驗操作經過重慶醫科大學倫理委員會審批同意（動物實驗倫理批準編號：IACUC-CQMU-2024-0106）

1.1.3 引物序列的設計與合成

參考pUC57-EGFP基因序列，使用Primer 5軟件設計一對EGFP引物，并在EGFP-F的5′端EGFP-R的3′端分別添加EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點，引物的序列詳見表1，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成后的引物配制為10 μmol·L-1的濃度。

1.2 試驗方法

1.2.1 mRNA體外轉錄載體的設計及制備

根據CureVac的mRNA技術平臺［15］設計mRNA體外轉錄載體，FIPV N的基因序列來自于GenBank（登錄號為：NC_002306.3）選取FIPV N基因的CDS區，進行人源性密碼子的優化，EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點被添加在基因序列兩端，并在EcoRⅠ序列端別添加HSD17B4的5′UTR序列和IgE信號肽序列，HindⅢ序列端添加PSMB3的3′UTR序列和120 bp長度的ployA序列，將設計好的序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成后直接插入pBluescript II KS（+）載體的SacⅠ和XhoⅠ酶切位點之間，構建pBluescript II KS（+）-FIPV N重組質粒。

1.2.2 報告基因EGFP的PCR擴增、雙酶切、純化與鑒定

參照2 × Es Taq MasterMix （Dye）試劑說明書，以pUC57-EGFP質粒為模板配制合適的PCR反應體系，PCR反應儀參數設置：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，熱循環次數為30次。使用內切酶 EcoRⅠ 和 HindⅢ 雙酶切EGFP基因，酶切后的經過DNA純化試劑盒進行產物的純化，純化的產物經1%的瓊脂糖凝膠120 V電泳50 min凝膠曝光檢測擴增和純化結果。

1.2.3 重組質粒pBluescript II KS（+）-EGFP的構建及鑒定

使用 EcoRⅠ 和 HindⅢ內切酶雙酶切 pBluescript II KS（+）-FIPV N重組質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，膠回收mRNA體外轉錄載體，T4 DNA連接酶將上述中的EGFP基因連接到mRNA體外轉錄載體上，連接后的產物轉化至TOP10感受態細胞內，涂板后挑取單克隆至含有氨芐青霉素的LB菌液內培養，并將菌液送去北京擎科生物科技有限公司測序，測序正確的菌液和培養基按照1∶1 000的比例擴大培養。

1.2.4 重組質粒的抽提、線性化單酶切、純化

重組質粒pBluescript II KS（+）-FIPV N和pBluescript II KS（+）-EGFP的抽提，線性化單酶切，及后續的純化具體步驟參考相關試劑盒說明書上的步驟。

1.2.5 mRNA的體外轉錄、加帽、純化

將上述線性化的DNA模板使用HiScribeTM T7高產量優化RNA Synthesis Kit進行mRNA的體外轉錄，按照試劑盒的說明書配制體外轉錄體系，轉錄出的mRNA采用LiCL沉淀法純化后，使用牛痘病毒加帽系統和mRNA Cap 2′-O-甲基轉移酶試劑盒進行mRNA的體外加帽，詳細試驗步驟和試劑使用量參照試劑盒說明書。

1.2.6 mRNA的體外轉染試驗

將293T細胞消化為細胞懸液，接種于6孔板內，5 × 105個·孔-1放置于孵箱內過夜培養，待細胞密度匯合至85%時，使用Lipofectamine 3000轉染試劑，將2.5 μg EGFP-mRNA（1 μg·μL-1）和2.5 μg FIPV N-mRNA（1 μg·μL-1）轉染至293T細胞內，Lipofectamine 3000和RNA的體積比為3∶1，轉染試劑和mRNA分別稀釋在250 μL Opti-MEM減血清培養基內，混勻后室溫靜置10 min，500 μL混合液均勻滴入六孔板內，六孔板放置于孵箱內繼續培養。

1.2.7 細胞間接免疫熒光試驗

將上述轉染FIPV N-mRNA的細胞樣本放置于37 ℃ ，5% CO2孵箱內過夜培養，在12 h和24 h兩個時間點，取出細胞，甲醇固定細胞30 min，PBS洗滌3次，使用0.3% Triton X-100通透細胞10 min，PBS洗滌3次后，山羊血清封閉30 min，每孔加入500 μL 稀釋后的FIPV N特異性抗體（稀釋比為1∶200），4 ℃ 孵育過夜，PBS洗滌3次后，加入FITC標記的HRP-Goat Anti-Rabbit IgG（稀釋比為1∶200），PBS洗滌細胞三次，使用DAPI染色5 min后，在倒置熒光顯微鏡下，觀察細胞的熒光結果并拍照記錄，分析熒光情況。轉染EGFP-mRNA的細胞樣本放置于37 ℃ 5%的CO2孵箱內過夜培養，在12和24 h兩個時間點，將細胞放置于倒置熒光顯微鏡下，樣品暴露在藍色激發光下，直接觀察EGFP蛋白的表達情況，并拍照記錄。

1.2.8 Western blot試驗

將上述轉染FIPV N-mRNA的細胞樣本放置于37 ℃ ，5%的CO2孵箱內過夜培養，在12和24 h，提取細胞內總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后，添加5 ×SDS-PAGE Sample Loading Buffe混勻。100 ℃金屬浴，3 min熱變性蛋白樣品，100 V電壓下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后在120 A的恒定電流下采取“三明治夾心”的模式將蛋白轉印至PVDF膜上，配制封閉液（5%的脫脂牛奶）室溫搖床封閉2 h，TBST漂洗三次，每次10 min，加入兔源性FIPV N單克隆抗體，4 ℃搖床過夜孵育，TBST漂洗10 min，重復3次，加入HRP-Goat Anti-Rabbit IgG抗體，室溫搖床孵育 1 h后，TBST漂洗10 min，重復3次。在蛋白成像曝光系統上進行蛋白的顯色操作并拍照分析。

1.2.9 動物試驗方案

將6～8周齡，體重為15～18 g的BALB/C雌性小鼠隨機分為3組，每組3只小鼠。試驗組使用商業化的活體轉染試劑GoldenTran-mV+FIPV N-mRNA（20 μg）分三次肌肉注射免疫小鼠，每次間隔10 d。兩組對照組分別為裸mRNA對照組（20 μg）和葡萄糖對照組。在初次免疫的第12、24、36天取小鼠下頜靜脈血，檢測血清中的FIPV N的抗體濃度，IL-4和TNF-α的含量，具體試驗步驟參考相關ELISA試劑盒。免疫完成后處死小鼠，分離小鼠脾細胞檢測脾細胞中IFN-γ的含量，具體試驗步驟參考小鼠IFN-γ Elispot試劑盒。

1.2.10 數據分析

使用GraphPad Prism Version 8.0軟件進行統計分析。所有數據均以平均值±標準差表示，通過學生t檢驗或單因素方差分析進行統計學差異分析。當 P 值小于 0.05 時，所有檢驗均被接受為具有統計顯著性。

2 結 果

2.1 mRNA體外轉錄載體的設計

mRNA疫苗需要具備與生物體內天然存在的mRNA結構相似的特征，包括在抗原蛋白的兩端具有非編碼序列（untranslated regions，UTR區域）、信號肽序列、5′端帽子結構和3′短Poly A尾部［16］。因此，在設計mRNA序列的設計時，除了對抗原序列的優化外，選擇合適的非編碼序列、信號肽序列和Poly A尾部，對于mRNA抗原蛋白的表達至關重要，設計并構建了如下圖1A所示mRNA序列元件。隨后，將構建好的序列克隆到含有T7啟動子的pBluescript II KS（+）載體上，從而構建出mRNA體外轉錄載體。

2.2 抗原序列的優化

為了提高抗原蛋白的表達效率，基于宿主內密碼子的偏好性，GC的含量和mRNA序列的二級結構的自由能等因素，對FIPV N蛋白的基因序列進行了人源性的優化，優化結果如圖2所示：通過對FIPV N基因序列進行優化，密碼子的適應性明顯提高，從原先的0.46增加至0.83。同時，GC的含量也顯著提高，從43.39%提高至52.96%。此外，在mRNA的二級結構中，可替換區減少，優化前的鍵能為-199.25 kJ·mol-1，經優化后降低為-215.99 kJ·mol-1（圖2）。

2.3 EGFP的體外擴增、酶切、純化

為了獲得EGFP基因，以本實驗室保存的pUC57-EGFP質粒為模板進行擴增。擴增后的EGFP基因在瓊脂糖凝膠電泳中顯示（圖3A泳道1），可見明顯的條帶，大小在700 bp。隨后，將EGFP基因雙酶切和純化，瓊脂糖凝膠試驗的結果顯示（如圖3A泳道2所示），泳道上條帶單一，無雜帶產生，表明成功擴增出EGFP基因序列。

2.4 重組質粒的構建和鑒定

pBluescript II KS（+）-FIPV N重組質粒雙酶切的結果如圖3B所示，其被切割成兩部分，一部分是FIPV N基因序列，位于約1 000 bp附近，另一部分是mRNA體外轉錄載體，位于3 000 bp附近。圖3C展示了重組質粒pBluescript II KS（+）-FIPV N和pBluescript II 在大腸桿菌感受態細胞中擴大培養后的轉化結果和重組質粒的線性化單酶切的結果，圖3D是制備轉錄的EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA。

A. EGFP基因的體外擴增，雙酶切后的純化的瓊脂糖凝膠圖（泳道1：EGFP基因的體外擴增，泳道2：EGFP基因雙酶切后純化）；B. 重組質粒 pBluescript II KS（+）-FIPV N雙酶切的凝膠電泳圖（泳道1），膠回收的mRNA體外轉錄載體的瓊脂糖凝膠電泳圖（泳道2）；C. 重組質粒的抽提及線性化單酶切的瓊脂糖凝膠圖［泳道1：pBluscript lI KS（+）-EGFP質粒；泳道2：pBluscript I KS（+）-FIPV N質粒；泳道3：單酶切的pBluscript II KS（+）-FIPV；泳道4：單酶切的pBluscript Il KS（+）-EGFP］；D. 體外轉錄的EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA瓊脂糖凝膠圖（泳道1：EGFP-mRNA；泳道2：FIPV N-mRNA）

A. In vitro amplification of the EGFP gene， purified agarose gel after double digestion （lane 1： in vitro amplification of the EGFP gene， lane 2： purification after double digestion of the EGFP gene）; B. Agarose gel electropherogram of double digestion of the pBluescript II KS（+）-FIPV N recombinant plasmid （lane 1）， agarose gel electropherogram of gel-recovered mRNA transcription vector in vitro （lane 2）; C. Extraction of recombinant plasmids and linearized agarose gel plots of single digestion （Lane 1： pBluscript lI KS（+）-EGFP plasmid; Lane 2： pBluscript I KS（+）-FIPV N plasmid; Lane 3： Single enzyme digested pBluscript II KS（+）-FIPV; Lane 4： Single enzyme cleaved pBluscript Il KS（+）-EGFP）; D. In vitro transcribed EGFP-mRNA and FIPV N-mRNA agarose gel plots （lane 1：EGFP-mRNA; lane 2：FIPV N-mRNA）

圖3 重組質粒的構建與鑒定

Fig.3 Construction and identification of recombinant plasmids

2.5 細胞轉染試驗和Western blot試驗

將重組質粒單酶切為線性后，以線性化的重組質粒為模板，經過模板純化、體外轉錄、LiCl純化mRNA、mRNA加帽純化成功制備出EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA，結果如圖4所示，兩種mRNA轉染至293T細胞12～24 h，倒置熒光顯微鏡下看到試驗組中大量綠色熒光蛋白的表達，Control組未觀測到熒光信號。證明該體系制備的EGFP-mRNA能在細胞體內產生大量抗原序列蛋白，且EGFP蛋白表達狀況良好。

使用FIPV N特異性抗體進行Western blot試驗，結果顯示293T細胞成功表達出FIPV N 蛋白相對分子質量為46 ku（圖5），與預期條帶相符合。

2.6 細胞間接免疫熒光試驗

細胞間接免疫熒光試驗結果顯示：將上述步驟中制備FIPV N-mRNA轉染至293T細胞12～24 h后，在倒置熒光顯微鏡下，試驗組觀察到大量綠色熒光信號的表達，而陰性對照組則未觀察到含有FIPV N蛋白的熒光信號。結果表明，成功實現了FIPV N蛋白在293T細胞中的表達。進一步觀察顯示，FIPV N蛋白定位在細胞的胞質中

2.7 小鼠血清中的特異性抗體的檢測細胞因子的變化

ELISA試驗檢測了三組小鼠中血清中FIPV N特異性抗體、IL-4和TNF-α的含量，并觀察了免疫過程中的變化，ELISA結果顯示（見圖7B、C），試驗組FIPV N特異性抗體水平及IL-4、TNF-α的含量顯明顯高于裸mRNA對照組和葡萄糖對照組，此外，在試驗組中隨著加強免疫的接種，FIPV N特異性抗體的水平及IL-4、TNF-α的含量也逐漸增加，這表明試驗組小鼠在FIPV N-mRNA進入細胞表達FIPV N蛋白后，有效激發了小鼠體液免疫反應應答，而裸mRNA對照組和葡萄糖對照組在抗體水平、細胞因子（IL-4和TNF-α）的含量方面，則無顯著性差異，隨著免疫接種的加強，這些指標也無顯著性變化。

2.8 小鼠脾細胞中的IFN-γ含量的檢測

Elispot試驗結果顯示了在免疫接種完成后，三組小鼠脾細胞內IFN-γ的含量的差異。如圖6D所示與對照組相比，接種量GoldenTran-mV+FIPV N-mRNA（10 μg）的試驗組小鼠脾細胞內IFN-γ的分泌水平顯著增加，而裸mRNA對照組脾細胞中IFN-γ的含量雖然高于葡萄糖對照組，但并無統計學意義。表明試驗組使用商業化轉染試劑遞送的FIPV N-mRNA成功進入小鼠的細胞內，并有效誘發了細胞免疫應答。

3 討 論

貓傳染性腹膜炎病毒屬于有包膜的RNA冠狀病毒，貓的任何年齡段均可感染此病毒，可嚴重危害貓群的健康［17］。本文選擇以貓冠狀病毒（feline coronavirus，FCoV）作為mRNA疫苗的研究對象，一方面是因為市場急需一種有效預防貓傳染性腹膜炎病毒的疫苗，另一方面由于冠狀病毒基因的相似性也可以作為一種通用型病毒探索傳染性病毒的mRNA疫苗的設計和制備［18］。

與傳統研發的FIPV減毒疫苗和腺病毒疫苗相比，mRNA疫苗不會存在病毒基因整合到機體基因組的風險，mRNA疫苗制備在應對暴發性動物急性疫病中，更為迅速和安全，生產成本更加低廉［19］。與重組亞單位疫苗相比，mRNA序列直接傳遞病毒的遺傳信息，快速高效的激活免疫系統，具有更高的保護性［20］。目前市場上還未有安全有效的貓傳染性腹膜炎疫苗，在過去的20年來，基于傳統技術開發的改良鼻內活疫苗，重組蛋白多肽疫苗和異源活冠狀病毒接種疫苗，其保護效果并不理想，甚至會導致疾病的抗體增強效應［21-23］。先前的研究表明刺突蛋白上存在抗體中和表位，引起較低的特異性中和抗體水平，促進了白細胞對FCoV的Fc受體介導入胞作用，導致了ADE的產生和早期死亡綜合征的發展。因此，刺突蛋白不適應于FCoV疫苗的抗原［24-25］。

N蛋白是冠狀病毒中結構最為豐富的蛋白，在FIPV感染的不同階段均穩定表達，具有較高的序列相似性，使其成為疫苗研發的理想選擇［26］。目前核衣殼蛋白基因已經被廣泛研究用于FIPV疫苗的研發和FIP的治療，有研究報道，用桿狀病毒表達N蛋白的細胞裂解物進行動物免疫，可有效預防FIPV的進展，而不會誘導貓的ADE［10］。有些研究小組設計了針對FIPV N蛋白的小干擾RNA，即使在最低濃度下，也可以有效抑制FIPV的復制，減輕癥狀的產生，減緩病程的進展［27］。

因此，本部分研究中選取了貓傳染性腹膜炎的核衣殼蛋白作為誘發細胞免疫反應的抗原，構建了pBluscript Ⅱ KS（+）-EGFP和pBluscript Ⅱ KS（+）-FIPV N重組質粒，利用體外轉錄技術，成功制備出了EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA。通過體內體外試驗驗證，mRNA能夠成功在293T細胞中表達相應的蛋白，證明了體外轉錄載體框架的可行性。隨后進行動物體內疫苗的免疫原性的驗證，結果表明FIPV N-mRNA疫苗進入細胞內后能很好的引起細胞的體液免疫和細胞免疫應答。在病毒感染的早期階段，由于機體對病毒反應較弱，機體的體液反應及早應答，病毒與抗體形成的復合物被白細胞上的特異性受體識別，促進了病毒的入胞過程，引起嚴重的臨床癥狀［27-29］。隨著免疫的提高和改善，細胞免疫應答啟動，臨床癥狀將逐步減輕［3］。因此FIP進展和嚴重情況，與機體在早期感染中是否及時啟動細胞免疫有關。若是細胞免疫能夠在早期及時激活，并且足夠強大，則會延緩病情的進展。mRNA疫苗的作用機制是快速表達抗原蛋白，以激發機體強大的細胞免疫和體液免疫［16，29-30］。已經有部分研究證明選擇N蛋白作為免疫原能避免FIPV的ADE效應，但是在此次研究中，由于試驗條件和時間的限制，后續動物體內的攻毒試驗未能驗證，在后續的試驗計劃中將重點研究疫苗的保護性和是否引起機體的ADE效應。

4 結 論

體外轉錄載體構建的FIPV N-mRNA在體外轉染至細胞后，能成功在細胞體內有效表達FIPV N蛋白，在遞送系統的輔助下成功遞送到動物細胞體內后能夠有效引起動物體內的體液免疫和細胞免疫反應，具有較強的免疫原性，以核衣殼蛋白作抗原的mRNA疫苗有望成為貓傳染性腹膜炎的候選疫苗，mRNA體外轉錄載體的設計與構建為傳染性疾病mRNA疫苗序列的設計提供一定的參考價值。

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（編輯 白永平）