誘導型表達H5N1亞型禽流感病毒HA蛋白的乳酸乳球菌的構建及其對鴨的免疫原性分析

摘 要：

禽流感是由禽流感病毒引起的高度傳染性疾病，受到感染的雛禽死亡率高，給家禽健康和經濟帶來嚴重影響。盡管傳統疫苗可以有效預防禽流感，但由于鴨類養殖方式多為散戶散養，環境多變，在接種傳統疫苗時存在操作繁瑣和免疫應激強等問題。為了解決此難題，本研究旨在開發一種便捷且安全的雛鴨血凝素（hemagglutinin， HA）口服生物制劑。我們通過構建系列錨定序列（pgsA、BmpA、cA和M6）-GFP報告表達系統，可視化地評估了不同類型錨定序列對乳酸菌乳球表面展示系統的效果，成功篩選出BmpA和cA作為乳酸菌乳球中的高效錨定序列。比較優化密碼子前后的HA在乳酸乳球菌的表達效果后，選取優化密碼子的HA基因序列與BmpA、cA連接，構建乳酸菌表達質粒。然后把構建好的表達質粒轉入基因組整合HA1基因的乳酸乳球菌中，從而得到誘導型分泌聯合表面展示HA蛋白的重組乳酸乳球菌（NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA）。ELISA檢測結果表明，與口服單一表達型的重組乳酸乳球菌相比，口服誘導型分泌-表面展示乳酸乳球菌能誘生雛鴨血清中更佳的HA特異性IgG水平。本研究成功構建了錨定序列-GFP乳酸菌篩選系統，利用其篩選出了適合乳酸乳球菌的高效錨定序列。并將HA蛋白通過分泌聯合表面展示的方式在乳酸乳球菌進行復合表達，成功獲得了對雛鴨具有良好HA免疫原性的口服生物制劑，為后續開發操作簡便、安全的鴨禽流感口服疫苗提供可行的實踐路徑。

關鍵詞：

錨定序列；乳酸乳球菌；禽流感；雛鴨；HA

中圖分類號：

S834；Q939.94 """"文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0774-14

收稿日期：2024-03-22

基金項目：校企合作產學研項目（h2019364；h20220334）

作者簡介：吳佳輝（1999-），男，廣東普寧人，博士生，主要從事微生物與免疫研究，E-mail：1142620951@stu.scau.edu.cn；沈世彥（2001-），男，湖南婁底人，碩士生，主要從事微生物學和合成生物學研究，E-mail：EnshWinter@163.com。吳佳輝和沈世彥為同等貢獻作者

*通信作者：張玲華，主要從事微生物與免疫研究，E-mail：lhzhang@scau.edu.cn

Construction of Recombinant Lactococcus lactis Inducible Expressing HA Protein of H5N1

Subtype Avian Influenza Virus and Analysis of Its Immunogenicity in Ducks

WU" Jiahui， SHEN" Shiyan， DENG" Jinbo， WU" Haiyang， REN" Zhixin， WU" Yangbo， HUANG" Juan， HUANG" Haobin， PAN" Weixiong， ZHAO" Zengjue， HE" Rongxiao， SUN" Chongjun， ZHANG Linghua*

（Guangdong Provincial Key Laboratory for the Development Biology and Environmental Adaptation of Agricultural Organisms， College of Life Sciences， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642，" China）

Abstract：

Avian influenza， caused by avian influenza viruses， is a highly contagious disease characterized by high mortality rates among infected poultry， posing significant health risks to poultry and economic burdens. However， the majority of duck farming comprises small-scale and free-range practices， where environmental conditions vary and ducks are prone to diseases. In such scenarios， traditional vaccination practices present challenges such as inconvenient injection and immunological stress. To tackle this issue， this study devised a method to produce a convenient and safe oral biological agent of hemagglutinin （HA） tailored specifically for ducklings. We constructed the anchoring sequence （pgsA， BmpA， cA， and M6）- GFP reporter expression system， enabling the visualization of different anchoring sequences′ effects on surface-displayed proteins in Lactococcus lactis （L. lactis）. With this system， we successfully identified BmpA and cA as efficient anchoring sequences in L. lactis. After comparing the expression efficiency of HA in L. lactis and optimizing the codons， we selected the optimized HA gene sequence and connected it with BmpA and cA. Then， we co-integrated them into the expression plasmids of L. lactis. Subsequently， we introduced the constructed expression plasmids into L. lactis containing the integrated HA1 gene in the genome， thereby generating recombinant L. lactis capable of both inducible secretory expression and surface display of HA（NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1 and NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA）. The ELISA results indicated that orally administered inducible secretory-surface display recombinant L. lactis eliciteds superior levels of HA-specific IgG in duckling serum compared to single-expression recombinant L. lactis treatment. This study successfully established the Anchoring sequence-GFP screening system for Lactobacillus， identifying efficient anchoring sequences suitable for L. lactis， thereby achieving efficient expression of HA on the surface of L. lactis. Subsequently， in conjunction with the genomic secretion expression， we successfully obtained an oral biological agent with satisfactory HA immunogenicity for ducklings. This achievement offers a practical and feasible strategy for the subsequent development of convenient and safe avian influenza oral vaccines.

Key words：

anchoring sequence; Lactococcus lactis; avian influenza; duckling; HA

*Corresponding author： ZHANG Linhua， E-mail： lhzhang@scau.edu.cn

禽流感是一種具有極高傳染性和致病性的疾病，其由禽流感病毒通過禽類呼吸道、消化道、糞便以及淚液進行傳播。各個年齡段的禽類均可感染發病，尤其是雛雞、雛鴨和雛鵝易感染且死亡率較高，已經嚴重阻礙養禽業的經濟發展 ［1］。且不同于雞類的集約化養殖，鴨類養殖多為散戶散養，環境多變，從而導致雛鴨更易患病。目前，禽流感的最有效的控制方法是接種疫苗，但由于禽類疫苗注射操作繁瑣，且易引起免疫應激，從而致使禽類免疫力下降，難以達到理想效果。因此，本研究旨在利用益生菌遞送抗原蛋白的基礎上，開發一種便捷、安全的可預防禽流感的口服生物制劑。

表面展示系統是一種將外源蛋白錨定在細胞表面的技術，根據外源蛋白在細菌表面的展示方式和錨定序列的類型，可將錨定方式分為跨膜錨定、脂蛋白錨定、LPXTG序列基序錨定以及非共價結合域介導的錨定［3］。跨膜錨定利用細菌的Sec通路，將外源蛋白以未折疊狀態運輸到細胞膜上，并通過跨膜錨定序列將其錨定在細胞表面［4］。脂蛋白錨定則通過脂蛋白的lipobox基序使外源蛋白與細胞膜的磷脂共價結合［5］。LPXTG序列基序錨定通過利用LPXTG基序將外源蛋白共價連接到細胞壁肽聚糖上［6］。非共價結合域介導的錨定通過與細菌表層蛋白質或其他結構域的相互作用將外源蛋白非共價地錨定在細菌細胞壁上［7］。不同類型的錨定序列會對蛋白的表面展示效果產生不同的影響，需要根據表達宿主類型和展示效果等因素進行靈活選擇。篩選適合的錨定序列，將蛋白高效錨定于細菌表面，不僅可以增強其對惡劣環境條件的抵抗力，還可以避免被胞外環境所稀釋，從而顯著提高錨定蛋白的濃度和活性。特別是在疫苗研發中，通過表面展示技術將免疫抗原直接錨定在菌體表面，可更好地激活宿主免疫系統，從而提高免疫應答效果。然而，篩選出高效的錨定序列并非易事，需要研究者進行大量的試驗探索和分析工作。

乳酸菌（lactic acid bacteria， LAB）是一類能利用碳水化合物進行發酵，產生乳酸作為主要代謝產物的細菌的統稱［8］，屬于革蘭陽性菌，菌體多呈球狀或桿狀，無孢子形成，在低pH環境中具有較高的耐受性［9-10］。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis， L. lactis）是乳酸菌的模式菌種，在食品工業中常用于奶制品的發酵，被公認為安全的 （generally regards as safe， GRAS） 食品級微生物［2］，同時也被證實對腸道健康和免疫功能有益。現如今，乳球菌的遺傳背景已經得到深入解析，因其無致病性、抗原性弱及自身分泌蛋白少等特點，已經成為表達外源蛋白的理想宿主，并在口服免疫制劑的開發中展示出巨大潛力［11-12］。口服后的乳球菌在腸道內會受到嚴峻的酸性環境和各種消化液等因素的影響，盡管乳球菌具有一定的抗酸性，但能長時間存活的可能性較低［13-14］。因此，我們考慮采用分泌聯合表面展示的方式來表達抗原蛋白。這種策略可確保當乳球菌處于活躍狀態時，抗原蛋白可通過分泌和表面展示兩種方式進入腸道，刺激腸道黏膜免疫，并進一步引起系統性免疫。而當乳球菌因腸道環境失去活性，導致其無法分泌抗原蛋白后，仍然可以通過菌體表面的抗原蛋白與腸道中的抗原提呈細胞接觸并發揮免疫刺激作用。通過這種聯合表達策略，可在最大程度確保機體獲得足夠的抗原劑量，從而達到理想的免疫激活效果。

在本研究中，我們構建了一系列的錨定序列-GFP系統，借助該系統篩選出能夠在乳酸乳球菌中高效表面展示蛋白的錨定序列。隨后，我們采取分泌聯合表面展示的表達策略，在乳酸乳球菌中成功表達禽流感血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白。最終，我們開發了一種操作簡便、安全的可預防禽流感的口服生物制劑，并在雛鴨上驗證了其免疫功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和質粒

本研究使用的菌株和質粒如表1所示。

1.1.2 主要試劑

限制性內切酶Hind Ⅲ、Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Xho Ⅰ購自TaKaRa公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗雞IgG、雞源HA的多克隆抗體、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗鴨IgG購自Abmart公司。

1.1.3 試驗鴨

1日齡未接種禽流感疫苗櫻桃谷鴨，購自佛山三水某集約化養殖場，于廣州市華南農業大學實驗動物中心養至10日齡。所有的動物實驗程序都得到了華南農業大學動物保護與使用委員會（the Institutional Animal Care and Use Committees （IACUC））的批準。

1.1.4 HA 基因

根據NCBI數據庫中的H5N1亞型的HA基因序列（GenBank： AF144305.1），進行乳酸菌偏好性的密碼子優化，委托蘇州金唯智生物科技有限公司分別合成優化前和優化后的基因序列，成熟肽的原始序列命名為HA0，優化后的成熟肽序列命名為HA1，HA0序列前面額外帶有USP45的信號肽序列SPUsp45， 分別置于pUC57-HA0和pUC57-HA1質粒。

1.1.5 引物

本試驗使用的引物如表2所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 錨定序列-GFP重組乳酸乳球菌的構建

根據NCBI數據庫的基因序列信息，分別設計pgsA（GenBank： AB016245.1）、BmpA（GenBank： AM406671.1）、cA（GenBank： U17696.1）、M6（GenBank： M11338.1）和GFP（GenBank： JF951864.1）的特異性引物pgsA F/R、BmpA F/R、cA F/R、M6 F/R、PB-GFP F/R和GFP-CM F/R（表2），以pUC-pgsA、pUC-BmpA、pUC-GW-cA-M6和pUC19-GFP（表1）質粒為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證結果，通過試劑盒進行純化回收正確PCR產物。

對質粒pNZ8148（表1）進行HindⅢ和NcoⅠ雙酶切，并通過無縫克隆的方法，利用上述PCR產物構建4個GFP表達載體pNZ8148-pgsA-GFP、pNZ8148-BmpA-GFP、pNZ8148-GFP-cA和pNZ8148-GFP-M6。連接產物熱激轉化至大腸桿菌MC1061，并進行菌落PCR和測序驗證。將構建成功的4個GFP表達載體和空載pNZ8148分別電轉至乳酸乳球菌NZB，利用含氯霉素的GM17固體培養基篩選陽性轉化子，并再次進行菌落PCR和測序驗證。構建成功的重組乳酸乳球菌命名為NZB-BmpA-GFP、NZB-GFP-cA、NZB-GFP-M6、NZB-pgsA-GFP和NZB-pNZ8148。

1.2.2 錨定序列-GFP的蛋白表達和檢測

將重組乳酸乳球菌接種到含有氯霉素的GM17液體培養基，于30℃條件下靜置培養過夜。過夜培養的菌液以1∶50的比例接種到含有氯霉素的GM17液體培養基，在30℃條件靜置培養至OD600 mm到0.4左右。然后加入50 ng·mL-1濃度的誘導劑乳鏈菌肽（nisin）誘導3 h，使用SDS-PAGE電泳檢測誘導后的樣品。以空白質粒pNZ8148電激轉化NZB獲得的NZB-pNZ8148，作為空白對照組。用GM17液體培養基將誘導后的5組菌液的OD600 nm統一調整為1，通過多功能酶標儀SpectraMax i3x測定相對熒光強度［16］。

相對熒光強度=試驗組熒光強度/空白對照組熒光強度。

1.2.3 誘導分泌型HA基因在乳酸乳球菌基因組的整合

根據信號肽SPUsp45、SP-HA0和HA1的序列信息，設計特異性引物SP F/R、HA0 F/R和HA1 F/R（表2），以pUC57-HA0和pUC57-HA1（表1）為模板進行PCR擴增得到三者PCR產物，使用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。通過Overlap PCR把信號肽SP加在HA1序列前端，得到的序列命名為SP-HA1。使用Xba Ⅰ和Xho Ⅰ酶切pJW4.1n載體和片段，使用T4連接法分別將SP-HA0和SP-HA1連接到pJW4.1n上，熱激轉化大腸桿菌MC1061，37℃抗性平板培養過夜，挑單菌落，以引物Pz F/Ter R（表2）進行菌落PCR驗證，瓊脂糖凝膠電泳檢測菌落PCR產物，對檢測結果為陽性的樣品提取質粒，送擎科生物公司測序。構建成功的質粒pJW4.1n-HA0和pJW4.1n-HA1分別電激轉化至乳酸乳球菌NZB［17］，質粒pJW4.1n含有LacZ基因整合位點的上下游同源臂His a和His b，可將外源片段定向整合到乳酸乳球菌NZB基因組上，替換LacZ基因。成功后分別命名為NZB-HA1和NZB-HA0。

1.2.4 Western blot檢測

將待檢測蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后將蛋白轉印至PVDF膜［生工生物工程（上海）股份有限公司］上，以小鼠抗His-tag單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG作為二抗，利用化學發光成像儀（ChemiScope 3300Mini）檢測結果。

1.2.5 誘導分泌型 HA 重組乳酸乳球菌的誘導表達和檢測

挑取單菌落，接種到含有Amp抗生素的GM17液體培養基，于30℃條件靜置培養過夜，過夜培養的菌液以1∶50的比例接種到新鮮的含有Amp抗生素的GM17液體培養基，于30℃條件靜置培養至OD600 nm到0.4左右，加入誘導劑nisin，終濃度為50 ng·mL-1，誘導3 h。誘導完成后破碎細胞，使用雞源HA的多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗雞IgG作為二抗，進行Western blot檢測。

1.2.6 誘導型分泌-表面展示乳酸乳球菌的構建

根據BmpA、cA和SP-HA1的序列信息，設計特異性引物BmpA-HA1（1）F/R、BmpA-HA1（2）F/R、HA1-cA（1）F/R、HA1-cA（2）F/R（表2）進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證。得到的BmpA、cA和SP-HA1產物通過試劑盒純化回收。以無縫克隆的方法與經過雙酶切的pNZ8148連接，熱激轉化至大腸桿菌MC1061，對轉化子進行菌落PCR和測序驗證。構建成功后的質粒分別命名為pNZ8148-HA1、pNZ8148-BmpA-HA1和pNZ8148-HA1-cA。將pNZ8148-HA1電激轉化入乳球菌NZB，pNZ8148-BmpA-HA1和pNZ8148-HA1-cA同時電轉入乳球菌NZB和NZB-HA1。構建成功的乳酸菌分別命名為NZB-pNZ8148-HA1（對照）、NZB-pNZ8148-BmpA-HA1（表面展示）、NZB-pNZ8148-HA1-cA（表面展示）、NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA（基因組整合分泌+表面展示）。

1.2.7 乳酸乳球菌細胞膜組分的提取

取1 mL誘導后的菌液，在4℃條件下以4 000×g的離心力離心5 min，棄去上清。菌體以500 μL TES溶液重懸，在4℃條件下以4 000×g的離心力離心5 min，棄去上清，重復兩次。用500 μL TES-裂解緩沖液重懸菌體，37℃孵育1 h。在4℃條件下以4 000×g的離心力離心10 min棄去上清。以500 μL TES溶液重懸，在4℃條件下，4 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，重復兩次。加入500 μL ddH2O，反復凍融5次，在4℃條件下以21 000×g的離心力離心50 min，棄去上清。用100 μL 1×TE緩沖液重懸［18］，-20℃保存或直接制成蛋白樣品，使用雞源HA的多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗雞IgG作為二抗，進行Western blot檢測。

1.2.8 雛鴨免疫評價

將10日齡雛鴨分為6組，每組5只，分別為PBS組、NZB-pNZ8148-HA1免疫組、NZB-pNZ8148-BmpA-HA1免疫組、NZB-pNZ8148-HA1-cA免疫組、NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1免疫組和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA免疫組（表3）。將構建好的各組重組乳酸乳球菌在OD600 nm為0.4時加入終濃度為50 ng·mL-1 nisin誘導3 h，在4℃條件下，4 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，收集菌體，用PBS洗滌，混懸定容，通過GM17固體培養基菌落計數，計算各組需要喂飼雛鴨的活菌數，劑量為1×1011 CFU·只-1，每只雛鴨100 μL，PBS對照組為100 μL PBS，通過灌胃的方式喂飼，連續免疫7 d［19］。每組重復3次。

1.2.9 ELISA檢測雛鴨HA特異性IgG表達水平

免疫結束3、7 d后，采集6個試驗組雛鴨血液，37℃恒溫箱中靜置1 h，轉移至4℃條件靜置2 h，3 000 r·min-1離心30 min，分離上清，-80℃保存。

將待測血清稀釋后，以辣根過氧化物酶標記的兔抗鴨IgG作為抗體，進行ELISA檢測HA特異性IgG表達水平，使用自動酶標儀（SpectraMax i3x）測定各孔的光吸收值（OD450 nm），并計算待測血清OD450 nm值與陰性血清OD450 nm值的比值（P/N值）。當P/N值大于2.0時，認為是陽性；反之，則認為是陰性［20］。結果以P/N值為陽性的血清最大稀釋度為該血清的滴度，用2的指數表示。

1.2.10 數據分析

所有試驗均設置了至少三個重復組，使用GraphPad Prism 9軟件數據統計分析和圖表繪制，結果表示為平均值±標準誤差，并進行差異顯著性分析。采用單向或雙向方差分析（ANOVA）和t檢驗確定了試驗組與對照組以及試驗組之間的差異。當P＜0.05時，表示具有統計學顯著性差異；當P＜0.01時，表示具有高度顯著性差異。

2 結 果

2.1 乳酸乳球菌錨定序列-GFP篩選系統的構建

2.1.1 錨定序列-GFP篩選系統的載體構建

利用特異性引物擴增得到的4個錨定序列pgsA、BmpA、cA、M6和報告基因GFP產物，將上述產物（圖1A）與pNZ8148（表1）雙酶切產物（圖1B）經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果與預期大小相一致。

將得到的4種錨定序列跟GFP分別組合，連接到雙酶切后pNZ8148質粒上，熱激轉化至DH5α中，測序證明，成功構建pNZ8148-pgsA-GFP、pNZ8148-BmpA-GFP、pNZ8148-GFP-cA和pNZ8148-GFP-M6四個表達載體。隨后將四個表達載體電擊至乳酸乳球菌NZB，成功獲得四株表達菌株，分別命名為NZB-BmpA-GFP、NZB-GFP-cA、NZB-GFP-M6和NZB-pgsA-GFP。隨后將四株表達菌株進行誘導表達，表達完成后用SDS-PAGE電泳檢測。結果表明，在誘導后的重組乳酸乳球菌中，均有融合蛋白的表達（圖2），并且與預期相對分子質量大小相符，證明GFP與錨定序列實現了融合表達。以上結果說明我們成功構建了乳酸乳球菌錨定序列-GFP 篩選系統。

2.1.2 乳酸乳球菌高效錨定序列的篩選

用GM17液體培養基將誘導后的四組重組乳酸乳球菌的OD600 nm值調整至1后，用熒光顯微鏡觀察GFP的表達情況，并通過酶標儀檢測相對熒光強度，結果如圖3。通過圖3E的相對熒光強度數據圖可知BmpA-GFP（圖3A）和cA-GFP（圖3B）均表現出高水平的GFP相對熒光強度，且顯著高于融合了 M6-GFP（圖3C）和pgsA-GFP（圖3D）。上述結果表明，我們成功利用該報告系統篩選出BmpA和cA兩個高效錨定序列。這一研究結果也為乳酸乳球菌表面展示系統的開發提供了有價值的參考。

2.2 乳酸乳球菌基因組中HA基因定向整合及HA的誘導表達

2.2.1 乳酸乳球菌基因組中的誘導分泌型HA基因整合

考慮到HA蛋白具有的高度保守性和免疫原性以及H5亞型禽流感在人畜和禽類之間相比其他亞型傳播率較高［21］，我們選擇H5亞型禽流感病毒的HA蛋白作為疫苗抗原。為了在乳球菌中高效表達HA，我們對其基因序列進行了密碼子優化。然而，需要注意的是，經過密碼子優化的蛋白在構象、折疊和穩定性可能會受到不同程度的影響［22］，也有可能會影響翻譯速率，蛋白合成效率等過程，從而影響蛋白質的最終表達效果［23］。因此，我們需要比較HA0和HA1的表達情況。

我們首先以pUC57-HA0（表1）和pUC57-HA1（表1）為模板，PCR擴增得到信號肽SP、SP-HA0和HA1基因序列，使用Overlap PCR對SP和HA1進行拼接得到SP-HA1，并對pJW4.1n（表1）進行酶切，產物均使用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。結果如圖4所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果的條帶基本與各目的條帶大小相符。

將SP-HA1和SP-HA0與PJW4.1n（表1）進行連接后，轉入乳球菌NZB（表1）中。在含有nisin和X-Gal的GM17固體培養基培養過夜，挑選白色菌落（圖5A），用引物Pz F/Ter R（表2）進行菌落PCR驗證（圖5B），結果表明成功獲得了陽性克隆。

2.2.2 密碼子優化后的HA1與HA0的誘導表達比較

對NZB-HA0和NZB-HA1誘導表達后，進行Western blot驗證和表達量分析（圖6）。如圖6所示，相較于未優化的HA，優化后的HA1在蛋白表達水平上并無顯著差異。但考慮到密碼子優化可有效促進mRNA與宿主細胞tRNA的相互作用，減少由稀缺密碼子導致的翻譯延遲和錯配［24］，我們選擇了HA1進行后續試驗。

2.3 誘導型分泌-表面展示乳酸乳球菌的構建及其分泌和展示功能

我們將前面試驗（2.1.1）篩選獲得的較理想BmpA和cA錨定序列分別與SP-HA1相連后，連接到pNZ8148質粒上，并分別電擊轉化進乳酸乳球菌NZB-HA1和NZB。對重組乳酸乳球菌誘導表達后，進行Western blot檢測。結果顯示NZB-pNZ8148-HA1（圖7A泳道3）只表達了分泌型HA蛋白，無表面展示型HA蛋白表達。而NZB-pNZ8148-BmpA-HA1（圖7A泳道7）和NZB-pNZ8148-HA1-cA（圖7A泳道8）無分泌型HA蛋白表達。在NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA中，存在分泌型和表面展示型兩種類型的HA（圖7A泳道1和2）。

為進一步驗證融合蛋白的HA是否錨定在細胞壁上，對NZB-pNZ8148-BmpA-HA1（圖7B泳道10）和NZB-pNZ8148-HA1-cA（圖7B泳道11）提取細胞膜組分后進行Western blot檢測，結果顯示兩者都有相應的條帶，且分子量均大于NZB-pNZ8148-HA1表達的分泌型HA蛋白（圖7B泳道9），證明了HA成功錨定在細胞表面。

2.4 對雛鴨的免疫原性分析

我們采用ELISA的方法檢測各組雛鴨的血清中HA特異性IgG（圖8）。以PBS組作為空白對照，5組均呈現陽性結果。這些結果表明，5種重組乳酸乳球菌都對雛鴨提供了有效的免疫保護，與單獨分泌表達HA的乳酸乳球菌（NZB-pNZ8148-HA1）相比，通過表面展示表達HA的乳酸乳球菌（NZB-pNZ8148-BmpA-HA1、NZB-pNZ8148-HA1-cA、NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA）能誘導雛鴨血清更高的HA特異性IgG。特別值得注意的是，相比于分泌或表面展示單獨表達的重組乳酸乳球菌（NZB-pNZ8148-HA1、NZB-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-pNZ8148-HA1-cA），口服誘導型分泌-表面展示乳酸乳球菌（NZB-HA1-pNZ8148-BmpA-HA1和NZB-HA1-pNZ8148-HA1-cA）能夠誘生更高水平的雛鴨HA特異性IgG，表明誘導型分泌-表面展示乳酸乳球菌具備良好的免疫原性，可以提供更佳的免疫保護效果。

3 討 論

禽流感作為一種嚴重的動物傳染病，對禽類養殖業和人類健康造成了巨大的威脅。目前，接種疫苗是控制禽流感傳播的主要方法之一。然而，現有的禽流感疫苗多為注射型，該類型疫苗廣泛應用于雞類的集約化養殖，但在鴨類養殖中，由于多為散戶放養，注射疫苗不僅操作繁瑣且易引起應激，進而導致免疫力下降。尤其對于雛鴨而言，其免疫系統發育尚不完善，更易受到疾病侵襲［25］。此外，現階段禽流感疫苗的研究主要集中于雞和小鼠［26-27］，缺乏針對鴨類的有效疫苗。因此，我們制備了一種對雛鴨具有良好HA免疫原性的口服益生菌生物制劑，為后續開發新型禽流感口服疫苗提供了可行性策略。

目前，禽流感疫苗抗原蛋白主要包括血凝素、神經氨酸酶（neuraminidase， NA）和核蛋白（nucleoprotein， NP）等。其中，HA因其在同種禽流感亞型中的具有高度保守性和免疫原性，已經成為禽流感疫苗開發中最常用的抗原之一。同時，大量研究結果證實，HA作為禽流感抗原疫苗具有廣譜性和有效性［28-30］。在先前報道的研究中，研究者曾采用植物乳桿菌作為表達載體表達HA，結果顯示，在以雛雞作為免疫評價對象時，其效價可達到7log2［31］，與本研究中分泌聯合表面展示型的乳酸乳球菌達到的效價相似。

常用的口服益生菌遞送系統的菌株包括植物乳桿菌［32］、沙克乳酸桿菌［33］和雙歧桿菌［34］等，其中最常用的是乳酸菌屬。乳酸乳球菌作為乳酸菌的模式菌種，是一種公認安全的益生菌，其生物遺傳背景清晰，使用乳酸乳球菌作為提送載體是保證疫苗安全性的理想選擇。且有研究報道，一種表達ompA蛋白的重組乳酸乳球菌，口服后在小鼠腸道有良好的定植率［35］，表明乳球菌可以克服胃腸道的特殊環境（胃部酸性、胃腸道富含酶類和膽汁酸），在腸道中保持一定時間的活性。本研究中的重組乳酸乳球菌采用表面展示與分泌雙重表達方式表達HA蛋白，使其在腸道處于活躍狀態時，可以通過雙重表達為機體提供足夠的抗原量，而當其失去活性后，仍可以通過表面展示的HA蛋白繼續發揮抗原遞送作用。

蛋白的錨定效果受不同錨定序列的性質而有所不同，需要根據不同研究或應用的需求選取合適的錨定序列。本文選取的這4個錨定序列（pgsA、BmpA、cA、M6）在先前的研究中都被證明具有高效錨定蛋白的潛力［36-38］，但如何快速篩選出最適合在乳酸乳球菌中發揮作用的錨定序列仍是一個挑戰。我們通過在乳酸乳球菌構建錨定序列-GFP篩選系統，通過比較4種錨定序列對GFP的錨定效果，成功篩選出BmpA和cA作為乳酸乳球菌表面展示系統中的高效錨定序列，這一研究結果也為乳酸乳球菌表面展示系統的開發提供了有價值的參考。我們通過BmpA和cA錨定序列成功實現在乳酸乳球菌表面展示HA之后，再聯合分泌表達HA，進一步增強了重組乳酸乳球菌的抗原遞送效果。現如今，研究者常采用表面展示技術或胞外分泌的方式表達抗原蛋白［37-39］，但鮮有采用表面展示聯合胞外分泌的方式表達抗原蛋白的報道。此舉將為疫苗研發領域提供新的思路和方法，有望進一步增強疫苗的免疫原性和保護效果。

最后，我們利用雛鴨對構建出的重組乳酸乳球菌進行了免疫原性分析，相比于分泌或表面展示單獨表達的重組乳球菌，口服誘導型分泌-表面展示乳酸乳球菌能夠誘導雛鴨血清中更強的HA特異性IgG應答。但需要指出的是，本研究只是初步確認其免疫功能，后續的口服劑量、免疫時間和免疫次數等免疫程序的選擇，以及是否對其他禽類有同樣的免疫保護作用等有待進一步研究。

4 結 論

本研究建立了錨定序列-GFP篩選系統，利用該系統對不同錨定序列在乳酸乳球菌內蛋白表面展示效果進行了評估，篩選出能夠在乳酸乳球菌中高效發揮作用的錨定序列。同時，成功實現了HA蛋白在重組乳酸乳球菌中的誘導型分泌和表面展示的復合表達。最后通過對雛鴨的免疫原性分析，表明口服誘導型分泌-表面展示乳酸乳球菌具有良好的HA免疫原性，能夠刺激機體產生免疫應答。本研究結果為進一步優化雛鴨口服疫苗設計提供了重要參考，為禽類養殖的禽流感疫苗研發和免疫防控提供了新的思路和實踐路徑。

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（編輯 白永平）