B亞型禽偏肺病毒B1分離株感染性克隆的構建與鑒定

摘 要：

B亞型禽偏肺病毒（avian metapneumovrus， aMPV）可引起雞腫頭綜合征，造成免疫抑制，引發嚴重的繼發感染并導致雞生產性能下降。建立國內aMPV分離株的反向遺傳學系統對病毒研究及開發針對性疫苗具有重要意義。將病毒基因組擴增片段分別測序，通過序列拼接獲得了完整的aMPV B1分離株基因組序列。根據病毒基因組序列中的酶切位點，將基因組分4段依次連入pTH載體，獲得病毒基因組質粒pTH-B1。在病毒基因組的第7 474位引入同義突變，沉默原有Sal Ⅰ酶切位點以作為遺傳標記，在pTH-B1質粒M與F基因之間引入PmeⅠ酶切位點，并利用該位點插入EGFP基因，獲得質粒pTH-B1EGFP。將病毒N、P、M2.1基因的表達盒共同克隆到pCI-Neo表達載體中，獲得輔助質粒pCI-NPM2.1。將L基因單獨克隆到pCI-Neo表達載體中，獲得輔助質粒pCI-L。將pTH-B1質粒和pTH-B1EGFP質粒分別與兩種輔助質粒共轉染BSR/T7細胞，然后將轉染細胞與Vero細胞共培養并連續傳代。結果顯示：通過細胞病變（CPE）和綠色熒光觀察，以及N基因和遺傳標記檢測、間接免疫光試驗（IFA）和Western blot共同驗證，表明構建的rB1株和rB1-EGFP株拯救成功。rB1株和rB1-EGFP株與親本毒株的增殖水平和趨勢相似。本研究通過三質粒拯救系統獲得了B亞型aMPV B1株的感染性克隆，M和F基因間的非編碼區可插入基因表達序列，為進一步探究B亞型aMPV的致病機理和疫苗研發奠定了必要基礎。

關鍵詞：

B亞型禽偏肺病毒；感染性克隆；三質粒；病毒拯救

中圖分類號：S852.659.5

文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0788-15

收稿日期：2024-04-07

基金項目：青島市科技惠民示范專項項目（23-2-8-xdny-14-nsh）

作者簡介：于澤坤（1988-），男，山東青島人，博士生，主要從事家禽疫苗研究，E-mail： zekun_yu@qq.com

*通信作者：宋勤葉，主要從事預防獸醫學研究，E-mail： songqinye@126.com；李 彥，主要從事動物疫病防控研究，E-mail： liyanqd2008@163.com

Construction and Identification of Infectious Clone of the Avian Metapneumovirus of Subtype B Strain B1

YU" Zekun1，2， JIANG" Chengyuan2， YUAN" Hongxing3， ZHOU" Sheng2， DUAN Xiaoxiao4， LI Yan4*， SONG" Qinye1*

（1.College of Veterinary Medicine， Hebei Agricultural University， Baoding 071000，China;

2.Shandong Sinder Technology Co.， LTD， Weifang 262200，China;

3.Agriculture and Rural Bureau of Guantao County， Handan City， Hebei province， Guantao 057750，China；

4. Qingdao Animal Disease Prevention and Control Center， Qingdao 266100， China）

Abstract：

Avian metapneumovirus （aMPV） subtype B is associated with the development of swollen head syndrome in chickens， which can lead to immunosuppression， severe secondary infections， and a subsequent decline in the productive performance of the poultry. The establishment of a reverse genetics system for domestic aMPV isolates is of considerable significance for advancing virological research and facilitating the development of targeted vaccines. The amplicons of the viral genome were sequenced individually， and the complete genome sequence of the aMPV B1 strain was deduced through sequence assembly. The genome was divided into four segments based on enzyme cleavage sites and sequentially inserted into the pTH vector to construct the viral genome plasmid pTH-B1. A synonymous mutation introduced at position 7 474 of the viral genome to silence the Sal I cleavage site as a genetic marker. A Pme I cleavage site was introduced between the M and F genes of the pTH-B1 plasmid， and the EGFP expression cassette was inserted using this site to obtain the plasmid pTH-B1EGFP. The expression cassettes of the viral N， P， and M2.1 genes were co-cloned into the pCI-Neo expression vector， yielding the auxiliary plasmid pCI-NPM2.1. The L gene was individually cloned into the pCI-Neo expression vector， yielding the auxiliary plasmid pCI-L. The pTH-B1 and pTH-B1EGFP plasmids were co-transfected with the two auxiliary plasmids into BSR/T7 cells， respectively. Subsequently， the transfected cells were co-cultured with Vero cells and continuously passaged for further analysis. The successful rescue of the rB1 and rB1-EGFP strains was confirmed through the observation of cytopathic effects （CPE） and green fluorescence， along with the detection of vrial N gene and genetic marker， indirect immunofluorescence assay （IFA） and Western blot. The proliferation levels and trends of the rB1 and rB1-EGFP strains were found to be similar to those of the parental virus strain. This study successfully obtained the infectious clone of the subtype B avian metapneumovirus B1 strain using a three-plasmid rescue system. The intergenic non-coding region between the M and F genes is capable of accommodating gene expression sequences， which lays a necessary foundation for further investigation into the pathogenesis of subtype B aMPV and the development of vaccines.

Key words： avian metapneumovirus subtype B; infectious clone; a three-plasmid rescue system; viral rescue

*Corresponding author：" SONG Qinye， E-mail： songqinye@126.com；LI" Yan， E-mail：liyanqd2008@163.com

禽偏肺病毒（avian metapneumovrus， aMPV）可感染多種禽類，雞與火雞是其主要的易感宿主［1］。aMPV引起雞腫頭綜合征（swollen head syndrome， SHS），易引發繼發感染導致產蛋及增重等生產性能下降，造成養禽業嚴重的經濟損失［2］。1978年南非首先分離到aMPV，隨后歐洲、美洲及亞洲相繼有aMPV流行的報道［3-8］。我國針對aMPV的研究起步較晚，于1999年首次完成aMPV的鑒定。aMPV分為A、B、C、D四個亞型。B亞型aMPV是歐洲的流行毒株，隨后流行范圍擴大至亞洲及美洲。近年我國陸續有分離到B和C亞型aMPV毒株的報道［9-15］。針對膠東、東北、華北以及部分南方地區的血清學調查顯示，我國雞群aMPV血清陽性率高，部分場區的陽性率達到100%［16-19］。相對于血清學調查的高陽性率，aMPV病原檢出率較低。2020年我國南方多個省份總體檢出率僅為2.67%，其中B亞型毒株的占比高于其它亞型［20］。病毒的低檢出率導致病料采集難度增加，使得病毒分離成功率始終維持在較低水平。

B亞型aMPV分布廣泛，但病毒基因的整體突變水平較低，未發現因疫苗的使用而發生明顯的毒株免疫逃逸現象［21］。我國B亞型分離毒株與歐洲毒株屬于同一分支［22-23］。國內分離毒株對SPF雞、商品肉雞和蛋雞均有致病性，表現為精神萎靡、甩頭撓鼻和流涕癥狀。通過呼吸道排毒的周期約為一周，鼻甲骨、氣管和肺部均表現出不同程度的炎癥反應［11，24-26］。血液及免疫器官的監測結果說明病毒感染造成一定程度的免疫抑制現象［27］。

aMPV為不分節段的負鏈RNA囊膜病毒，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）肺炎病毒亞科（Pneumoviridae）偏肺病毒屬（Metapneumovirus）成員。B亞型aMPV基因組全長約13.5 kb，自基因組3′端起依次編碼核衣殼蛋白（nucleocapsid， N）、磷蛋白（phosphoprotein， P）、基質蛋白（matrix， M）、融合蛋白（fusion protein， F）、基質蛋白2（matrix2， M2）、小疏水蛋白（small hydrophobic protein， SH）、吸附蛋白（attachment glycoprotein， G）和聚合酶蛋白（large polymerase， L），其中M2通過RNA編譯機制同時編碼M2.1和M2.2兩個蛋白［28］。病毒囊膜上含有M、F、SH和G四個結構蛋白，N、P、M2.1和L包裹病毒負鏈RNA基因組，形成核糖核蛋白復合體（ribonucleoprotein， RNP）。裸露的病毒RNA不具有感染性，RNP是病毒進行基因轉錄和復制的基本單元。B亞型毒株F蛋白可在跨膜絲氨酸蛋白酶作用下完成蛋白剪切，與細胞整合素αvβ1結合，介導完成膜融合，將RNP釋放進入細胞質起始病毒復制進程［29-30］。

目前，我國aMPV感染呈現擴大化和復雜化趨勢。但由于缺乏可參考的病毒樣本，無法通過宏觀比對分析推測病毒特性，直接限制了病毒的研究進程。反向遺傳學技術可從病毒基因層面對病毒進行改造，探究這些改變對病毒結構功能、與宿主互作及感染免疫等的影響，是重要的病毒研究工具。目前國內缺少與流行毒株對應的反向遺傳學操作系統，因此本研究旨在構建針對國內B亞型aMPV毒株的感染性克隆，為進一步探究aMPV的致病機理和開發疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞

2022年，內蒙古赤峰市某雞場80日齡蛋雞出現疑似aMPV感染癥狀，鼻咽拭子經RT-PCR檢測確定aMPV陽性。取陽性拭子經處理后，接種到Vero細胞并連續盲傳5代，獲得了分離毒株。經對分離毒株的N（GenBank ID： PP999757）、F（GenBank ID： PP999759）和G（GenBank ID： PP999758）蛋白基因序列及遺傳進化樹分析，確定分離毒株為B亞型aMPV，將其命名為B1株。毒株的TCID50為105.2·0.1 mL-1。BSR/T7細胞由中國動物衛生與流行病學中心蔣文明博士饋贈，Vero細胞由本實驗室保存。

1.2 載體與菌株

pCI-Neo和pTH質粒由本實驗室保存。大腸桿菌E.coli DH5α感受態細胞，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 主要試劑和試劑盒

雞源禽偏肺病毒B1株抗血清和鼠源禽偏肺病毒B1株N蛋白抗血清，由本實驗室制備并保存；高保真PCR酶、反轉錄試劑和無縫克隆連接試劑，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；GenJetTM plus細胞脂質體轉染試劑，購自SignaGen Laboratories公司。一步法RT-PCR試劑盒、一步法RT-qPCR熒光定量試劑盒以及5′/3′RACE試劑盒，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；質粒提取試劑盒、無內毒素質粒中提試劑盒、膠回收試劑盒、病毒RNA提取試劑盒，購自OMEGA廣州飛揚生物工程有限公司。引物及基因合成由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.4 禽偏肺病毒B1株全長cDNA質粒的構建

應用Snapgene7軟件比對aMPV B亞型毒株LN16株（GenBank ID： MH745147）、Hungary/657/4株（GenBank ID： MN729604）和VCO3/60616株（GenBank ID： AB548428）的全基因組序列，在基因保守區設計引物，使用RACE方法獲得病毒基因組3′和5′端的末端序列，分5段PCR擴增獲得病毒剩余基因組片段，拼接所有擴增片段獲得基因組序列。根據測序結果設計質粒構建引物（表1）。如圖1所示，將病毒cDNA分為A～D四個片段，以FAF/R和FDF/R為引物擴增獲得A和D片段，通過無縫連接將A和D片段引入到線性化的pTH低拷貝質粒中。利用XhoⅠ和KpnⅠ限制性內切酶線性化已克隆A和D片段的重組質粒，使用FBF/R和FCF/R引物經PCR擴增獲得B和C片段，并引入到重組質粒中。克隆B和C片段的過程中，利用B和C引物的同源臂序列完成病毒基因組第7 474 nt U→C的同義突變，消除基因組中原有的SalⅠ酶切位點以作為拯救毒株遺傳標記，經測序分析，將序列正確的質粒命名為pTH-B1。

如圖2所示，以pTH-B1質粒為模板，用引物B1-PmeⅠ 1F/1R和B1-PmeⅠ 2F/2R分兩段擴增pTH-B1質粒片段，利用無縫連接試劑完成片段環化連接，在病毒M和F基因之間的間隔區域引入特異性的Pme Ⅰ酶切位點，所得質粒命名為pTH-B1Pme Ⅰ。使用B1-EGFPF/R引物擴增EGFP基因序列，并將其引入到經Pme Ⅰ酶切線性化的pTH-B1Pme Ⅰ質粒中，使用EGFP基因檢測F/R引物經PCR驗證基因片段連接的正確性，同時進行測序，將測序正確的質粒命名為pTH-B1EGFP。

1.5 輔助質粒及微基因組質粒的構建

如圖3A所示，以pTH-B1質粒為模板，分別將病毒N、P及M2.1基因開放閱讀框（open reading frame， ORF）序列引入到pCI-Neo質粒的多克隆位點中，構建pCI-N、pCI-P和pCI-M2.1表達質粒。用BamH Ⅰ消化pCI-M2.1質粒使其線性化，分別以NPM2.1-NF/R和NPM2.1-PF/R為引物，將pCI-N、pCI-P質粒中的基因表達盒序列引入到pCI-M2.1質粒中，構成輔助質粒pCI-NPM2.1。如圖3B所示，用LF/R引物擴增病毒L基因ORF序列引入到經EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切線性化的pCI-Neo質粒中，構成輔助質粒pCI-L。如圖3C所示，通過基因合成方法，在EGFP基因兩側分別引入與B1株相同非翻譯區序列，將此EGFP修飾序列引入pTH質粒中，構成微基因組質粒pTH-miniG。上述構建的質粒經酶切驗證后送生工公司測序。

1.6 輔助質粒的表達鑒定

將BSR/T7細胞接種到6孔細胞培養板，待細胞匯合度達到80%以上時參照GenJetTM plus質粒轉染說明書進行質粒轉染。每孔細胞轉染pTH-miniG質粒1 μg；pCI-NPM2.1質粒1.5 μg；pCI-L質粒1 μg。設置僅轉染pTH-miniG質粒或pCI-NPM2.1和pCI-L輔助質粒的對照組。轉染后48 h，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光。

1.7 病毒拯救

將BSR/T7細胞接種到6 cm細胞培養皿，待細胞匯合度達到80%以上時轉染質粒。將pTH-B1/pTH-B1EGFP質粒4 μg、pCI-NPM2.1質粒2.5 μg、pCI-L質粒1.25 μg同時轉染BSR/T7細胞，轉染后繼續培養48 h，用胰酶消化轉染細胞與Vero細胞，并將細胞混合接種于細胞瓶內；待細胞匯合度超過90%后，更換為含有1%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的高糖DMEM維持液，培養5～7 d后，收獲培養物，反復凍融3次，1 000 r·min-1離心10 min；收集上清液接種于匯合度超過90%的Vero細胞，加入維持液，繼續培養5～7 d。按相同方法在Vero細胞上連續盲傳直至出現細胞病變（cytopathic effect， CPE），收獲拯救毒株，分別命名為rB1和rB1-EGFP。對于rB1-EGFP（EGFP標記）毒株，直接在熒光倒置顯微下觀察細胞熒光，并連續傳代至F15代，以驗證EGFP標記的穩定性。

1.8 拯救毒株的鑒定

1.8.1 RT-PCR

取B1、rB1及rB1-EGFP毒株分別感染Vero細胞，待出現CPE后收取細胞上清液，提取病毒RNA。以pCI-NPM2.1質粒作為陽性對照，使用N基因檢測F/R引物（表2），通過一步法RT-PCR方法擴增N基因片段。用SalⅠ檢測F/R引物經PCR擴增含有遺傳標記的核酸片段，然后用SalⅠ限制性內切酶消化擴增的片段，通過片段數量區分拯救毒株及其親本毒株。進一步對PCR產物進行測序，確認遺傳標記的正確性。

1.8.2 間接免疫熒光試驗（IFA）

將B1株及rB1株分別接種到Vero細胞上，培養4 d后用4%甲醛溶液固定細胞；用4%脫脂奶封閉1 h；加入雞抗aMPV B1株抗血清（一抗，1∶500）孵育1 h后沖洗細胞；加入Alexa Flour 488標記的驢抗雞IgY熒光抗體（二抗，1∶200），避光孵育1 h后沖洗細胞并封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光。

1.8.3 Western blot

將B1株、rB1株和rB1-EGFP株分別感染Vero細胞，培養4 d；同時設立正常細胞對照。收取接毒細胞和正常細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞；取裂解上清液加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液并在沸水中加熱15 min；取上清液加入到12%聚丙烯酰胺變性電泳預制膠各孔內進行SDS-PAGE，每孔上樣20 μL，140 V電泳45 min。通過半干轉膜儀將膠中的蛋白條帶轉印至PVDF膜上；將PVDF膜浸沒于4%脫脂奶封閉1 h；加入鼠抗aMPV B1株N蛋白抗血清（一抗，1∶500）孵育1 h，洗膜；加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG抗體（二抗，1∶5 000），室溫孵育1 h；洗膜，加入DAB顯色液顯色，觀察特異性反應條帶。

1.9 生長曲線的測定

取B1株、rB1株以及rB1-EGFP株（0.1 MOI）分別感染Vero細胞，設立空細胞對照。于孵育24、48、72、96、120和144 h時收取400 μL上清液，提取病毒RNA。用qB1-probe探針和qB1F/R引物（表2）通過一步法RT-qPCR方法測定不同時間的病毒拷貝數，繪制病毒生長曲線，比較不同毒株的增殖水平。

2 結 果

2.1 B1株基因組全長cDNA質粒的鑒定

通過RACE方法獲得了B1株基因組3′端約1 900 bp和5′端約1 700 bp的末端片段（圖4A）。通過RT-PCR方法分5段擴增，得到病毒剩余的基因組序列（圖4B）。將擴增的7個片段經測序和拼接后獲得了全長13 516 nt的B1株基因組序列。該序列與B亞型參考毒株的基因組結構一致，各蛋白的編碼區（coding sequence region， CDS）序列堿基數相同。但G蛋白含413個氨基酸殘基（amino acid residue， aa），比參考毒株少1個aa。這是由于G蛋白基因的1 240位存在的C→U突變使蛋白翻譯提前一位終止，導致在羧基端缺失一谷氨酰胺殘基（圖5）。雖然B1株與參考毒株各個基因CDS序列堿基數一致，但基因組堿基總數不同。各個毒株之間的差異存在于基因間隔區域。在基因間隔區存在不同程度的堿基突變、插入和缺失（圖6）。

用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切pTH-B1質粒，得到11 646 bp和5 279 bp的片段；經KpnⅠ和MluⅠ雙酶切，得到10 594 bp和6 331 bp的片段；經MluⅠ和NotⅠ雙酶切，得到13 679 bp和3 246 bp的片段，質粒酶切結果均與預期相符（圖7A），測序結果顯示構建的B1株基因組全長cDNA質粒序列完全正確。

質粒pTH-B1PmeⅠ經NotⅠ和PmeⅠ雙酶切可得到10 741 bp和6 218 bp的片段，經MluⅠ和PmeⅠ雙酶切得到13 987 bp和2 972 bp的片段（圖7B）。進一步測序證明插入的基因序列完全正確。pTH-B1EGFP質粒經PCR鑒定獲得約730 bp的片段，片段長度符合預期（圖7C）。序列測定結果顯示，質粒中插入的EGFP基因序列正確。

2.2 輔助質粒及微基因組質粒的鑒定

輔助質粒pCI-NPM2.1經PspOMⅠ、EcoR Ⅴ和KpnⅠ三酶切后得到長度為5 824 bp、2 412 bp和2 073 bp的酶切片段（圖8A）。輔助質粒pCI-L經KpnⅠ酶切后得到7 731 bp和3 744 bp的片段（圖8B）。進一步序列測定顯示，兩輔助質粒中插入的基因序列均正確。微基因組質粒pTH-miniG經Hind Ⅲ和SalⅠ雙酶切后，得到3 739 bp和1 005 bp的酶切片段，測序結果顯示插入的序列正確（圖8C）。

2.3 輔助質粒的表達鑒定

將pTH-miniG、pCI-NPM2.1和pCI-L 3種質粒共轉染BSR/T7細胞，轉染后48 h在熒光顯微鏡下觀察到明亮的綠色熒光（圖9A）。單獨轉染微基因組質粒（圖9B）和只轉染輔助質粒的細胞（圖9C）與空細胞對照相同（圖9D），均未見綠色熒光。結果表明兩種輔助質粒能夠正確表達N、P、M2.1和L四種蛋白，表達蛋白具有生物活性。

2.4 拯救的aMPV rB1株及rB1-EGFP株

感染拯救的aMPV rB1株及rB1-EGFP株的Vero細胞出現與感染親本毒株相同的CPE，即細胞拉絲、間隙增大、合胞體及細胞崩解和脫落，而對照細胞無明顯CPE（圖10）。在熒光倒置顯微鏡下，在rB1-EGFP感染的細胞內觀察到綠色熒光，連續傳代至F15代次后仍能正常表達綠色熒光蛋白（圖11）。結果說明M和F基因間隔能夠正常且穩定表達插入的EGFP。

2.5 拯救毒株的鑒定

在感染B1株、rB1株和rB1-EGFP株的Vero細胞的上清液中均能擴增得到病毒N基因475 bp的鑒定條帶（圖12A）。但僅在感染B1親本毒株的細胞上清液中能夠擴增出含有SalⅠ酶切位點的核酸片段，經SalⅠ單酶切后可見大小為910和400 bp的條帶，而去除了SalⅠ酶切位點的rB1株和rB1-EGFP株的PCR擴增片段無法被SalⅠ酶切，僅有單一的1 310 bp擴增條帶（圖12B）。同時測序結果證明，拯救的毒株7 474位處均為C堿基，SalⅠ酶切位點被消除（圖12C）。感染rB1株及B1株的Vero細胞經IFA檢測，可觀察到綠色熒光，感染B1株、rB1株和rB1-EGFP株的細胞經Western blot分析，均能檢測到大小約為46 ku的病毒N蛋白條帶，而空細胞對照無明顯熒光和預期的特異性反應條帶出現（圖13、14）。上述結果表明，構建的rB1和rB1-EGFP毒株均拯救成功，且無親本毒株污染。

2.6 拯救毒株的生長曲線

RT-qPCR檢測顯示，rB1和rB1-EGFP株與其親本毒株B1在Vero細胞內的生長趨勢無顯著性差異，均在120 h達到生長峰值（圖15）。該結果表明rB1株和rB1-EGFP株與親本毒株具有相似的生長動力學特征。

3 討 論

反向遺傳學系統是最有效的病毒研究工具，目前已有A亞型及C亞型aMPV毒株的感染性克隆操作平臺 ［31-35］，而針對國內B亞型流行毒株的反向遺傳學操作系統還未有報道，本研究填補了該領域的空缺。已發表的aMPV拯救系統均采用了五質粒的構建方式，即包含基因組質粒和分別表達N、P、M2.1、L蛋白的四個輔助質粒［31，36-37］。本文在此基礎上進行了改進，合并了N、P、M2.1三個較小基因的輔助質粒，將總質粒數量降到了3個。微基因組試驗證明了具有多順反子的輔助質粒pCI-NPM2.1能夠同時表達3個具有活性的病毒蛋白。降低拯救系統中轉染質粒的數量有助于提高病毒拯救效率。這是因為與5個質粒相比，同一細胞包含3個質粒的概率更高，故具備病毒包裝能力的細胞增多，從而提高了初始病毒粒子的數量。轉染試劑的使用量因質粒數量減少而按比例縮減，對細胞的損傷作用減弱，有助于保持被轉染細胞的活力，從而延長病毒包裝周期。該試驗策略與流感病毒和新城疫病毒等通過減少轉染質粒數量以提高拯救效率的報道相似［38-39］。

由于副黏病毒科成員的基因組每個病毒蛋白均具有獨立的CDS序列，這使該科病毒擁有成為病毒載體的潛力。研究發現，A亞型aMPV各個基因間隔均可插入外源蛋白，但僅在M-F之間插入外源蛋白不影響病毒的增殖水平［40］。本文結果證明B亞型aMPV同樣具有容納外源基因的能力。將EGFP的CDS序列插入到病毒基因組M-F之間，EGFP能夠穩定正確地表達，并且毒株的增殖效率與親本毒株相似。熒光標記毒株可簡化后續試驗的病毒鑒定工作，能直觀觀察改造病毒的復制動態。將EGFP替換為其他抗原蛋白，可進一步開展病毒載體亞單位疫苗的研究。由于副黏病毒病毒各蛋白的表達水平由基因組3′端向5′端依次降低，因此當外源基因插入之后，接近5′端的病毒蛋白表達水平下降，不同程度地削弱病毒正常的增殖能力。本試驗不足之處在于僅借鑒了A亞型aMPV的總結結果，選擇M-F的間隔區域作為插入位點而未進行詳細的位點比較。B亞型毒株外源基因的插入規律與A亞型毒株是否完全一致，需要進一步通過在各個間隔插入EGFP標記基因進行評估。插入位點的選擇應結合實驗需求，如僅作為病毒示蹤可將熒光基因置于相對接近病毒基因組5′端的位置，優先保證病毒的增殖水平。而如果是作為病毒載體使用，則需要將外源基因插入到接近基因組3′端的基因間隔，在病毒增殖水平和蛋白表達水平之間尋求平衡。本文中EGFP基因兩側使用了N基因的GS和GE序列，但各個病毒基因的GS和GE序列并不相同，aMPV的L蛋白對各個GS和GE序列是否具有不同的識別效率，目前還未有報道。外源基因的表達以及其對病毒的影響是多種因素綜合作用的結果，需要后續試驗優化驗證。

為完善aMPV血清學鑒定方法，作者實驗室制備了雞抗aMPV B1株抗血清。aMPV B1陽性試子接種SPF雛雞完成毒株復壯，使用復壯毒株攻毒后2～3周采集獲得特異性抗血清。該抗血清可用于文中拯救毒株的鑒定。在目前沒有成熟B亞型單克隆抗體產品的情況下，該抗血清是有效鑒定B亞型aMPV且成本低廉的材料。

反向遺傳是重要的技術平臺，在病毒疫苗的設計與研究過程中發揮著重要作用。以疫苗研發為導向，后續可開展毒力致弱方面的研究。C亞型aMPV甲基化缺陷毒株具有良好的致弱特性和免疫原性［37］。將火雞源C亞型aMPV的G蛋白替換為鵝源G蛋白后，毒株毒力顯著下降的同時能夠保護火雞抵抗強毒株的攻擊［41］。SH及G蛋白缺失毒株攻毒火雞后未表現出明顯的癥狀且不影響毒株免疫原性［34，42］。相較于連續傳代致弱，通過病毒基因突變或蛋白替換以降低毒力的方法具有更高效率，同時也降低了病毒返強的概率。以弱毒疫苗為骨架可進一步替換病毒的抗原蛋白，使同一毒株獲得多個亞型毒株的免疫原性。在aMPV分離難度較大的情況下，反向遺傳操作平臺可提升不同亞型疫苗候選株的制備效率。本研究構建的B亞型aMPV感染性克隆，將有力推動病毒致病機制和疫苗的研究進程。

4 結 論

本文以三質粒拯救系統為基礎，成功獲得了B亞型aMPV rB1株和rB1-EGFP株的感染性克隆。兩個拯救毒株具有與親本毒株相似的增殖特性。該反向遺傳操作系統為后續病毒致病機制研究與疫苗研發提供了必要技術支撐。

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（編輯 白永平）