SFRP4基因對牛前體脂肪細胞分化作用的影響

摘 要：

旨在探究分泌型卷曲相關蛋白4（screted frizzled related protein 4，SFRP4）基因對于牛前體脂肪細胞分化的影響，本研究以秦川牛腎周前體脂肪細胞為試驗對象，處理組和對照組進行了3個生物學重復。克隆秦川牛SFRP4基因完整的蛋白質編碼區序列，并進行生物信息學分析；利用實時熒光定量PCR技術檢測該基因在秦川牛各組織及腎周前體脂肪細胞各分化階段中的表達；篩選有效的牛SFRP4基因siRNA序列，構建腺病毒過表達載體，分別轉染至牛腎周前體脂肪細胞中誘導分化，通過油紅O染色、qRT-PCR和蛋白質印跡等試驗方法探究SFRP4基因對腎周前體脂肪細胞分化的影響。結果表明，秦川牛SFRP4基因CDS全長1 041 bp，氨基酸序列與綿羊和山羊具有高度同源性，與小鼠的親緣關系較遠；該蛋白分類為親水性蛋白，共有24個磷酸化修飾位點；該基因在秦川牛各組織廣泛表達，在腎臟和皮下脂肪相對表達量較高。時序表達譜顯示前體脂肪細胞分化過程中SFRP4基因表達量呈現先升高后降低趨勢。干擾SFRP4后，牛腎周前體脂肪細胞脂滴明顯減少，脂質細胞成脂分化標志基因PPARγ、FABP4、PLIN2、SCD1表達水平顯著下調（Plt;0.05），CEBPβ表達水平極顯著下調（Plt;0.01），PPARγ（Plt;0.05）和CEBPβ（Plt;0.01）蛋白水平顯著下調；過表達該基因后，顯著上調PPARγ（Plt;0.01）、CEBPβ（Plt;0.01）、FABP4（Plt;0.05）、PLIN2（Plt;0.01）、SCD1（Plt;0.01）基因表達水平，顯著上調了PPARγ、CEBPβ、FABP4、SCD1蛋白水平（Plt;0.05）。以上結果為進一步闡述SFRP4基因調控牛腎周前體脂肪細胞成脂分化和脂肪沉積提供了重要的依據。

關鍵詞：

秦川牛；SFRP4；腎周前體脂肪細胞；成脂分化

中圖分類號：

S823.2"""" 文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0611-10

收稿日期：2024-08-21

基金項目：陜西省畜禽育種“兩鏈”融合重點專項（2022GD-TSLD-46-0404；2022GD-TSLD-46-0104）；陜西省農業科技創新驅動項目（NYKJ-2022-YL（XN）03）

作者簡介：趙剛奎（1998-），男，陜西安康人，碩士生，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail： 2272248441@qq.com

*通信作者：趙春平，主要從事肉牛遺傳育種和健康養殖研究，E-mail： zhao.chunping@nwsuaf.edu.cn

The Effects of the SFRP4 Gene on Bovine Preadipocyte Differentiation

ZHAO" Gangkui， GAO" Haixu， YIN" Siqi， SUN" Honghong， XIN" Yiran， ZAN" Linsen， ZHAO" Chunping*

（College of Animal Science and Technology， Northwest Aamp;F University， Yangling 712100，" China）

Abstract：

This study aimed to explore the effects of the screted frizzled related protein 4 （SFRP4） gene on the differentiation of bovine preadipocytes， the Qinchuan cattle perirenal preadipocytes was used as the experimental subject. Both treatment and control groups had 3 biological replicates. The full-length protein-coding sequence of the SFRP4 gene was cloned and analyzed via bioinformatics. Quantitative real-time PCR assessed SFRP4 expression across various tissues and differentiation stages in perirenal preadipocytes. Effective bovine SFRP4 siRNA sequences were screened， and an adenoviral overexpression vector was constructed for transfection and differentiation induction in bovine preadipocytes. Oil Red O staining， qRT-PCR， and Western blotting were used to evaluate the function of SFRP4. Results demonstrated the CDS of SFRP4 gene was 1 041 bp; There were high homology between Qinchuan cattle SFRP4 amino acid sequences and those of sheep and goats， with more distant relationships to mice. This protein was classified as a hydrophilic protein and had a total of 24 phosphorylation modification sites. SFRP4 was broadly expressed across tissues， with higher expression in kidney and subcutaneous fat. Temporal expression patterns of SFRP4 during perirenal preadipocyte differentiation indicated an initial increase followed by a decrease. SFRP4 knockdown resulted in reduced lipid droplet accumulation in perirenal preadipocytes， with significant downregulation of adipogenic differentiation marker genes PPARγ， FABP4， PLIN2， and SCD1 （Plt;0.05）， and a highly significant reduction in CEBPβ expression （Plt;0.01）. PPARγ （Plt;0.05） and CEBPβ （Plt;0.01） protein levels were also downregulated. Conversely， SFRP4 overexpression led to significant upregulation of PPARγ （Plt;0.01）， CEBPβ （Plt;0.01）， FABP4 （Plt;0.05）， PLIN2 （Plt;0.01）， and SCD1 （Plt;0.01） genes expression and increased PPARγ， CEBPβ， FABP4， and SCD1 protein levels （Plt;0.05）. These findings provide critical insights into the regulatory role of SFRP4 in bovine perirenal preadipocyte adipogenic differentiation and lipid deposition.

Key words：

Qinchuan cattle; SFRP4; perirenal preadipocytes; adipogenic differentiation

*Corresponding author： ZHAO Chunping， E-mail： zhao.chunping@nwsuaf.edu.cn

隨著經濟發展和生活水平提高，居民對牛肉，尤其是脂肪含量豐富、肉色鮮亮的高品質牛肉需求量不斷上升［1］。牛肉品質直接受牛肉的口感、嫩度和多汁性等因素影響，而肌內脂肪含量和這些因素呈正相關，因此，提高肌內脂肪含量是當前肉牛育種領域的研究熱點［2］。

脂肪組織是一種復雜且重要的代謝和內分泌器官，主要由前體脂肪細胞發育而來，并以脂質的形式儲存能量［3］。脂肪含量的變化取決于脂肪細胞數量和大小的改變［4］。經典的Wnt信號通路在控制脂肪形成中發揮著重要作用［5］，而許多分泌蛋白抑制Wnt信號通路，其中分泌型卷曲相關蛋白4（secreted frizzled related protein 4，SFRP4）是第一個被發現的Wnt信號通路拮抗劑［6］，在癌癥、心血管疾病、肥胖方面均有研究［6-8］。SFRPs蛋白的N端具有富含半胱氨酸的結構域（CRD），與卷曲受體的CRD結構域具有30%～50%的同源性，以及具有C端netrin（NTR）樣結構域［9，10］。在功能上，SFRPs通過從其受體/共受體復合物中隔離Wnt配體，或與卷曲受體的CRD序列形成非功能性復合物而發揮作用［11］。其中，分泌卷曲相關蛋白4（SFRP4）在肥胖個體的內臟脂肪組織中高表達［12］，在脂肪的形成中具有重要作用。前人研究表明，SFRP4通過Wnt通路調控葡萄糖和脂質代謝［13］。此外，SFRP4已被證明通過Wnt/β-catenin信號通路影響人脂肪組織的間充質干細胞的前脂肪細胞分化［14］。Park等［15］研究了Wnt家族在人脂肪組織間充質干細胞（hAMSCs）成脂分化中的作用，干擾SFRP4可部分抑制hAMSCs向脂肪細胞分化，并恢復β-catenin水平。研究發現，干擾SFRP4基因導致小鼠內臟和皮下兩種不同來源的前體脂肪細胞分化水平出現較大的差異，表明SFRP4基因在不同部位脂肪組織中發揮的作用不盡相同，而且調節脂質累積的機制過程也是非常錯綜復雜［16］。盡管研究表明，SFRP4對脂肪細胞發育過程具有重要調控作用，但對肉牛脂肪細胞發育的作用尚未見報道。

本試驗以秦川牛為研究對象，克隆牛SFRP4基因，對其進行生物信息學分析，利用qRT-PCR檢測該基因在秦川牛不同組織和脂肪細胞不同分化階段的表達情況，通過過表達或干擾SFRP4探究該基因在秦川牛腎周前體脂肪細胞分化過程中的作用及機制。本研究將為深入研究SFRP4基因在牛脂肪沉積中的生物學功能提供參考，為肉牛分子育種提供潛在的基因和靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

本研究所使用的前體脂肪細胞均來源于西北農林科技大學國家肉牛改良中心秦川牛良種繁育場新出生的1日齡秦川牛分離的腎周脂肪，細胞分離和鑒定按照本實驗室傳統方法進行［17］。

1.1.2 主要試劑及儀器

胎牛血清（PAN）；紅細胞裂解液（Gibco）；PBS緩沖液（Hyclonc）；lip3000轉染試劑（Rochec）；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）；Opti-MEM培養基（Gibco）；誘導液（基礎培養液中含0.5 mmol·L-1 IBMX、2 mmol·L-1胰島素、1 mmol·L-1地塞米松、1 mmol·L-1羅格列酮），誘導液（基礎培養液中含2 mmol·L-1胰島素）；倒置熒光顯微鏡（Olpymus）；CO2 細胞培養箱（ThermoFisher）；實時熒光定量PCR儀（Biorad）。

1.2 方 法

1.2.1 秦川牛SFRP4基因克隆

根據GenBank上的牛SFRP4序列（NM_001075764.1）設計引物（F：TGAACCTTTTTTCAACATTGCCT; R： GTGCCAACTGGGTCTTTCA），引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以秦川牛血樣DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增體系參照文獻［18］。PCR產物純化回收后送至北京擎科生物技術有限公司測序。獲得目的序列后，通過Mega X軟件將秦川牛SFRP4基因家族的氨基酸序列與不同物種氨基酸序列比較，并通過鄰接法構建系統進化樹。

1.2.2 秦川牛SFRP4基因家族的生物信息學分析

對得到的秦川牛SFRP4序列進行生物信息學分析，分析工具和方法參照文獻［17］。

1.2.3 秦川牛SFRP4基因組織表達分析及分化時序表達分析

Trizol法提取成年秦川牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、結腸、肌肉、皮下脂肪等各組織及不同分化天數（第0、2、4、6、8天，分別記為D0、D2、D4、D6、D8）的牛前體脂肪細胞總RNA，進行反轉錄和定量，qRT-PCR體系及相關步驟見文獻［19］，引物信息見表1。

1.2.4 SFRP4基因siRNA篩選及過表達腺病毒載體的構建

當脂肪細胞在6孔板上的融合度達到80%，密度為1.2 × 105個·孔-1時，將生長培養基改為opti/MEMTM培養基進行饑餓培養，并用LipofectamineTM3000試劑轉染siRNA。24 h后換為生長培養基繼續培養。48 h后收集細胞，測定干擾效率。干擾序列由上海生工有限公司合成（siRNA-699： S： ACGACGUUAAGUGGAUAGACATT， A： UGUCUAUCCACUUAACGUCGUTT; siRNA-951： S： GGACUCAAGUCCCUCUUAUUATT， A： UA-AUAAGAGGGACUUGAGUCCTT; siRNA-1294： S： GUGAGCUAACUGCUUUCUGAATT， A： UUCAGAAAGCAGUUAGCUCACTT;siNC： A： UUCUCCGAACGUGUCACGUTT， S： ACGUGA-CGUGGAGAATT）。腺病毒包裝由上海和元生工公司合成，侵染試驗詳細步驟見文獻［20］。

1.2.5 油紅O染色

轉染并誘導分化6 d后，用PBS洗滌細胞2～3次，用4%甲醛固定15 min后用PBS洗滌2～3次。然后在室溫下用油紅O工作液染色30 min。用PBS洗滌后，用光學顯微鏡對細胞進行觀察和拍照。

1.2.6 Western blot（WB）蛋白印跡試驗

用全蛋白提取試劑盒（索萊寶）提取牛脂肪細胞蛋白質。蛋白質由SDS-PAGE（索萊寶）分離，然后轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。隨后與一抗在4℃下孵育過夜，然后將膜與二抗在室溫下孵育2 h。最后，用ECL試劑進行可視化處理，利用BIO-RAD分子成像儀對蛋白印跡進行圖像拍攝。所用抗體包括β-actin（Ab8226）、SFRP4（Ab154167）、PPARγ（A00449-2）、CEBPB（MBS821347）、FABP4（Ab92501）、SCD1（Ab236868）。

1.2.7 統計及分析

qRT-PCR結果使用GraphPad Prism6.0軟件進行分析和作圖，WB結果使用ImageJ軟件進行蛋白條帶灰度值的量化。使用SPSS Statistics 27軟件對數據進行統計分析（每組3個重復），采用one-way ANOVA和t檢驗進行方差分析和顯著性分析（*Plt;0.05，** Plt;0.01，*** Plt;0.001）。

2 結 果

2.1 秦川肉牛SFRP4基因克隆和生物信息學分析

以秦川牛血樣DNA為模板，通過PCR擴增，產物電泳檢測條帶單一、清晰、大小與預期相符（圖1A）。對測序結果進行NCBI BLAST比對分析，結果顯示秦川牛SFRP4基因CDS全長1 041 bp，與GenBank中的相應序列一致，共編碼346個氨基酸。將獲得的SFRP4氨基酸序列分別與NCBI上的人、黑猩猩、獼猴、馬、瘤牛、水牛、綿羊、山羊、小鼠等其他物種序列進行比對，結果顯示，秦川牛SFRP4氨基酸序列與瘤牛、綿羊、山羊100％一致，與人、黑猩猩相似性為99%，與小鼠的親緣關系較遠為94%（圖1B）。

使用ExcertSy ProtParm在線程序對SFRP4蛋白質相對分子質量、氨基酸組成及等電點等理化性質進行分析預測，結果顯示秦川牛SFRP4蛋白分子式為C1736H2809N497O496S31，原子總數為5 569，相對分子質量為39 573.29，理論等電點（pI）為9.02；其氨基酸殘基中異亮氨酸所占比重最高，為9%，苯丙氨酸占比較低，僅為1.2%，不穩定指數為55.03，提示該蛋白分類為不穩定蛋白。

ProtScale程序對蛋白的親疏水性分析結果表明（圖2A），該基因編碼蛋白質疏水性最大值為2 500，其中Ile的單個值最高，達到4 500；最小值為-2.911，推測SFRP4蛋白可能為親水性蛋白。蛋白磷酸化位點結果表明（圖2B），SFRP4蛋白中磷酸化修飾位點共24個（得分＞0.5），共包含絲氨酸磷酸化位點15個，蘇氨酸磷酸化位點8個，酪氨酸磷酸化位點1個。使用SignalP 6.0在線網站預測秦川牛SFRP4基因編碼的氨基酸序列中信號肽切割位點的位置（圖2C），結果顯示SFRP4基因編碼氨基酸序列信號肽剪切位點有75.92%概率位于第21和第22位點之間。

對SFRP4蛋白質二級結構分類判別預測（DSC）、多變量線性回歸組合預測（MLRC）、神經網絡預測（PHD）和綜合預測（Sec.Cons.）計算α-螺旋、延伸鏈、無規則卷曲等占比（表2），結果表明SFRP4蛋白二級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲構成。

利用SWISS-MODEL軟件通過同源建模法進一步對SFRP4蛋白三級結構進行預測，可視化結果表明，SFRP4蛋白的三級結構與二級結構預測一致（圖2D）。

根據蛋白質亞細胞定位預測工具PSORT Ⅱ Prediction在線程序預測，結果顯示秦川牛SFRP4蛋白的亞細胞分布于細胞外概率為44.4%，分布于細胞核的概率為22.2%，而在細胞骨架、線粒體及細胞質中分布的概率均為11.1%。

2.2 秦川牛SFRP4基因組織表達譜和時序分析

利用qRT-PCR技術檢測SFRP4基因在1日齡秦川牛不同組織表達情況結果顯示，SFRP4基因在1日齡犢牛皮下組織和腎臟中表達量最高，該基因在這兩種組織的表達量顯著高于其他組織（Plt;0.01），在膽囊、脾臟、肝臟、結腸等組織中則表達量較低，其在皮下脂肪的表達量是肝臟中的275倍（圖3A）。

為了探究SFRP4基因對不同誘導分化時長的腎周前體脂肪細胞的影響，利用qRT-PCR測定在體外誘導分化秦川肉牛腎周脂肪細胞第0、2、4、6、8天SFRP4基因的表達量。結果顯示與誘導分化第0天（D0）相比，SFRP4基因在腎周前體脂肪細胞誘導分化的第0～8天整體表達趨勢呈現先升高后降低，第2天的表達量顯著高于其它天數（Plt;0.01），總體上D2、D4、D6、D8相比D0極顯著上調（Plt;0.01）（圖3B）。

2.3 干擾SFRP4基因抑制前體脂肪細胞分化

分別轉染3條si-SFRP4（si-699、si-951、si-1294），并檢測干擾效率。qRT-PCR檢測結果顯示，SFRP4基因mRNA水平分別降低了92%、94%、95%（Plt;0.001），最終選用干擾效率最高的si-1294進行后續試驗（圖4A）。油紅O染色結果表明，si-SFRP4組第6天產生的脂滴數量顯著低于si-NC組（圖4B）。干擾SFRP4后，誘導分化第2天CEBPβ（Plt;0.05）、FABP4（Plt;0.05）、PLIN2（Plt;0.05）等成脂分化相關標志性基因的表達量顯著下調（圖4C），誘導分化第6天PPARγ（Plt;0.05）、CEBPβ（Plt;0.01）、FABP4（Plt;0.05）、PLIN2（Plt;0.05）、SCD1（Plt;0.05）等成脂分化相關標志性基因的表達量顯著下調（圖4D）。同時，Wnt/β-catenin（脂肪生成抑制相關通路）通路相關基因WNT7A與β-catenin 基因表達量顯著上調（Plt;0.05）（圖4E）。WB結果表明，干擾SFRP4基因后，成脂分化相關標志性蛋白PPARγ（Plt;0.05）、CEBPβ（Plt;0.01）表達量顯著下調，FABP4和SCD1的蛋白表達量也有下調趨勢（圖4F）。綜上所述，干擾SFRP4基因抑制秦川牛腎周前體脂肪細胞的分化。

2.4 過表達SFRP4基因促進前體脂肪細胞分化

qRT-PCR檢測結果顯示，過表達組SFRP4基因的表達率比對照（NC）組上調了約900倍（Plt;0.001）（圖5A）。油紅O染色結果顯示，過表達SFRP4后第6天OE組脂滴數量明顯高于NC組（圖5B），Wnt/β-catenin（具有脂肪生成抑制功能）通路相關基因WNT7A與β-catenin基因顯著下調（圖5C）。OE組誘導分化第2天，成脂分化標志基因PPARγ（Plt;0.05）、CEBPβ（Plt;0.05）、FABP4（Plt;0.05）、PLIN2（Plt;0.01）顯著上調（圖5D）；誘導分化第6天PPARγ（Plt;0.01）、CEBPβ（Plt;0.01）、FABP4（Plt;0.05）、PLIN2（Plt;0.01）、SCD1（Plt;0.01）等基因的表達量顯著上調（圖5E）。WB結果表明，過表達SFRP4基因后，成脂分化相關標志性蛋白PPARγ（Plt;0.05）、CEBPβ（Plt;0.05）、FABP4（Plt;0.05）、SCD1（Plt;0.05）顯著上調（圖5F）。綜上所述，過表達SFRP4基因促進秦川牛腎周前體脂肪細胞分化。

3 討 論

SFRP4基因在1997年首次被發現以來引起廣泛關注，它含有一個半胱氨酸配體結合域，與Wnt卷曲受體的配體結合域非常相似［21］，包含6個外顯子與5個內含子，在其N端含有約110個堿基的netrin相關基序，而在C端的CRD區大約有128個堿基高度一致［22］。研究表明，SFRP4可以與Wnt結合體調節下游信號通路［23］，考慮到Wnt可以促進果蠅脂肪的分解［24］，以及人脂肪干細胞外泌體通過下調Wnt通路來促進脂肪合成［25］。推測SFRP4在脂肪細胞發育中起重要調控作用。

本研究在秦川牛中克隆SFRP4基因CDS區全序列，生物信息學分析顯示SFRP4有24個磷酸化修飾位點，這些位點可能參與蛋白翻譯后修飾和細胞信號轉導［26］。同時，發現的Sec/SPI信號肽將有助于介導對蛋白的轉運［27］。氨基酸進化樹序列顯示，SFRP4基因在不同物種中具有保守性，進一步說明了該基因的重要功能。

SFRP4基因在多種組織中普遍表達，包括子宮內膜、胰腺、胃腸道等器官［28］，SFRP4基因也被稱為人子宮內膜基因［29］。以往研究表明SFRP4參與調控卵巢細胞自噬［30］、線粒體功能障礙［31］以及羊毛纖維發育［32］。本研究通過qRT-PCR檢測發現，SFRP4基因在秦川牛11個組織中均有表達，特別在皮下脂肪和腎臟中的表達顯著性高于其他組織，這一發現為SFRP4參與秦川牛脂肪生成調控提供了新的證據。

已有研究表明SFRP4表達隨著細胞分化和凋亡而增加［33］。通過生物信息學分析發現，SFRP4是肥胖患者減肥手術后調控皮下脂肪的關鍵基因［34］。脂肪沉積是極其復雜的生理過程，受到以PPARγ和CEBPα為核心的復雜網絡調控［35］。研究表明小鼠棕色脂肪細胞中過表達SFRP4促進棕色脂肪的分化［36］，棕色脂肪在機體中具有產熱功能［37］。

本研究利用qRT-PCR探究了SFRP4的時空表達特性，發現在腎周脂肪分化第2天有較高的表達量，揭示SFRP4在秦川牛腎周前脂肪細胞分化過程中具有重要的調節作用。干擾SFRP4后發現，秦川牛腎周脂肪細胞脂滴數量顯著下降，脂肪細胞分化程度明顯減弱；秦川牛腎周前脂肪細胞過表達SFRP4后，脂滴數量顯著增加，成熟脂肪數量顯著上升，并且分化效果增強。表明SFRP4對脂肪生成有積極作用，這一點和前人研究一致［38］。進一步研究表明SFRP4通過CEBPβ和PPARγ關鍵轉錄因子［39］以及FABP4和SCD1等下游基因影響秦川牛腎周前體脂肪細胞的分化。Western blot試驗的結果進一步驗證了SFRP4對成脂標志基因蛋白表達水平的調控作用。

4 結 論

本研究克隆了秦川牛SFRP4基因CDS區序列全長1 041 bp，共編碼346個氨基酸。其在秦川牛皮下脂肪中表達量最高，在結腸中表達量最低。秦川牛SFRP4基因隨著腎周前體脂肪細胞分化表達量逐漸升高，在第2天表達量最高，之后表達量逐漸降低。過表達秦川牛SFRP4促進腎周前體脂肪細胞的分化，干擾后抑制腎周前體脂肪細胞分化，揭示SFRP4是秦川牛腎周前體脂肪細胞分化過程中的一個正調控因子。本研究結果將為秦川肉牛脂肪沉積提供分子育種基礎。

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