基于全基因組重測序分析道州灰鵝保種效果

摘 要：

旨在研究道州灰鵝保種場鵝群的遺傳結構、遺傳多樣性和親緣關系，為后續道州灰鵝的保種工作提供參考。道州灰鵝保種場采用單父本家系輪配的保種模式進行保種，共49個家系，每個家系中取一只200日齡左右的健康公鵝，采靜脈血進行DNA抽提，對DNA樣品進行全基因組重測序，根據每個家系公鵝的重測序數據，利用生物信息學軟件對群體遺傳結構和遺傳多樣性進行分析與評價。結果，共檢測到道州灰鵝保種群體的SNPs位點15 245 050個，在過濾質控后得到SNPs位點14 628 485個。群體遺傳多樣性分析結果顯示，群體的平均觀測雜合度（Ho）為0.280，平均期望雜合度（He）為0.288，群體近親系數（Fis）為0.070，平均多態信息含量（PIC）為0.262，基因多樣性指數（Nei）為0.331。道州灰鵝保種群體共檢測到802個連續純合片段（ROH），基于ROH值計算得出的近交系數為0.010，近交程度較低。IBS距離矩陣、G矩陣的結果相似，只有少部分的個體間親緣關系較近。群體滲透分析與主成分分析結果同樣顯示，大部分個體聚類為一個亞群，少部分個體聚類為2個小亞群。通過群體分化指數（Fst）的計算結果，2個小的亞群之間出現了中等程度的分化?？傮w而言，道州灰鵝保種群體的遺傳多樣性較為豐富，近交水平較低，保種效果優良，建議減少親緣關系過于接近的家系間的配種，以保持遺傳多樣性和群體的長期健康。

關鍵詞：

重測序；道州灰鵝；遺傳結構

中圖分類號：

S835.2"""" 文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0633-10

收稿日期：2024-07-26

基金項目：湖南省家禽產業技術體系（湘農函［2023］67號）；國家重點研發計劃項目（2021YFD120030102）

作者簡介：萬偉粲（1997-），男，湖南溆浦人，實習研究員，碩士，主要從事水禽遺傳育種的研究，E-mail：478501743@qq.com

*通信作者：李 闖，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：349969903@qq.com；蔣桂韜，主要從事家禽營養與生產，E-mail：jiangguitao@163.com

Evaluation of Daozhou Gray Goose Conservation Based on Whole Genome Resequencing Analysis

WAN" Weican1， HE" Xu1， LIU" Yang1， MA" Yuyong2， JIANG" Yuzhang3， DAI" Qiuzhong1， YAN" Haifeng1， JIANG" Guitao1*， LI" Chuang1*

（1.Hunan Institute of Animal and Veterinary， Changsha 410131， China;

2.Hengyang Academy of Agricultural Sciences， Hengyang 421101， China;

3.Daozhou Animal Husbandry and Fishery Technology Service Center， Yongzhou 425300， China）

Abstract：

This study aimed to investigate the genetic structure， diversity， and kinship of geese at the Daozhou gray goose conservation farm to guide future conservation efforts.The Daozhou gray goose conservation farm used a single-sire family rotation model， involving 49 families. A healthy 200-day-old male goose from each family was selected for DNA extraction via venous blood sampling. The DNA samples were subjected to whole-genome resequencing， and the resulting data were analyzed using bioinformatics software to assess the genetic structure and diversity of the population.A total of 15 245 050 SNPs were detected in the Daozhou gray goose conservation population， reducing to 14 628 485 after quality control. Genetic diversity analysis revealed an average observed heterozygosity （Ho） of 0.280， expected heterozygosity （He） of 0.288， inbreeding coefficient （Fis） of 0.070， average polymorphism information content （PIC） of 0.262， and gene diversity index （Nei） of 0.331. A total of 802 runs of homozygosity （ROH） were identified， with an inbreeding coefficient of 0.010， indicating low inbreeding levels. IBS distance matrix and G-matrix results showed that only a few individuals had close kinship. Population admixture and principal component analysis indicated that most individuals clustered into one subpopulation， while a few formed two small subpopulations. Fst calculation result showed moderate differentiation between the two smaller subpopulations.In summary， the conserved population of Daozhou gray goose exhibits relatively rich genetic diversity and a low level of inbreeding， reflecting good conservation outcomes. It is recommended to decrease breeding between family lines with excessively close kinship relationships in order to maintain genetic diversity and ensure the long-term health of the population.

Key words：

resequencing; Daozhou gray goose; genetic structure

*Corresponding authors： LI Chuang， E-mail：349969903@qq.com; JIANG Guitao， E-mail：jiangguitao@163.com

道州灰鵝在2010年被列入《國家畜禽遺傳資源目錄》，與酃縣白鵝、武岡銅鵝和溆浦鵝共同構成了湖南省四大優良地方鵝種資源。道州灰鵝體型優美、肉質滑嫩、骨脆皮白、且含有獨特的蛋白酶，營養價值與食用價值高，因此廣銷兩廣地區與東南亞市場，深受國內外消費者青睞［1］。道州灰鵝原產地位于湖南道縣，在周邊地區均有飼養，生產性能優秀，產肉與填肥產肝性能優良，但道州灰鵝處于瀕危狀態，保種形勢嚴峻。在國家畜禽遺傳資源委員會辦公室公布的《國家畜禽遺傳資源品種名錄（2021年版）》收錄的30個地方鵝品種中，道州灰鵝的年末存欄量為0.04萬只，年飼養量為0.9萬只，綜合排名第25位，按照我國鵝遺傳資源瀕危等級評定的結果，道州灰鵝屬于瀕危狀態［2］。

近年來，地方品種的保護與管理越來越受到重視。國家通過建設地方品種保護場、保護區、水禽基因庫，有效保護了我國地方品種畜禽遺傳資源［3-5］。畜禽保種工作十分重要的一個環節就是通過遺傳多樣性和近交系數評估保種效果，而模糊的親緣關系、錯誤的系譜記錄、混亂的家系結構會造成保種群體發生一定程度的近交，使得群體的遺傳多樣性降低，進而影響品種的提純復壯與繁殖更新［6］。由于禽類腳標翅標容易脫落的特性，鵝群一般難以記錄詳細的系譜，根據傳統系譜方法估計群體內個體間的親緣關系和近交系數的結果不夠準確［7］。隨著測序技術的發展，多種測序技術被應用于畜禽育種保種的工作中，其中，全基因組重測序（whole genome sequencing，WGS）是近年來應用較為廣泛的技術［8］。WGS是一種強大的基因組分析手段，通過對采樣群體進行全基因組重測序，將獲得的序列信息比對至參考基因組，從而識別出大量的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點。SNPs作為一種數量豐富、分布廣泛、遺傳穩定以及廣泛存在于基因組中的遺傳變異標記，被廣泛應用于種質資源評估、遺傳多樣性分析和系統發育進化等研究［9-11］。李德娟等［12］利用全基因組SNPs標記信息分析了太行雞保種群體的保種現狀，結果發現兩個群體遺傳相似系數較低，遺傳距離較大，兩個保種群遺傳結構存在顯著差異。田帥帥等［13］利用全基因組重測序數據對文昌雞的3個保種群進行遺傳結構分析，結果發現，文昌雞保種群體整體遺傳多樣性較高，其中有一個保種群的群體內遺傳距離相對較遠，3個保種場的群體之間存在一定的遺傳分化。張巖等［14］利用全基因組重測序對郟縣紅牛保種群體進行遺傳結構與遺傳多樣性進行分析，結果顯示，郟縣紅牛的保種群遺傳多樣性豐富，群體結構沒有出現明顯分層，但是出現了一定的近交風險。

本研究采用全基因組重測序技術對道州灰鵝保種場49個家系中的公鵝進行測序，將得到的重測序數據比對到參考基因組獲得SNPs位點，分析道州灰鵝保種群的遺傳多樣性、群體結構、近交程度、親緣關系，以評估道州灰鵝保種場的保種效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究從湖南省道縣的道州灰鵝保種場選取了49個獨立家系的200日齡左右的健康公鵝各1只，依次編號為DZ-01～DZ-49。每只鵝抽取約4 mL翅靜脈血液，置于含有EDTA抗凝劑的采血管中，搖晃均勻后立即低溫運輸至實驗室，儲存在―20℃的冰箱中以待后續的DNA提取工作。

1.2 DNA提取與建庫

采用CTAB法提取血樣基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和降解程度，并用Nanodrop核酸濃度測定儀測量DNA的濃度和純度。處理后的DNA樣本在－20℃條件下儲存以備后續測序。

建庫測序委托了武漢百易匯能生物科技有限公司完成。對于DNA文庫的制備，使用Covaris LE220-PLUS設備對gDNA進行超聲剪切，選擇適宜的片段篩選策略，運用VAHTS DNA Clean Beads產品獲取300～350個堿基對的目標片段。然后使用VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V3試劑盒進行WGS建庫，對DNA片段進行末端修復、5′端磷酸化和3′端的dA尾部添加，連接測序接頭并純化。PCR擴增與純化連接測序接頭的DNA樣品，采用酶標儀/Qubit熒光定量技術對文庫進行定量，變性、環化和消化雙鏈靶區域文庫得到單鏈環狀DNA，通過滾環擴增技術得到DNA納米球（DNB）。最后，使用Qubit對DNB進行定量和質量控制，并將其加載到微陣列芯片上。利用cPAS進行測序。測序完成后，通過高分辨率成像系統捕捉到的光信號被轉化為數字信息，經過讀取與識別，從而獲得原始的測序數據。

1.3 數據處理

1.3.1 數據質控

使用fastq軟件過濾原始序列文件（raw data），具體包括：去除一端低質量的reads；過濾掉Q值≤15的堿基占比超過40%的reads；剔除含超過5個N的reads；移除長度小于15 bp的reads；切除接頭序列。得到的clean data經FastQC質控合格后用于后續分析［15］。使用bwa mem軟件將clean data比對到鵝參考基因組（參考基因組網址：https：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/vertebrate_other/ Anser_cygnoides/latest_assembly_versions/GCF_002166845.1_GooseV1.0/），然后用GATK MarkDuplicates 過濾重復的reads；使用GATK HaplotypeCaller檢測SNP［16］，并使用默認參數過濾SNP，最后使用ANNOVAR對最終得到的變異位點進行注釋［17］。

1.3.2 群體遺傳多樣性分析

采用stacks程序包中的populations命令進行群體遺傳多樣性分析。分析的多樣性指數包括：觀測雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、近親系數（inbreeding coefficient，Fis）、多態信息含量（polymorphism information content，PIC）、基因多樣性指數（gene diversity index，Nei）。

1.3.3 ROH分析

在基因組水平上，連續性純合片段（runs of homozygosity，ROH）是指染色體的某一段區域內存在的連續純合狀態現象。ROHs的累積長度可以用來估計個體的近交系數。采用Plink v1.9軟件計算ROHs長度［18］，通過計算ROHs長度總和占整個基因組長度的比例來代表近交系數（FROH），ROH片段總長度越長，個體的近交系數就越高。

1.3.4 親緣關系分析

采用Plink v1.9軟件構建道州灰鵝保種群體的狀態同源（identical by state，IBS）距離矩陣，計算保種群體中個體間的遺傳距離，構建G矩陣分析個體間的親緣關系，用R軟件中的pheatmap包對IBS矩陣和G矩陣進行可視化，繪制熱圖。

1.3.5 群體滲透分析與主成分分析

采用Plink v1.9軟件進行群體結構分析。首先創建Plink的輸入文件——ped文件，然后利用admixture軟件［19］構建群體滲透分析。針對研究群體，預先設定亞群數目（K值）為1～10進行聚類，并對聚類結果進行交叉驗證，根據交叉驗證誤差（CV error）的最小值確定最優分群數。群體結構聚類圖中不同顏色代表該樣本來自不同的子群落，如果一個樣本有不止一種顏色，表明該樣本評估同時跨越了這幾個子群落。利用EIGENSOFT軟件包中的smartpca軟件［20］進行主成分分析（principal component analysis，PCA），過濾高于2個等位基因位點以及錯配數據。

1.3.6 群體分化指數分析

群體分化指數（Fst）是群體遺傳學中用來量化不同群體間遺傳變異相對于總遺傳變異比例的一個統計量［21］。Fst代表一個種群內亞群間的遺傳分化程度，Fst值一般在0～1之間，Fst值越小，代表亞群間的遺傳分化越小，反之亦然，采用vcftools（參數：--fst-window-size 10000--fst-window-step 10000）對Fst指數進行分析。

2 結 果

2.1 道州灰鵝重測序數據質控與比對基因組

通過測序獲得49只道州灰鵝的全基因組重測序數據，原始下機后得到每只鵝的raw reads數量范圍為48 789 762～88 855 710個，質控篩選后得到的clean reads數量范圍為48 761 584～88 803 266個，Q30比率均值為96.32%，GC含量均值為42.74%，樣本建庫良好，達到標準。將質控后的clean data比對到鵝參考基因組，比對上的reads數量范圍為48 323 021～88 009 031個，比對率均高于99%，測序深度在5.89×～10.67×之間，數據能夠進行后續進一步分析與研究。

2.2 道州灰鵝SNPs位點分布

檢測到采樣群體合格的SNPs位點15 245 050個，經數據質控和過濾篩選出SNPs位點14 628 485個。以0.5 Mb為窗口統計SNPs的數目，最長的20條重疊群（contig）上SNPs的分布情況見圖1A。對SNPs進行注釋統計，結果如圖1B所示，內含子區域占比49.06%，基因間區占比42.83%，外顯子區域占比1.75%，其他區域占比6.36%。

2.3 道州灰鵝群體多樣性分析

對道州灰鵝采樣群體進行遺傳多樣性的分析，結果如表1所示，群體的觀測雜合度（Ho）均值為0.280，期望雜合度（He）均值為0.288，觀測雜合度與期望雜合度相差不大。群體近親系數（Fis）為0.070。多態信息含量（PIC）均值為0.262，在0～0.25的為42.17%，0.25～0.5之間的為57.83%，大部分位于中度多態性位點。基因多樣性指數（Nei）均值為0.331。

2.4 道州灰鵝ROH統計與分析結果

在保種群體的49只道州灰鵝中共檢測到802個ROHs片段，ROHs總長度為533.54 Mb，平均每只鵝有16.36個ROHs片段，個體平均ROHs總長度為10.88 Mb，單個ROH片段平均長度為646.84 kb，如圖2A所示，ROHs長度在1 Mb以內的最多，有749個，1～2 Mb的有51個，2～3 Mb的有2個，其中長度最長的片段為2086.79 kb，大片段較少。基于ROH的近交系數FROH計算結果如圖2B所示，個體近交系數的平均值為0.010，其中最大值僅為0.020，個體近交系數均較小。

2.5 道州灰鵝群體親緣關系分析

對采樣群體進行親緣關系分析，利用Plink v1.9軟件計算保種場采樣道州灰鵝個體間的遺傳距離，構建IBS遺傳距離矩陣，結果顯示，個體間遺傳距離范圍在0.1612～0.3122之間，平均值為0.2833，IBS遺傳距離矩陣的可視化結果如圖3所示，大部分個體之間的遺傳距離較遠（圖 3中紅色方格），少部分個體間的遺傳距離較近（圖3中黃色方格），說明這部分個體間可能存在近交風險。

利用GCTA軟件基于全基因組SNPs位點構建基因組關系G矩陣，并用R軟件的pheatmap包進行可視化，結果如圖4所示，G矩陣的親緣關系結果與IBS遺傳距離矩陣的結果相似。矩陣中顏色越接近紅色表明個體間親緣關系越近，越接近藍色表明個體間親緣關系越遠。從圖中可以看出，大多數個體間的親緣關系較遠（圖4中藍色方格），也有少部分個體間親緣關系較近（圖 4中橙色方格）。

2.6 道州灰鵝群體滲透分析與主成分分析

利用admixture軟件進行道州灰鵝的群體滲透分析，根據CV error最小確定最佳K值，結果如圖5A所示，最佳K值為2。群體滲透分析結果如圖5B所示，在群體結構聚類圖中，當K=2時群體分為了兩個相對獨立的亞群，分別有41個個體和8個個體；當K=3時，采樣群體被分為3個亞群，分別有36個個體、8個個體、5個個體；當K≥4時，由于離最佳K值較遠，劃分的群體沒有太大的參考意義。

使用GCTA軟件分析群體的主成分，PCA結果如圖5C所示，使用PC1與PC2可以將道州灰鵝的49個樣本分為3個聚類亞群：亞群1包含8個個體，亞群2包含36個個體，亞群3包含5個個體，這與群體滲透分析中K=3時的分群結果一致。在IBS遺傳距離矩陣（圖3）中，左上角的5個個體的亞群與右下角8個個體的亞群和剩下36個個體形成的亞群也與群體滲透分析和PCA的分群結果一致。

2.7 群體分化指數Fst

采用vcftools通過滑窗分析，計算上述分出的3個亞群的平均Fst值，結果如表2所示，亞群1和亞群3的值為0.100 8，亞群1和亞群2與亞群2和亞群3的Fst值分別為0.037 4和0.026 7。

3 討 論

地方品種是家畜遺傳多樣性的重要組成部分，有很大的育種潛力［22］，大部分地方品種與國外的一些專用品種相比，具有耐粗飼、肉質好、適應性強和抗病力強等優點。但由于受到外來品種對市場的沖擊，大量地方品種的存欄量與養殖量大幅降低，甚至部分品種進入瀕危狀態［23］。地方品種的保種工作是為了保護我們國家畜禽遺傳資源的多樣性，而準確的評估保種工作的效果是制定下一步保種策略的重要前提，只有充分的了解保種群體的遺傳多樣性信息，并作出科學的分析，才能有針對性地提出能夠改善與加強保種效果的方案［24］?；蚪M中的SNP標記作為承載著遺傳信息的分子標記，成為評估種群多樣性的理想載體。隨著測序技術的發展與普及，SNP芯片和高通量測序技術逐漸應用到了各項生命科學的研究當中，目前，鵝產業中沒有成熟的商業SNP芯片，因此，本研究利用全基因組重測序技術分析了道州灰鵝保種群體的遺傳結構與遺傳多樣性，評估了道州灰鵝的保種效果。

本研究使用了道州灰鵝保種場49個家系公鵝個體的重測序數據，對數據進行一系列的整理與分析，得到了道州灰鵝保種群體的遺傳結構與遺傳多樣性結果。通過對道州灰鵝保種群體進行遺傳多樣性分析，能夠揭示群體內部的適應潛能和生存能力。為了全面評估采樣群體的遺傳多樣性，本研究采用了多個量化指標，包括觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、近交系數（Fis）、多態信息含量（PIC）以及基因多樣性指數（Nei）。結果顯示，群體觀測雜合度為0.280，期望雜合度為0.288，觀測雜合度略微小于期望雜合度，二者相差不大，也說明了群體內近交現象較少，群體近親系數Fis為0.070也證明了這個現象。多態信息含量（PIC）結果顯示，PIC均值為0.262，且大部分位點屬于中度多態性位點，基因多樣性指數Nei為0.331，綜合分析得出，道州灰鵝保種群體的遺傳多樣性良好。湯青萍等［25］對包括道州灰鵝在內的6個鵝種進行種群動態分析，采用微衛星標記的方法計算了各鵝種的遺傳參數，其中道州灰鵝基于微衛星基因座計算出的遺傳雜合度為0.670，多態信息含量為0.386，由于方法不同以及時間久遠，與本研究的結果難以進行比較。

ROH片段的長短能夠揭示群體內近交積累的程度，長的ROH片段說明發生在最近世代的近交關系，越多說明群體內存在近交的可能性越高［26-28］。通過分析SNP位點信息，能夠運用ROH來估算分子水平上的近交系數［29］，與傳統基于系譜估計的近交系數（FPED）或者利用SNPs位點雜合度計算的近交系數相比較，基于ROH估計出的FROH值更加接近真實的近交系數。在群體系譜信息缺失的情況下，FROH可以作為替代方法評價畜禽群體的近交程度［30，31］。黃紅艷等［32］在對獅頭鵝群體遺傳多樣性的研究中，計算出基于ROH的近交系數FROH值為0.223，存在一定的近交積累現象。本研究中，在道州灰鵝保種群體檢測出的ROH片段，通過計算，結果顯示有少量長的ROH片段，反映了在道州灰鵝群體中發生了少量的近交事件，根據FROH值看出，個體的近交系數平均值為0.010，最大值僅為0.020，說明群體的近交積累并不多，只有少部分個體存在一定的近交現象。

我國目前大部分保種場都采用閉鎖繁育的策略進行遺傳資源的保護，但封閉的繁育環境使得種群的遺傳多樣性容易受到人工選擇的影響［33］。IBS遺傳距離矩陣和親緣關系G矩陣結果顯示，大部分家系之間的遺傳距離較遠，只有少部分家系例如：1號、2號和9號家系之間，25號、26號和49號家系之間的親緣關系較近，為了避免進一步的近交積累，后續這部分家系之間應避免進行繁育。群體滲透分析與主成分分析結果顯示，道州灰鵝保種群體被分為3個亞群，其中亞群1和亞群3分別聚類了8只鵝和5只鵝，和上述IBS矩陣與G矩陣共同分析，這些亞群中公鵝代表的家系之間存在親緣關系較近的情況。根據群體分化指數Fst的結果，亞群1和亞群3的Fst值為0.1008，Fst值范圍在0.05～0.15，說明兩個亞群之間出現了中等程度的遺傳分化［34］，后續可以加強兩個亞群所代表家系之間的繁殖交流，亞群內各家系間應減少繁殖交流，以降低遺傳分化與近交積累。

4 結 論

本研究利用全基因組重測序技術得到道州灰鵝保種場49個家系的公鵝重測序數據，比對到鵝基因組，得到SNP位點信息，分析得到保種群體的遺傳多樣性、近交程度、親緣關系以及種群結構等結果。根據分析結果推測，道州灰鵝保種場的鵝遺傳多樣性較為豐富，近交現象較少，只有少部分家系間親緣關系較近，后續應當調整配種計劃，減少這部分家系間的配種，也可以適量從外部引種，豐富保種群體的遺傳多樣性，減少近交事件的發生，為后續本品種的提純復壯建立良好的基礎。

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（編輯 郭云雁）