育成期能量限飼及轉換為自由采食調控開產時蛋雞生殖器官發育的關鍵基因和信號通路研究

摘 要：

本試驗旨在基于轉錄組測序技術研究育成期（6～17周齡）能量限飼及轉換為自由采食（18～20周齡）調控開產時（20周齡）蛋雞生殖器官發育和激素水平的關鍵基因和信號通路。將720只6周齡海蘭褐蛋雞隨機分為3組，每組6個重復，每個重復40只雞。6～17周齡，試驗雞分別飼喂禽代謝能（ME）水平為12.34、11.11（90%）和9.87（80%）MJ·kg-1，其它營養素水平相同的試驗飼糧，12.34 MJ·kg-1組試驗雞自由采食（對照組），其它試驗組蛋雞按照對照組蛋雞采食量定量飼喂，18～20周齡，各組試驗雞均飼喂相同營養水平試驗飼糧自由采食。試驗期6～20周齡。20周齡末，選取生殖器官發育和血液孕酮水平差異顯著的對照組和80% ME攝入組試驗雞各4只，采集卵巢基質部進行RNA-seq分析，對差異表達基因進行GO功能富集分析和KEGG信號通路分析，并對測序結果進行qRT-PCR驗證。結果表明：1）隨育成期能量限飼強度增加，各試驗組蛋雞20周齡體重和體重變異系數（CV）均顯著線性減少（Plt;0.001），6～20周齡平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）均顯著線性增加（Plt;0.001），平均日代謝能攝入量（ADMEI）和平均日增重（ADG）顯著線性減少（Plt;0.001）。2）隨育成期能量限飼強度增加，20周齡蛋雞血清尿素氮（UN）含量顯著線性增加（P=0.007），血清甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）水平以及肝組織總膽固醇（TC）和游離脂肪酸（NEFA）含量均顯著線性減小（P=0.045，P=0.029，P=0.024，P=0.003）。3）隨育成期能量限飼強度增加，20周齡蛋雞輸卵管長度、長度體重比、重量和指數（P=0.012、0.016、0.042和0.045）、小黃卵泡的數量和指數（P=0.017和0.039）以及卵巢基質部重量和指數（P=0.046和0.047）均顯著線性減少，血漿孕酮水平顯著線性增加（Plt;0.001）。4）對20周齡自由采食組（ALF20W）和80%能量限飼組（ERF20W）蛋雞卵巢基質部進行RNA-Seq分析，純凈序列匹配到雞參考基因組的比例均超過了93.77%，Q20和Q30的純凈序列含量分別高于97.03%和92.14%，兩組共篩選出1 488個差異基因，ERF20W組600個下調，888個上調。GO功能分析發現細胞進程、發育和生殖等46個顯著富集的GO條目，KEGG信號通路顯著富集在28個顯著富集的KEGG通路，其中類固醇激素生物合成通路、雌激素信號通路、卵巢類固醇生成通路和cAMP信號通路等是與能量代謝或生殖相關的通路，篩選到的cAMP反應元件結合蛋白（CREB）、類固醇生成急性調節蛋白（StAR）、細胞色素P450 1B1（CYP1B1）、胰島素樣生長因子I（IGF-I）、黑皮質素2受體（MC2R）、細胞骨架蛋白角蛋白18（KRT 18）和孕激素受體（PGR）等差異基因富集在以上信號通路，可能是育成期能量限飼及轉換為自由采食調控開產時蛋雞生殖器官發育和雌激素生成的潛在靶基因和通路。qRT-PCR結果顯示10個差異表達基因的表達趨勢與 RNA-Seq結果一致。由此可見，育成期能量限飼及轉換為自由采食顯著影響了開產時（20周齡）蛋雞脂質代謝、生殖器官發育和孕酮生成，隨育成期能量限飼強度增加，開產時蛋雞體重、體重CV、血清TG和LDL水平、肝TC和NEFA含量、輸卵管長度、長度體重比、重量和指數、小黃卵泡的數量和指數以及卵巢基質部重量和指數均顯著線性減少，而血漿孕酮水平顯著線性增加。育成期能量限飼及轉換為自由采食可能通過影響卵巢組織StAR、CREB1、CYP1B1、IGF-I、MC2R、KRT18和PGR等基因的表達，作用于類固醇激素生物合成通路、雌激素信號通路、卵巢類固醇生成通路和cAMP信號通路等通路，以調控開產時蛋雞能量代謝、生殖器官發育和孕酮生成。

關鍵詞：

蛋雞；育成期能量限飼；生殖器官；RNA-seq；卵巢

中圖分類號：

S831.5"""" 文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0737-18

Studies on Key Genes and Signaling Pathways of Regulation of Energy Restriction during Rearing and Conversion to Ad libitum on the Reproductive Organ Development of Hens at the Initiation of Laying Period

LU" Jian1， MA" Meng1， GUO" Jun1， WANG" Xingguo1， DOU" Taocun1， HU" Yuping1， WANG" Qiang1， LI" Yongfeng1， SHAO" Dan1， TONG" Haibing1， GUO" Jie2*， QU" Liang1*

（1.Jiangsu Institute of Poultry Sciences， Yangzhou 225125，" China;

2.Animal Husbandry Station of China， Beijing 100125，" China）

Abstract：

The aim of this experiment was to investigate the key genes and signaling pathways of regulation of energy-restricted feeding during rearing and conversion to ad libitum on the reproductive organ development and hormone level of laying hens at the initiation of laying period using transcriptome sequencing technology. A total of 720 6-week-old Hyline-Brown chicks were allocated equally to three groups with six replicates of 40 chicks each， and were fed one of three diets that were nutritionally equal with the exception of ME levels. From 6 to 17 weeks of age， the chicks in control group were given diet with 12.34 MJ·kg-1 ME， and fed ad libitum. The levels of ME in diet of chicks in the experimental groups were 90% ［11.11 （12.34×90%） MJ·kg-1］ and 80% ［9.87 （12.34×80%） MJ·kg-1］ of that in control group， and the daily amount of feed was restricted to the absolute quantity of the diet consumed by chicks in control group. From 18 to 20 weeks of age， all laying pullets were fed a basal diet ad libitum. At 20 weeks of age，

four chicks in each of the ad libitum feeding group and 80% energy-restricted feeding group with significant differences （Plt;0.05） in reproductive organ development and plasma progesterone concentrations were selected to screen the novel mRNA implemented by the RNA-seq. The results showed as follows： 1） The body weight and body weight CV of chicks at 20 weeks of age decreased linearly with increasing energy restriction （Plt;0.001）， the ADFI and F/G （Plt;0.001） from 6 to 20 weeks of age increased linearly， while the ADMEI and ADG （Plt;0.001） decreased linearly with increasing the degree of energy restriction. 2） A gradual increase in the degree of energy restriction resulted in a gradual increase in the serum UN （P=0.007）， but a gradual decrease in serum TG and LDL （P=0.045， 0.029）， and in liver TC and NEFA （P=0.024， 0.003）. 3） With the increase of energy restriction during rearing period， the length， ratio of length to body weight， weight and index of oviduct （P= 0.012， 0.016， 0.042， 0.045）， the number and index of small yellow follicle （P=0.017， 0.039）， and the weight and index of ovarian stroma （P=0.046， 0.047） decreased linearly， while the plasma progesterone level （Plt;0.001） increased linearly. 4） The ovary stroma of chicks at 20 weeks of age in the ad libitum feeding group （ALF20W） and 80% energy-restricted feeding group （ERF20W） were used to screen the novel mRNA implemented by the RNA-seq. The proportion of pure reads matching to chicken reference genome was more than 93.77%， and the content of Q20 and Q30 was more than 97.03% and 92.14%， respectively. A total of 1 488 differential genes were screened in ALF20W and ERF20W， of which 600 were down-regulated and 888 were up-regulated in ERF20W. The GO functional enrichment analysis found that differentially expressed mRNAs were involved in biological processes such as biological regulation of cell proliferation， development， and reproduction. The KEGG pathway were significantly enriched in 28 pathways， among these pathways， the steroid hormone biosynthesis pathway， estrogen signaling pathway， ovarian steroidogenesis pathway， and cAMP signaling pathway were related to energy metabolism or reproduction. The differentially expressed genes including cAMP response element-binding protein （CREB）， steroid-producing acute regulatory protein （StAR）， cytochrome P450 1B1 （CYP1B1）， insulin-like growth factor-1 （IGF-I）， adrenocorticotropic hormone （MC2R）， cytoskeletal keratin （KRT18）， and progesterone receptor （PGR） were found to be enriched in the above signaling pathways， which maybe the potential target gene and pathway of energy restriction regulating reproductive organ development and estrogen production in laying chicks. The qRT-PCR results showed that the expression trends of 10 randomly selected differentially expressed genes were consistent with RNA-Seq results. The results showed that the body weight， body weight CV， serum TG and LDL， liver TC and NEFA， the length， ratio of length to body weight， weight and index of oviduct， the number and index of small yellow follicle， and the weight and index of ovarian stroma of chicks at 20 weeks of age decreased linearly with increasing the degree of energy restriction， while the plasma progesterone level increased linearly. It is suggested that energy restriction during the rearing period may regulate the expression of StAR， CREB1， CYP1B1， IGF-I， MC2R， KRT18 and PGR genes in ovarian tissues， and act on steroid hormone biosynthesis pathway， estrogen signaling pathway， ovarian steroidogenesis pathway， and cAMP signaling pathway， to regulate the energy metabolism， reproductive organ development and estrogen production of laying chicks at the initiation of laying period.

Key words：

hens; energy restriction during rearing period; reproductive organs; RNA-seq; ovary

*Corresponding authors：" QU Liang， E-mail： liangquyz@126.com; GUO Jie， E-mail： 23382063@qq.com

育成期和產前期是蛋雞骨架、肌肉、生殖器官和脂肪細胞等發育的主要階段［1］，開產時（性成熟）蛋雞的體重、群體均勻度和生殖器官等發育狀況直接影響整個飼養期的產蛋性能［2］，通過有效措施改善蛋雞育成期生殖器官發育狀況和群體均勻度等、達到良好的群體狀況至關重要［1］。育成期代謝能（ME）攝入量可以調節雞脂肪代謝及肌肉和生殖器官等發育狀態［3］，ME攝入量不足或過多可能會延遲生殖器官發育、推遲性成熟時間，對性成熟及后期產蛋性能也造成潛在影響［4］。因此，系統研究育成期ME攝入量對開產時蛋雞體重、體尺、生殖器官發育、脂質代謝和卵巢基因表達的影響，可以為蛋雞達到最佳生長發育狀態和最優產蛋性能提供ME需要的數據支撐，為集成蛋雞育成期精準飼喂技術提供理論依據，具有重要的實踐意義。有研究表明，自由采食狀況下育成期飼糧ME水平可以顯著影響育成期末蛋雞體重、卵巢基質和小黃卵泡等發育，但對開產時蛋雞生殖器官發育狀況無顯著影響［5］。自由采食情況下肉種雞能量攝入過高會增加開產時體重、卵泡數和卵泡重，其F2卵泡快速發育，與F1卵泡接近，易發生多卵同排的異常排卵等現象［6］。限飼情況下高ME攝入組母雞26周齡全部開產，而低ME攝入組母雞僅30%左右開產，高ME攝入組母雞促性腺激素釋放激素（GnRH）是低ME攝入組的2.3倍，GnRH-RI 是低能攝入組的1.8倍［3］。限飼情況下肉種雞推遲了開產、縮短了產蛋周期，但改善了群體均勻度、增加了總產蛋數、提高了產蛋性能和孵化性能［7］。本團隊前期研究發現，育成期適度限制能量攝入量（85.97%，10.25 vs. 11.92 MJ·kg-1），能夠延遲如皋黃雞18、20、22和24周齡的生殖器官發育和性成熟，限飼組蛋雞個體開產日齡、5%產蛋率日齡和50%產蛋率日齡分別延遲了4.2、8.9和5.5 d，但限飼改善了性成熟過程中群體均勻度，增加了18～52周齡平均蛋重和蛋重超過40 g的蛋數［8］。以上研究表明，育成期適宜的營養素攝入量延遲了家禽生殖器官發育和性成熟，縮短了產蛋周期，卻在一定程度上改善產蛋性能。然而，產生這一結果的原因并不清楚，生殖器官發育的延遲是否增加了組織器官的發育時間使發育更加成熟進而改善了后期產蛋性能？育成期ME攝入量影響家禽生殖器官發育和性成熟的分子機制研究報道較少，尤其在蛋雞上的研究未見報道。因此，本試驗以海蘭褐蛋雞為研究對象，育成期（6～17周齡）通過等量飼喂不同ME水平飼糧控制蛋雞的ME攝入量，17周齡后（18～20周齡）轉換成相同營養水平試驗飼糧自由采食，研究其對20周齡蛋雞體重、體尺、血液生化指標、激素水平和生殖器官發育的影響，并基于轉錄組測序技術研究育成期能量限飼及轉換為自由采食調控開產時（20周齡）蛋雞生殖器官發育的關鍵基因和信號通路。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2021年8月至2022年2月，在江蘇省家禽科學研究所邵伯試驗基地開展，試驗雞來自河北華裕農業科技有限公司，從1日齡飼養至6周齡后開始試驗。

試驗選用體況良好、體重接近的6周齡海蘭褐母雞720只。隨機分為3組，每組6個重復，每個重復40只，各試驗組蛋雞6周齡體重（375.9、381.3和377.5 g）和6周齡體重變異系數（coefficient of variation，CV；10.77、12.38和11.20）均無顯著差異（Pgt;0.05）。

6～17周齡，對照組、90%能量限飼組和80%能量限飼組分別飼喂禽代謝能（ME）水平為12.34、11.11（12.34×90%）和9.87（12.34×80%）MJ·kg-1、其它營養素水平相同的飼糧，對照組試驗雞自由采食，試驗組蛋雞按照對照組蛋雞采食量定量飼喂。18～20周齡，各組試驗雞均飼喂相同的試驗飼糧，自由采食。試驗雞每天飼喂2次（7：00、18：00），試驗期6～20周齡。

1.2 試驗飼糧與飼養管理

參照《海蘭褐飼養管理手冊》（HY-LINE INTERNATIONAL，2018版）推薦的不同生長階段蛋雞營養需要配制試驗飼糧，飼糧組成及營養水平見表1。飼糧中粗蛋白質、氨基酸、鈣和磷含量分別按照GB/T 6432—2018、GB/T 18246—2019、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018等方法測定。試驗雞采用《海蘭褐飼養管理手冊》推薦的密閉式雞舍光照程序等飼養管理措施，三層個體階梯籠飼養，自由飲水，各重復間在料槽上插入擋板，防止試驗雞采食其它重復蛋雞試驗飼糧。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長性能測定

每天記錄雞只健康狀況。試驗雞20周齡末，禁食12 h后逐只稱重。以重復為單位統計試驗雞體重，并計算各重復體重CV作為群體均勻度評價指標。

CV=（標準差/平均體重）×100%。

試驗期每周齡末定時結料、稱重，統計各重復的耗料量。根據飼養試驗記錄，以重復為單位整理統計試驗雞各階段的平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）、料重比（F/G）、平均日代謝能攝入量（ADMEI）和代謝能轉化比（MECR，MECR=ADMEI/ADG）［5］。

1.3.2 體尺測定

20周齡末，測定所有試驗雞個體體斜長、跖長和跖圍，體斜長、跖長和跖圍分別由專人測定，測定方法參考《家禽生產性能名詞術語和度量計算方法》（中華人民共和國農業行業標準NY/T 823—2020）。體斜長為肩關節至同側坐骨結節間的距離，用皮尺沿體表測定；跖長為跖骨上關節至第三四趾間的直線距離，用電子數顯卡尺測定；跖圍為跖中部的周長，先用棉線繞跖骨中部1周，然后用直尺測定棉線長度。

1.3.3 血液生化指標和激素水平測定

20周齡末，隨機從每重復選取2只雞翅靜脈采血，血樣分別置于促凝管和EDTA抗凝管，離心后收集上清保存待測。采用全自動生化分析儀（Uni-Cel DxC 800 Sychron，Beckman Coulter，美國）測定血清葡萄糖（GLU）、尿素氮（UN）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（NEFA）含量、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL），采用酶聯免疫檢測試劑盒（ELISA）檢測血漿中雌二醇和孕酮的含量，試劑盒購于南京奧青生物技術有限公司。

1.3.4 肝脂肪代謝相關生化指標測定

20周齡末，試驗雞采血后頸部放血致死。分離肝組織，滅菌生理鹽水沖洗，統一位置取樣，置于液氮中，后轉移至-70 ℃超低溫冰箱保存待測，采用試劑盒測定肝臟TC、TG、NEFA、HDL和LDL含量，試劑盒購自南京奧青生物技術有限公司。

1.3.5 生殖器官發育測定

20周齡末，試驗雞屠宰后分離生殖器官，測量輸卵管長度，并計算其與體重的比值；統計排卵前卵泡（直徑gt;8 mm）、小黃卵泡（直徑4～8 mm）和大白卵泡（直徑2～4 mm）數量；稱量輸卵管、卵巢基質、排卵前卵泡、小黃卵泡和大白卵泡等組織重量并計算各器官與體重的比值。

1.3.6 卵巢轉錄組測序

分離卵巢基質部后，各試驗組分別取4個樣品置于液氮中，后轉移至-70 ℃超低溫冰箱保存。根據生殖器官發育相關指標，選取生殖器官發育差異最顯著的對照組（12.34 MJ·kg-1組，ALF20W）和80%能量限飼組（9.87 MJ·kg-1，ERF20W）蛋雞卵巢基質部樣品進行轉錄組分析和qRT-PCR檢測。

采用TRIzol法提取卵巢基質部組織RNA，用Nanodrop-2000微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，檢測合格后，合成雙鏈cDNA，進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產物，最終獲得文庫，Illumina HiSeqTM 4000平臺上機測序。

1.3.7 測序數據分析

使用fastp對原始數據進行質控，過濾低質量數據后得到純凈序列。使用bowtie 2程序將高質量的純凈序列與雞核糖體序列比對，評估核糖體RNA的去除效果。使用Tophat 2程序將去除核糖體RNA后的純凈序列與雞參考基因組（版本：Ensembl_release100）比對，根據比對結果進一步評估測序數據質量，將比對上的序列進行后續分析。采用FPKM作為衡量基因表達水平的指標。使用edgeR軟件對mRNA的表達量進行差異分析，利用P值與差異倍數（fold change）來篩選差異表達基因，篩選條件為Plt;0.05且FCgt;2.0。

使用OmicShare軟件對靶基因進行注釋和分類。采用超幾何分布對差異表達 mRNA的靶基因進行基因本體論（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析。顯著條件為Plt;0.05。

1.3.8 測序結果qRT-PCR驗證

每組從差異表達基因中隨機選擇10個參與能量代謝或雌激素生成的基因進行qRT-PCR驗證。根據GenBank的基因序列，利用primer premier 5軟件設計引物，各引物序列見表2。以卵巢基質部總RNA為模板，使用反轉錄試劑盒將提取出的RNA反轉錄為cDNA。熒光定量PCR采用SYBR Green Ι法，參照ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Q411-02）試劑盒說明書進行。以GAPDH基因作為內參基因進行數據的標準化處理。每次反應均設空白樣品為陰性對照，每個樣品設置3個重復。定量的結果采用2－ΔΔCt法進行處理，分析自由采食組、能量限飼組卵巢基質mRNAs相對表達量。將80%能量限飼組的表達分析設為參照組，ΔΔCt=ΔCt（處理組）-ΔCt（參照組）。

1.4 統計分析

表型數據采用SPSS 15.0軟件中的單因子方差分析（one-way ANOVA）檢測組間差異顯著性。以重復為試驗數據單元。差異顯著時，用Duncan氏法進行多重比較。育成期ME攝入量的劑量效應用正交多項式中的線性和二次多項式進行比較。Plt;0.05表示差異顯著。

采用edgeR軟件對mRNA的表達量進行差異分析，利用P值與FC來篩選差異表達基因，Plt;0.05且FCgt;2.0表示差異顯著。采用超幾何分布對差異表達 mRNA的靶基因進行GO功能和KEGG信號通路富集分析，Plt;0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 育成期能量限飼及轉換為自由采食對6～20周齡蛋雞生長性能的影響

由表3可知，隨著育成期能量限飼強度增加，各試驗組蛋雞20周齡體重和體重CV均顯著線性減少（Plt;0.001，P=0.010），20周齡跖長呈先增加后減小的二次曲線趨勢（P=0.008）。

由表4可知，隨著育成期能量限飼強度增加，各試驗組蛋雞6～20周齡ADFI和F/G均顯著線性增加（Plt;0.001），ADMEI和ADG均顯著線性減少（Plt;0.001），但各試驗組MECR相比較均無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.2 育成期能量限飼及轉換為自由采食對20周齡蛋雞血液和肝生化指標的影響

由表5可知，隨著育成期能量限飼強度增加，20周齡蛋雞血清UN含量顯著線性增加（P=0.007），血清TG和LDL水平均顯著線性減小（P=0.045，P=0.029）。育成期能量限飼及轉換為自由采食對20周齡試驗雞血清GLU、TC、NEFA和HDL水平均無顯著影響（Pgt;0.05）。

由表6可知，隨著育成期能量限飼強度增加，20周齡蛋雞肝TC和NEFA含量均顯著線性減?。≒=0.024，P=0.003）。各試驗組蛋雞肝TG、HDL和LDL含量相比較均無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.3 育成期能量限飼及轉換為自由采食對20周齡蛋雞生殖器官發育的影響

由表7可知，隨著育成期能量限飼強度增加， 20周齡蛋雞輸卵管長度、長度體重比、重量和指數（P=0.012、0.016、0.042和0.045）、小黃卵泡的數量和指數（P=0.017和0.039）以及卵巢基質部重量和指數（P=0.046和0.047）均顯著線性減少。育成期能量限飼及轉換為自由采食對其它生殖器官發育指標均無顯著影響（Pgt;0.05）。

由圖1可知，轉換為自由采食3周后，血漿孕酮水平隨著育成期能量限飼強度增加顯著線性增加（Plt;0.001），育成期能量限飼及轉換為自由采食對血漿雌二醇水平無顯著影響（Pgt;0.05）。

2.4 卵巢基質部轉錄組測序質量分析

由表8可知，對8個cDNA文庫測序共獲得了454 742 628條序列和453 051 448條高質量的純凈序列，純凈序列在原始序列中占比高于99.60%，說明低質量序列較少，測序效果較好，平均GC含量為48.57%，堿基分布符合理論分布比例；原始序列平均堿基數為8.53 Gb，純凈序列平均堿基數為8.45 Gb，即99.15％的原始序列達到質控標準。Q20和Q30的純凈序列含量分別高于97.03%和92.14%，表明測序數據結果可靠，可進一步分析。將純凈序列與雞核糖體序列比對，99.63%以上的純凈序列未比對到核糖體上，去除比對上的序列后可進行后續轉錄組分析。

2.5 參考基因組比對分析

將各樣品純凈序列去重后的唯一序列與雞參考基因組對比（表9），純凈序列匹配到雞參考基因組的比例均超過了93.77%，5.16%～6.23%的reads未匹配到基因組的任何位置，91.87%～93.02%的純凈序列匹配到唯一基因組位置，1.79%～1.96%的純凈序列匹配到多個基因組位點。

2.6 基因表達分析

由圖2可知，20周齡8個樣本共檢測出18 672個表達的基因，其中ALF20W組蛋雞卵巢基質部檢測到18 399個基因，ERF20W組檢測到18 430個基因，ALF20W組和ERF20W組同時檢測出18 157個基因，單獨檢到的基因數分別為242和273個。

2.7 差異表達基因篩選

由圖3可知，ALF20W與ERF20W共篩選出1 488個差異基因，其中ERF20W組600個上調，888個下調。對差異表達基因進行聚類分析，根據差異基因表達量計算樣品間的距離和樣品間的相關性，同一組的四個樣品聚在同一簇中。

2.8 差異表達基因功能分析

2.8.1 GO功能富集分析

對ALF20W組和ERF20W組差異表達基因進行GO功能分析，發現46個顯著富集的GO條目（Plt;0.05），主要富集在細胞進程（Cellular process）、生物調節（Biological regulation）、生物過程調節（Regulation of biological process）、代謝過程（Metabolic process）、多細胞生物過程（Multicellular organismal process）、發育過程（Development process）、細胞增殖（Cell proliferation）、生殖（Reproduction）和生殖過程（Reproductive process）等條目（圖4），其中與能量代謝或繁殖性能相關的基因有cAMP反應元件結合蛋白（CREB）、類固醇生成急性調節蛋白（StAR）、細胞色素P450 1B1（CYP1B1）、胰島素樣生長因子I（IGF-I）、黑皮質素2受體（MC2R）、細胞骨架蛋白角蛋白（KRT18）和孕激素受體（PGR）等7個候選基因。

2.8.2 KEGG信號通路富集分析

對ALF20W組和ERF20W組差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析（圖5），發現28個顯著富集的KEGG通路（Plt;0.05），富集最為顯著的前20個信號通路主要包括ECM受體相互作用（ECM-receptor interaction）、醚脂代謝（Ether lipid metabolism）、蛋白質的消化和吸收（Protein digestion and absorption）和雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）等。與能量代謝或繁殖性能相關的差異基因主要富集在類固醇激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、卵巢類固醇生成（Ovarian Steroidogenesis）和環磷酸腺苷信號通路（cAMP signaling pathway）等信號通路（表10），可能是育成期能量限飼及轉換為自由采食調控蛋雞生殖器官發育的潛在通路。

2.9 差異表達基因qRT-PCR驗證

為驗證測序結果的準確性，從ALF20W與ERF20W組測序結果中分別隨機選取10個差異表達的mRNAs（ACTA2、CFTR、COL3A1、CREB1、CYP1B1、ENTPD3、HSPG2、MC2R、NR4A3和StAR），進行qRT-PCR驗證。如圖6所示，qRT-PCR結果與測序結果高度一致，說明轉錄組分析獲得的差異表達基因是準確的。

3 討 論

3.1 育成期能量限飼及轉換為自由采食對6～20周齡蛋雞生長性能的影響

本試驗中，隨著育成期能量限飼強度增加，各試驗組蛋雞20周齡（轉換為自由采食3周后）體重和體重CV以及6～20周齡ADMEI和ADG均顯著線性減少，表明6～17周齡能量限飼組的能量攝入量不能滿足蛋雞生長需求，即便轉換成自由采食3周后，這種影響仍然存在，但育成期限飼對6～20周齡蛋雞的ME轉化效率沒有不良影響，且改善了群體均勻度。有關育成期能量限飼對蛋雞生長發育影響的研究報道相對較少，在肉雞上有研究表明，與自由采食組肉雞相比，限飼期結束時限飼組肉雞體重顯著下降，但這種差異在轉換為自由采食1周后消失［9］。Butzen等［10］研究發現，與自由采食組相比，8～16日齡限飼20%組肉雞16日齡體重顯著下降，但限飼對35日齡的肉雞體重無顯著影響。Urdaneta-Rincon和Leeson［11］研究發現，14至17、20、23、26或29日齡，限飼10%均顯著影響肉雞公雞35日齡體重，但對42和49日齡體重無顯著影響。Novel等［12］研究發現，與自由采食組相比，14～21日齡限飼50%組肉雞公、母雞42日齡體重均顯著下降，但14～21日齡限飼25% 對35日齡體重無顯著影響。Lu等［8］研究育成期能量限制飼喂及預產期轉換成自由采食對如皋黃雞后備母雞生長發育影響時也發現，8～18周齡能量限飼顯著影響18周齡蛋雞體重，但轉換成預產料自由采食3周后，體重與未限飼組蛋雞相比較差異不顯著。以上研究均說明限飼會影響限飼期末家禽的生長發育，這種影響可持續到轉換為自由采食數周后。本研究中，轉換成自由采食3周后，育成期能量限飼對蛋雞體重仍存在影響，但對體斜長無不良影響，且改善了群體均勻度，說明育成期限飼影響的周期可能與蛋雞品種和限飼強度（限飼量和限飼周期）密切相關，本試驗選用的試驗動物為海蘭褐蛋雞，ME攝入量分別為自由采食組的90%和80%，蛋雞品種和限飼強度與以上研究均不相同可能是影響本試驗結果的重要因素。

3.2 育成期能量限飼及轉換為自由采食對20周齡蛋雞血液和肝生化指標的影響

本試驗中，隨著育成期能量限飼強度增加，轉換為自由采食3周后（20周齡）蛋雞血清UN含量顯著線性增加，血清TG和LDL水平以及肝TC和NEFA含量均顯著線性減小，說明育成期能量限飼顯著影響了開產時（20周齡）蛋雞的脂質代謝。有關育成期能量限飼對蛋雞血液和肝生化指標的研究未見報道，但有研究表明，自由采食情況下，飼糧ME水平能夠影響蛋雞血清TG［13］、UN［14］、HDL和LDL［15］等，但研究結果并不一致，這可能與試驗雞品種、日齡、飼糧組成和ME設置梯度等不同有關。育成期限飼組蛋雞20周齡血液UN含量增加，表明降低限飼組蛋雞自由采食3周后機體蛋白質合成效率并不高，自由采食后限飼組蛋雞采食量顯著增加，粗蛋白質攝入量顯著增加，可能由于轉換為自由采食后粗蛋白質攝入量的增加對試驗雞蛋白質利用效率造成影響，限飼轉為自由采食后飼糧粗蛋白質水平可能超過了蛋雞生長需要，說明該階段飼糧最適宜粗蛋白質水平有待進一步研究。育成期限飼組蛋雞20周齡血液TG和LDL水平以及肝TC和NEFA含量減小，說明限飼組蛋雞可能改善了脂質代謝狀態，提升了膽固醇轉運水平，這可能與限飼組蛋雞6～20周齡ADMEI仍顯著小于自由采食組有關，攝入的能量物質通過代謝轉化為能量或其它物質滿足機體需要，限飼組蛋雞ME攝入量更少，血液和肝臟中脂質代謝部分相關指標顯著降低。

3.3 育成期能量限飼及轉換為自由采食對20周齡蛋雞生殖器官發育和激素水平的影響

本試驗中，隨著育成期能量限飼強度增加，20周齡（轉換為自由采食3周后）蛋雞輸卵管長度、長度體重比、重量和指數、小黃卵泡的數量和指數以及卵巢基質部重量和指數均顯著線性減少，說明育成期能量限飼顯著影響了開產時（20周齡）蛋雞生殖器官發育。育成期ME攝入量可用于調控生殖器官的發育速度和蛋雞性成熟的時間［4］。本團隊在前期研究地方特色蛋雞時發現，將8～18周齡ME攝入量降至86%顯著延遲了18、20、22和24周齡如皋黃雞的生殖器官發育，對26和28周齡生殖器官發育無顯著影響［16］。將6周齡至開產ME攝入量降至自由采食的2/3，可使春季飼養的白來航蛋雞性成熟延遲3周［17］。7～15周齡和7周齡至開產限飼均能延遲肉種雞（Hybro G）開產日齡［18］。本試驗發現，轉換成自由采食3周后（20周齡），育成期能量限飼組蛋雞的生殖器官發育仍受一定影響，說明育成期能量限飼對生殖器官發育的影響具有一定持續性，這種影響可能會隨自由采食時間的增加逐漸消失。理論上，育成期至開產，蛋雞體重首先開始快速增加，先達到體成熟，增重開始減慢，輸卵管和卵巢等生殖器官開始快速發育，逐漸達到性成熟［19］。20周齡時能量限飼組蛋雞的體重仍顯著小于自由采食組，可能還未達到體成熟，影響了生殖器官的發育。

同時，本研究表明，隨著育成期ME攝入量的減少，開產時（20周齡）蛋雞血液孕酮水平顯著線性增加，說明限飼組蛋雞可能通過生理調節分泌了更多的孕酮，以促進生殖器官發育，且限飼組蛋雞孕酮水平的顯著增加發生在體重仍顯著小于對照組的時間點（20周齡）。為了初步探明育成期能量限飼調控開產時蛋雞生殖器官發育和雌激素生成機制，本試驗進一步研究了20周齡生殖器官發育和雌激素水平差異最顯著組蛋雞卵巢基質部的差異表達基因和信號通路。

3.4 育成期能量限飼及轉換為自由采食對20周齡蛋雞卵巢基因表達的影響

對能量限飼轉換為自由采食3周后（20周齡）卵巢基質部組織進行轉錄組分析，GO功能分析發現細胞進程、生物調節、生物過程調節、代謝過程、發育和生殖等46個顯著富集的GO條目，KEGG信號通路富集在28個顯著富集的KEGG通路，其中類固醇激素生物合成通路、雌激素信號通路、卵巢類固醇生成通路和cAMP信號通路等是與能量代謝或生殖相關的通路，篩選到StAR、CREB1、CYP1B1、IGF-I、MC2R、KRT18、PGR等差異基因富集在以上信號通路，可能是育成期能量限飼及轉換為自由采食調控開產時蛋雞生殖器官發育和雌激素生成的潛在靶基因和通路。

雞性成熟是由多種激素因子、基因和通路共同調控的復雜過程。性成熟過程中，蛋雞對雌激素的敏感度比較高，雌激素可促進肝脂質合成，為卵泡中卵黃合成提供基礎，最終促進卵泡生長［20］。卵巢類固醇激素包括雄激素、雌激素、孕激素等［21］，是一類四環脂肪烴化合物，主要由膜細胞和顆粒細胞分泌而來，對生殖器官發育和性成熟具有重要的調控作用［22］。膽固醇是卵巢類固醇激素生成的主要前體物質，膽固醇通過類固醇生成急性調節蛋白（StAR）轉運至線粒體內膜后，被膽固醇側鏈裂解酶（CYP11A）裂解生成孕烯醇酮（P5），P5 經類固醇17α羥化酶（CYP17A）催化形成脫氫表雄甾酮（DHEA），DHEA經 3β 羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）催化形成雄烯二酮?；蛘逷5經3β-HSD 催化形成孕酮，再經CYP17A催化形成雄烯二酮，雄烯二酮經過 17β羥基類固醇脫氫酶催化形成睪酮，最后被催化形成雌激素［23-24］。在卵泡發育過程中，卵母細胞的發育和減數分裂等過程都需要大量的能量［25］。cAMP信號通路是能量代謝的重要通路，通過磷酸化途徑產生能量，調控生殖激素的合成以及與膜細胞和顆粒細胞增殖分化相關基因的轉錄，進而調節卵泡發育［26-27］。綜上可見，本研究中差異表達基因富集的類固醇激素生物合成通路、雌激素信號通路、卵巢類固醇生成通路和cAMP信號通路等是連通能量代謝、生殖激素生成、細胞增殖和卵泡發育的重要通路。

本試驗篩選的差異表達基因StAR、CREB1、CYP1B1、IGF-I、MC2R等主要富集在類固醇激素生物合成、卵巢類固醇生成和cAMP信號通路等，KRT18、PGR等富集在雌激素信號通路。CREB家族包括CREB1、CREM和ATF1等，在哺乳動物中，CREB是細胞能量平衡的關鍵感受器［28］，研究表明，CREB和CREB轉錄激活因子（CRTC2）能夠在轉錄水平上整合由能量和激素調節的細胞信號通路［29］，且在糖異生和內質網應激過程中發揮重要作用［30］，低能引起細胞內cAMP濃度升高，促進核內CRTC2表達和活化并與CREB結合，激活下游基因轉錄［31］。StAR是一類可以通過激素進行誘導的線粒體蛋白，主要存在類固醇激素合成的過程中［32］。類固醇激素合成細胞中的促性腺激素通過激活G蛋白和腺苷酸環化酶，提高細胞內cAMP水平，活化蛋白激酶A（PKA），活化的PKA進入細胞核磷酸化CREB等轉錄蛋白［33］，磷酸化的CREB結合到StAR上的CREB結合區，作為轉錄因子激活StAR，刺激StAR基因表達，StAR蛋白能夠將線粒體外膜的膽固醇遞送到內膜，由CYP11A將不溶性膽固醇裂解為可溶性的P5，進而生成類固醇激素［34-35］。CYP1B1參與動物繁殖，其mRNA表達顯示出明顯的季節性變化，在產卵期的豐度最高，在體內和體外的最終卵母細胞成熟以及人絨毛膜促性腺激素和兒茶激素誘導的排卵期間發揮重要作用［36］。IGF-1在家禽卵泡發育過程中起著重要作用，IGF-1通過影響卵泡刺激素的受體表達，進而影響卵泡選擇前未分化的小黃卵泡的維持狀態［37］。黑皮質素家族參與能量平衡的中樞和外周調節，在脂肪細胞中，MC2R與黑皮質素受體輔助蛋白2共同介導對促腎上腺皮質激素反應、傳遞 ACTH 依賴性信號［38］，在脂肪細胞分化過程中其表達顯著上升［39］。細胞骨架蛋白角蛋白KRT18可參與免疫細胞調節卵巢中卵泡的選擇、成熟及排卵［40］，也可作為卵丘-卵母細胞復合體生長和發育以及顆粒細胞和卵丘細胞增殖的重要分子標記［41］。孕激素受體PGR在性激素的生物合成通路中具有重要的作用，在能量限制情況下低表達［42］，發情期高表達，且與孕酮水平密切相關［43］。因此，本研究篩選的StAR、CREB1、CYP1B1、IGF-I、MC2R、KRT18、PGR等差異基因可能是育成期能量限飼及轉換為自由采食調控蛋雞生殖器官發育和雌激素生成的關鍵候選基因。本研究結果表明，育成期能量限飼及轉換為自由采食調控生殖器官發育可能是多基因、多通路的協同調控過程。

4 結 論

4.1 育成期（6～17周齡）80%能量限飼及轉換為自由采食（18～20周齡）顯著影響了開產時（20周齡）蛋雞體重和生殖器官發育等指標，但改善了群體均勻度和脂質代謝，增加了血漿孕酮水平。

4.2 育成期能量限飼及轉換為自由采食可能通過影響卵巢組織StAR、CREB1、CYP1B1、IGF-I、MC2R、KRT18和PGR等基因的表達，作用于類固醇激素生物合成通路、雌激素信號通路、卵巢類固醇生成通路和cAMP信號通路等通路，調控開產時蛋雞能量代謝、生殖器官發育和孕酮生成等。

4.3 建議6～17周齡蛋雞采用80%能量限飼（9.87 MJ·kg-1）飼喂方式，17周齡后自由采食。

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（編輯 范子娟）

收稿日期：2024-04-01

基金項目：江蘇省種業振興揭榜掛帥項目（JBGS［2021］104）；現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-40-K01）

作者簡介：盧 建（1985-），男，研究員，博士，主要從事蛋雞營養代謝與繁殖性能調控研究，E-mail：lujian1617@163.com

*通信作者：曲 亮，主要從事蛋雞遺傳育種研究，E-mail： liangquyz@126.com；郭 杰，主要從事畜禽養殖經濟與產業發展研究，E-mail： 23382063@qq.com