鴨瘟病毒TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

摘 要：

為建立一種鴨瘟病毒（duck plague virus， DPV）TaqMan熒光定量PCR快速檢測方法，基于DPV US6基因保守序列設計特異性引物和探針，構建重組質粒DPV-US6標準品，對方法敏感性、特異性和重復性進行評價，并應用于DPV在雞胚成纖維細胞（CEF）上增殖及人工感染鴨器官組織上分布規(guī)律研究。結果顯示，成功建立了DPV TaqMan熒光定量PCR檢測方法，該方法最低檢測限可以達到10 copies·μL-1，與番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、H9N2亞型禽流感病毒、鴨甲型肝炎病毒（I型和III型）和鴨衣原體均無交叉反應，批間和批內變異系數(shù)均小于2.0%。DPV-AX株感染CEF細胞后，病毒核酸拷貝數(shù)檢測結果表明，4～8 h病毒增殖緩慢，12～60 h迅速上升，60 h達到最高峰，72～144 h逐漸下降，與TCID50法測定的病毒滴度相比，兩種檢測方法具有良好相關性，可實現(xiàn)拷貝數(shù)替代TCID50。DPV人工感染鴨組織臟器的病毒載量分布檢測表明，肝臟中的病毒載量最高。本試驗建立的檢測方法為研究DPV-AX株在CEF上的增殖規(guī)律提供工具。

關鍵詞：

鴨瘟病毒；US6基因；TaqMan探針；熒光定量PCR；增殖規(guī)律；人工感染

中圖分類號：

S852.659.1"""" 文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0765-09

收稿日期：2024-03-11

基金項目：北京市農林科學院科技創(chuàng)新能力建設專項（KJCX20220422）；現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系北京市家禽創(chuàng)新團隊（BAIC06-2024）

作者簡介：于江瑋（1997-），男，內蒙古烏海人，碩士生，主要從事畜禽疫病診斷與防治研究，E-mail：625744906@qq.com

*通信作者：胡 格，主要從事中藥抗病毒機理研究，E-mail：bnhuge@126.com；楊志遠，主要從事畜禽疫病診斷與防治研究，E-mail：yangzy88@126.com

Establishment and Application of TaqMan Fluorescent Quantitative PCR Detection Method for Duck Plague Virus

YU" Jiangwei1， CHENG" Huimin2， LIN" Jian2， YANG" Baolin2， HUANG" Cheng2， YANG" Zhiyuan2*， HU" Ge1*

（1.College of Animal Science and Technology， Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China;

2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Beijing 100097，" China）

Abstract：

To establish a rapid TaqMan fluorescent quantitative PCR detection method for duck plague virus （DPV）， specific primers and probes were designed based on the conserved sequence of the DPV US6 gene， and a recombinant plasmid DPV-US6 standard was constructed. The sensitivity， specificity， and reproducibility of the method were evaluated， and it was applied to study the proliferation of DPV in chicken embryo fibroblast （CEF） cells and the distribution pattern of virus load in the organs and tissues of artificially infected ducks. The results showed that the DPV TaqMan fluorescent quantitative PCR detection method was successfully established， with a minimum detection limit of 10 copies·μL-1. There was no cross-reaction with Muscovy duck parvovirus， duck circovirus， duck Tembusu virus， duck reovirus， H9N2 subtype avian influenza virus， duck hepatitis A virus types I and III， or duck chlamydia. The inter-batch and intra-batch coefficient of variation were both less than 2.0%. After DPV-AX strain infected CEF cells， the viral nucleic acid copy number detection results indicated that the virus proliferated slowly from 4 to 8 hours， rapidly increased from 12 to 60 hours， peaked at 60 hours， and gradually declined from 72 to 144 hours. Compared with the virus titer determined by the TCID50 method， the two detection methods showed good correlation， allowing the copy number to replace TCID50. The virus load distribution detection in organs and tissues of ducks artificially infected with DPV showed the highest virus load in the liver. The detection method established in this experiment provides a tool for studying the proliferation pattern of the DPV-AX strain in CEF cells.

Key words：

duck plague virus; US6 gene; TaqMan probe; fluorescence quantitative PCR; proliferation characteristics; artificial infection

*Corresponding authors： HU Ge，E-mail：bnhuge@126.com；YANG Zhiyuan，E-mail：yangzy88@126.com

鴨瘟（duck plague，DP）又稱鴨病毒性腸炎（duck virual enteritis，DVE），是由鴨瘟病毒（duck plague virus，DPV）引起鴨、鵝等水禽的一種急性、熱性、敗血性傳染病，具有流行范圍廣，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高等特征［1］。1923年該病由Baudet首次在荷蘭報道［2］，黃引賢于1957年在我國廣東省首次發(fā)現(xiàn)該病［3］，Bos等［3］首次分離鑒定并保存了鴨瘟病毒。DPV屬于皰疹病毒科（Herpesvirales）、α-皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）、馬立克病毒屬（Mardi-virus）成員，只有一種血清型［4］。鴨自然感染DPV潛伏期達2～5 d，人工感染DPV潛伏期1～3 d［5］ 。目前為止我國已有許多地區(qū)分離出DPV，DPV可感染不同品種和日齡的鴨，嚴重威脅我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。建立快速和特異的檢測方法，對于臨床該病的診斷和防控具有重要意義。

目前DPV的檢測方法有血清中和試驗（SN）、熒光定量PCR和聚合酶鏈式反應（PCR）等［6，7］，其中熒光定量PCR與常規(guī)PCR相比其敏感性高、特異性強和重復性好，具有實時性和準確性等優(yōu)點［8］。熒光定量PCR包括SYBR Green染料法和TaqMan探針法，相比染料法，探針法更敏感、數(shù)據(jù)更精確、能夠與雙鏈DNA特異性的結合［9］，以TaqMan探針為基礎，出現(xiàn)了多種改良方法，包括TaqMan-MGB法［10］ 、Molecular beacon法［11］ 、Lightcycler法［12］ 、LUX-PCR法［13］、UT-PCR法［14］、復合探針法［15］等。

US6基因是DPV增殖的必需基因［16］ ，編碼的gD蛋白參與病毒的吸附和穿膜作用，是DPV重要的囊膜蛋白［17］。US6基因在皰疹病毒中高度保守［18］ ，可作為熒光定量PCR引物設計的靶點。目前關于DPV US6基因有SYBR Green染料法熒光定量PCR［5］ ，未見有探針法熒光定量PCR的報道。因此，本研究基于DPV的US6基因高度保守序列設計特異性引物和探針，建立以DPV US6基因為靶點的TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法，應用于DPV-AX株在CEF細胞中的增殖規(guī)律和DPV人工感染鴨組織臟器的病毒載量分布情況研究，為DPV診斷、防控及致病特性的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞和實驗動物

鴨瘟病毒（DPV-AX株104.5 TCID50·0.1 mL-1），由北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定并保存；鴨瘟病毒標準強毒株（CVCCAV1221，108MLD），由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus， DTMUV）、H9N2亞型禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）、鴨呼腸孤病毒（duck reovirus， DRV）、番鴨細小病毒（muscovy duck parvovirus， MDPV）、鴨圓環(huán)病毒（duck circovirus， DuCV）核酸樣本，由北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供；鴨衣原體（duck chlamydia）核酸樣本，由中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院提供；鴨甲型肝炎I型和III型病毒（duck hepatitis virus， DHV-I和DHV-III）核酸樣本，由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司提供。

雞胚成纖維細胞（chicken embryo fibroblast， CEF），由北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所制備。

10只30日齡雛鴨，購自北京金星鴨業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

RNA/DNA提取試劑盒、pMD19-T克隆載體、DH5α感受態(tài)細胞、質粒提取試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司；凝膠回收試劑盒、Medium 199培養(yǎng)基、胰蛋白酶，均購自賽默飛世爾科技有限公司；通用型探針法定量PCR檢測試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；新生牛血清，購自蘭州民海生物工程有限公司。

熒光定量PCR儀、VeritiTM PCR儀、NanoDrop微量UV-Vis分光光度計，賽默飛世爾科技有限公司產品；凝膠成像系統(tǒng)，伯樂生命醫(yī)學產品有限公司產品；CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司產品；倒置顯微鏡，德國徠卡公司產品。

1.3 熒光定量PCR檢測方法的建立

1.3.1 引物設計與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫中DPV US6基因序列（JQ673560）設計1對常規(guī)PCR引物DPV-F/DPV-R，1對TaqMan熒光定量PCR引物DPV-q1-F/DPV-q1-R和TaqMan探針，1對SYBR Green熒光定量PCR引物DPV-q2-F/DPV-q2-R（表1），常規(guī)PCR引物擴增序列包含熒光定量PCR引物擴增序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 重組質粒標準品的制備

取300 μL鴨瘟病毒液（DPV-AX株），按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病毒基因組DNA。利用引物DPV-F/R進行PCR反應。50 μL反應總體系：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1 each） 4 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerse 1 μL，上、下游引物（DPV-F/R）各1 μL，模板2 μL，滅菌水21 μL。反應程序：98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃延伸30 s，共30個循環(huán)。

回收擴增得到的目的片段連接至pMD19-T載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選，挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，提取質粒進行測序，將測序正確的陽性質粒命名pMD19T-US6。測定陽質粒標準品濃度，根據(jù)濃度與拷貝數(shù)之間的換算關系：（6.02×1023）×（ng·μL-1×10-9）/（DNA length×660）=copies·μL-1，計算標準品拷貝數(shù)。

1.3.3 引物及探針濃度的優(yōu)化

在反應體系中分別加入終濃度0.1、0.2、0.3、0.4 μmol·L-1的引物（DPV-q1-F/R）和TaqMan探針，采用矩陣法確定引物和探針的最佳工作濃度。設定退火溫度分別為58、59、60、62℃，通過擴增效率確定最佳退火溫度。

1.3.4 標準曲線的建立

將重組質粒標準品10倍梯度稀釋，以1.0×101～1.0×1010copies·μL-1濃度標準品為模板，根據(jù)優(yōu)化后的最佳反應體系和程序進行檢測，設ddH2O作為陰性對照。初始模板重組質粒DNA拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標（X軸），循環(huán)數(shù)Ct值為縱坐標（Y軸）繪制標準曲線。

1.3.5 熒光定量PCR敏感性試驗

以1.0×101～1.0×109 copies·μL-1濃度標準品為模板，進行熒光定量PCR檢測，同時與常規(guī)PCR和SYBR Green染料法熒光定量PCR進行敏感性比較。

1.3.6 熒光定量PCR特異性試驗

以DPV、MDPV、DuCV、Duck chlamydia、DHV-I和DHV-III的DNA樣本及DTMUV、AIV、DRV的cDNA樣本為模板，設ddH2O作為陰性對照，進行熒光定量PCR檢測。

1.3.7 熒光定量PCR重復性試驗

以1.0×102～1.0×107 copies·μL-1濃度標準品為模板，每個稀釋度做3次重復進行批內重復性試驗；同一批質粒選取3個不同時間段進行3次批間重復性試驗，設ddH2O作為陰性對照，計算批內和批間的變異系數(shù)。

1.4 熒光定量PCR檢測方法的應用

1.4.1 DPV增殖規(guī)律的研究

DPV-AX株以0.1MOI接種至已長滿致密單層的CEF中，37℃吸附1h，棄去病毒液更換維持液（含2% 新生牛血清的M199）。取吸附后不同時間點上清液離心，置-80℃保存；加入等體積無菌PBS反復凍融3次取細胞液離心，置-80℃保存。

提取不同時間點細胞上清和細胞沉淀樣品核酸，進行熒光定量PCR檢測，每個樣品做3次重復，測得Ct值（Y值）后根據(jù)標準曲線計算吸附后不同時間點病毒核酸的拷貝數(shù)。

測定不同時間點細胞上清液和細胞沉淀樣品病毒滴度。根據(jù)Reed-Meunch法計算每個時間段細胞上清和細胞沉淀樣品的TCID50，繪制病毒一步生長曲線。將本結果與熒光定量PCR方法檢測病毒核酸拷貝數(shù)結果進行比較，分析DPV在CEF細胞中的增殖規(guī)律。

1.4.2 人工感染鴨器官組織DPV分布檢測

將10只30日齡的非免疫雛鴨，通過肌肉注射方式感染鴨瘟病毒標準強毒株，每只注射劑量為104MLD，感染后第7天，對所有雛鴨進行剖檢取材，采集腦、胸腺、肝臟、脾臟、十二指腸、泄殖腔組織臟器，分別提取DNA，利用建立的TaqMan熒光定量PCR方法，對鴨瘟強毒株在感染鴨組織中的分布情況進行檢測。

2 結 果

2.1 熒光定量PCR檢測方法的建立

2.1.1 菌液PCR鑒定

使用DPV-F/R和M13-F/R引物對篩選的單克隆進行菌液PCR鑒定，擴增目的片段大小分別為514和623 bp（見圖1），與預期片段大小一致。提取質粒進行測序，結果正確，表明成功構建重組質粒DPV-US6標準品。

2.1.2 TaqMan探針熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

經優(yōu)化，反應總體系20 μL：2×AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2 10 μL，上、下游引物各0.4 μL（0.2 μmol·L-1），TaqMan探針0.4 μL（0.2 μmol·L-1），模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。

2.1.3 標準曲線的建立

將濃度為3.97×1010 copies·μL-1重組質粒標準品進行10倍系列稀釋，每個濃度設3個重復進行熒光定量PCR，得到標準曲線回歸方程為y=-3.326x+41.196，R2=1，擴增效率E=99.391%（見圖2）。表明所建立的標準曲線具有較好的線性關系。

2.1.4 熒光定量PCR敏感性試驗

以10倍系列稀釋的標準品為模板分別進行TaqMan探針法、SYBR Green染料法熒光定量PCR 和常規(guī)PCR檢測。TaqMan探針法的最低檢測濃度為1×101copies·μL-1。SYBR Green染料法的最低檢測濃度為1×102copies·μL-1，常規(guī)PCR的最低檢測濃度為1×105copies·μL-1。結果表明，本試驗建立的TaqMan探針法熒光定量PCR靈敏度比SYBR Green染料法高10倍，比常規(guī)PCR高10 000倍，方法具有較好的敏感性。

2.1.5 熒光定量PCR特異性試驗

分別檢測鴨常見疾病病原核酸包括DPV、DTMUV、AIV、MDPV、DuCV、DRV、duck chlamydia、DHV-I和DHV-III，僅DPV有特異性的單一擴增曲線，其它病原檢測結果均為陰性，方法具有較好的特異性。

2.1.6 熒光定量PCR重復性試驗

對6個稀釋度的質粒標準品進行批內和批間重復性試驗。結果顯示，批內重復性試驗變異系數(shù)（CV）在0.077%～1.000%之間，批間重復性試驗變異系數(shù)在0.221%～1.451%之間，變異系數(shù)均小于2.0%，方法具有較好的重復性。

2.2 DPV增殖規(guī)律的研究

對不同時間點收集的細胞上清和細胞沉淀樣品進行熒光定量PCR檢測，同時進行TCID50測定，根據(jù)結果繪制曲線（見圖3和圖4）。結果顯示，檢測感染細胞內病毒時，病毒核酸拷貝數(shù)在4～60 h逐漸上升，60～84 h達到高峰，84～144 h逐漸下降。TCID50測定在4～3 6h逐漸上升，36 h達到高峰，36～144 h逐漸下降。檢測細胞上清樣本時，病毒核酸拷貝數(shù)與TCID50檢測繪制的病毒增殖曲線一致，均在4～60 h上升，60 h達到高峰，72～144 h下降，兩種檢測方法具有相關性，表明建立的熒光定量PCR方法能用于病毒增殖的檢測。

2.3 人工感染鴨器官組織DPV分布檢測

使用本試驗建立的熒光定量PCR方法對10只DPV攻毒鴨組織樣本分別進行檢測，結果顯示，肝臟中的病毒載量最高（見圖5），核酸拷貝數(shù)達108copies·μL-1，胸腺中的病毒載量次之，腦組織中的病毒載量最低。

3 討 論

我國是世界上最大的水禽養(yǎng)殖國家，鴨瘟的高發(fā)病率和死亡率給我國水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失，制約了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［2］。因此，建立快速、敏感、特異的鴨瘟病毒檢測方法對于預防和控制鴨瘟病毒大流行尤為重要。現(xiàn)有的DPV檢測方法包括病毒分離鑒定、血清中和試驗、常規(guī)PCR、熒光定量PCR等。病毒分離與血清中和試驗操作復雜、耗時長，不適用于臨床檢測；常規(guī)PCR靈敏度和特異性差，不能對病毒進行定量檢測；熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性強、快速、準確定量等特點，目前作為檢測鴨瘟病毒的常用方法［19］。已有學者根據(jù)DPV DNA聚合酶、UL6、UL7、UL48、UL30、UL31、TK、gE等基因建立了熒光定量PCR檢測方法［20-24］。

對24株DPV流行株TK基因的分析表明，TK基因存在3位點的變異［25］，病毒的變異需要建立新的檢測方法。本研究基于DPV US6基因的保守區(qū)域設計了探針，該探針的GC含量為54%，根據(jù)探針的序列設計了能與之特異性結合的引物，建立了基于DPV US6基因TaqMan熒光定量PCR檢測方法。特異性檢測結果表明該方法僅對DPV模板有陽性擴增信號，對鴨源常見病原如番鴨細小病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨呼腸孤病毒、H9N2亞型禽流感病毒、鴨甲型肝炎I型和III型、鴨衣原體均無交叉反應，特異性較好，最低可檢測到10 copies·μL-1核酸，與常規(guī)PCR相比，敏感性提高10 000倍。于新友［23］、馬騰飛［26］ 、張雨微［27］等多位研究人員報道建立的DPV SYBR Green熒光定量PCR檢測DPV的敏感度為18～50 copies·μL-1，比SYBR Green染料法熒光定量PCR檢測DPV具有更好的靈敏度，能更靈敏地檢測出低濃度病毒樣品。此外，重復性試驗結果顯示，該方法批間及批內重復的變化很小，變異系數(shù)均小于2.0%。綜上表明，所建立的鴨瘟病毒TaqMan熒光定量PCR檢測方法特異、敏感，且具有良好的穩(wěn)定性和重復性。

病毒增殖規(guī)律研究最常用的兩種手段通常是TCID50法測定病毒滴度和病毒蝕斑試驗，兩種方法存在主觀性、操作繁瑣、誤差大，很難準確得出病毒在細胞中的增殖規(guī)律［23］。熒光定量PCR方法可以對病毒在細胞中的增殖情況進行定量分析。因此，本試驗通過熒光定量PCR方法對DPV在CEF細胞中增殖規(guī)律進行研究，并與TCID50法進行相關性分析。結果表明，兩種方法的測定結果呈正相關，病毒收獲的最佳時間為感染后60 h。對于細胞上清樣品，在8～60 h，病毒核酸拷貝數(shù)和TCID50均上升，到達60 h峰值后開始出現(xiàn)下降趨勢；對于細胞沉淀樣品，熒光定量PCR方法的增殖峰值在60～84 h，TCID50的峰值在36 h，DPV感染細胞后沉淀中的病毒核酸拷貝數(shù)增殖峰值要晚于TCID50 24 h，可能是由于病毒在細胞內不斷復制，核酸片段持續(xù)積累，因此核酸拷貝數(shù)的增殖峰值要晚于TCID50。綜上所述，當檢測活病毒時，TCID50法可反映出具有感染力的活病毒顆粒數(shù)目，證明病毒感染力；熒光定量PCR法測定的是病毒核酸片段，能夠在未出現(xiàn)明顯細胞病變的細胞中精確檢測到DPV的病毒含量。本試驗從TCID50和病毒核酸拷貝數(shù)對DPV在CEF細胞中的增殖規(guī)律進行了初步研究，為DPV的致病機制、細胞與病毒之間的相互作用奠定基礎。

鴨瘟病毒廣泛分布于感染鴨體內的各組織臟器，肝臟、脾臟等病毒含量最高［19］，本試驗利用建立的熒光定量PCR方法檢測DPV人工感染鴨后腦、胸腺、肝臟、脾臟、十二指腸、泄殖腔組織臟器中病毒載量的分布情況，結果表明，肝臟中的病毒載量較高，說明肝臟為鴨瘟強毒株的主要靶器官，與齊雪峰等［28］、張新富等［29］的報道一致；胸腺中的病毒載量次之，劉菲等［30］報道免疫器官是DPV侵入鴨體內較早增殖分布的靶器官之一；脾臟、十二指腸和泄殖腔中也有不同程度的病毒分布。上述結果表明本方法可應用于DPV感染鴨組織臟器的定量檢測，有望成為臨床快速診斷鴨瘟的有效手段。

4 結 論

本研究建立的基于DPV US6基因TaqMan熒光定量PCR方法，特異性強、敏感性高和重復性好，為DPV檢測和診斷提供一種準確、快速的技術方法。

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（編輯 白永平）