去乙酰化酶Sirt1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖和分化的影響

摘 要：

旨在探討沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（silent information regulator 2-related enzyme1，Sirt1）對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞（bovine skeletal muscle satellite cells，BSMSCs）增殖和成肌分化的影響。在本試驗中，將小片段干擾RNA（siRNA）和靶向Sirt1的過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入從3～4月齡胎牛臀腿肌剝離的原代衛(wèi)星細胞中，在增殖和分化階段的特定時間點收集RNA和蛋白質(zhì)樣品，每個處理設計3個生物學重復，使用實時定量PCR（qRT-PCR）以及蛋白質(zhì)印記法（Western blotting）進行分析。此外，還進行了EdU染色試驗以評估細胞的增殖情況。結(jié)果顯示：在細胞分化期，40倍顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)Sirt1敲低導致肌管的數(shù)量、長度和直徑顯著增加。qRT-PCR和Western blotting證實，與對照組相比，分化標志物肌球蛋白重鏈（myosin heavy chains，MyHC）和肌細胞生成素（myogenin，MyoG）的mRNA水平顯著上調(diào)（Plt;0.01），MyoG的蛋白表達水平也顯著升高（Plt;0.05）。相反，Sirt1過表達導致肌管的數(shù)量、長度和直徑顯著減少。Western blotting顯示Sirt1過表達組MyoG表達量顯著低于對照組（Plt;0.01）。在BSMSCs增殖期，qRT-PCR、Western blotting和EdU檢測表明，Sirt1敲低和過表達對細胞增殖均無顯著影響（Pgt;0.05）。綜上所述，Sirt1敲減可有效促進細胞分化，而過表達可抑制該過程，但對增殖均無明顯影響。這些發(fā)現(xiàn)證實了Sirt1是作為調(diào)控BSMSCs成肌分化的重要因素，在協(xié)調(diào)成肌細胞分化和促進肌管形成中起關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞：

Sirt1；牛骨骼肌衛(wèi)星細胞；細胞增殖；成肌分化

中圖分類號：

S823.2"""" 文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0603-08

收稿日期：2024-08-01

基金項目：天津市“131”創(chuàng)新型人才培養(yǎng)工程第一層次人選資助項目

作者簡介：張正雨（1999-），男，貴州遵義人，碩士，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail： 2203010125@stu.tjau.edu.cn

*通信作者：丁向彬，主要從事動物遺傳育種與繁殖方向的研究，E-mail： xiangbinding@tjau.edu.cn

Effects of Sirt1 Deacetylase on Proliferation and Differentiation of Bovine Skeletal Muscle Satellite Cells

ZHANG" Zhengyu， YANG" Peihong， GUO" Hong， LI" Xin， ZHANG "Linlin， GUO" Yiwen， HU" Debao， DING" Xiangbin*

（Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Breeding， School of Animal Science and Animal Medicine， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384，" China）

Abstract：

The aim of this study was to investigate the effect of silent information regulator 2-related enzyme1 （Sirt1） on proliferation and myogenic differentiation of BSMSCs. In this experiment， small fragments of interfering RNA （siRNA） and overexpressed plasmid targeting Sirt1 were transfected into primary satellite cells stripped from the thigh muscle of 3-4-month-old fetal cattle. RNA and protein samples were collected at specific time points during the proliferation and differentiation stages， with 3 biological replicates per treatment. Real-time quantitative PCR （qRT-PCR） and Western blotting were used for analysis. In addition， EdU staining experiments were performed to evaluate cell proliferation.The results showed that the number， length， and diameter of muscle ducts were significantly increased by Sirt1 knockdown under a 40-fold microscope during cell differentiation. qRT-PCR and Western blotting confirmed that compared with the control group， mRNA levels of differentiation markers myosin heavy chains （MyHC） and myogenin （MyoG） were significantly up-regulated after interfering Sitr1 （Plt;0.01）. The protein expression level of MyoG was also significantly increased （Plt;0.05） after interfering Sitr1. Conversely， Sirt1 overexpression resulted in a significant reduction in the number， length， and diameter of muscle ducts. Western blotting showed that the expression of MyoG in Sirt1 overexpression group was significantly lower than that in control group （Plt;0.01）. At the proliferation stage of BSMSCs， qRT-PCR， Western blotting and EdU tests showed that Sirt1 knockdown and overexpression had no significant effects on cell proliferation （Pgt;0.05）. In summary， Sirt1 knockdown can effectively promote cell differentiation， while overexpression can inhibit the process， but has no significant effect on proliferation. These findings confirm that Sirt1 is an important factor regulating the myogenic differentiation of BSMSCs， and plays a key role in coordinating myoblast differentiation and promoting myotube formation.

Key words：

Sirt1; bovine skeletal muscle satellite cells; cell proliferation; myogenic differentiation

*Corresponding author： DING Xiangbin， E-mail： xiangbinding@tjau.edu.cn

Sirt1是Sirtuin家族蛋白中的一員，這個家族是一種高度保守的并且依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的III類組蛋白去乙酰化酶［1］，它們在每一個脫酰循環(huán)中都消耗一個NAD+分子［2］。Sirt1不僅通過去乙酰化修飾組蛋白，如Histone4 Lysine16（H4K16）、Histone3 Lysine9（H3K9）調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達［3，4］。還對多種非組蛋白例如腫瘤蛋白53（tumor protein 53，p53）、叉頭蛋白家族（forkhead box O，F(xiàn)oxOs）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）直接去乙酰化，從而在轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平上調(diào)控關(guān)鍵的生物過程［5-8］。這些過程涵蓋了能量代謝、細胞衰老、凋亡和炎癥反應等［9］。在能量代謝的調(diào)控中，Sirt1與超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，Sod2）的相互作用被證實能夠減輕能量限制（CR）引起的綿羊睪丸間質(zhì)細胞氧化應激和線粒體功能障礙［10］。此外，褪黑素通過上調(diào)Sirt1的表達抑制FoxO1，促進牛卵巢顆粒細胞的線粒體自噬，進而減少氧化應激引發(fā)的凋亡和線粒體損傷［11］。這些研究強調(diào)了Sirt1在調(diào)控細胞生存和線粒體穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1的自噬降解可能通過促進衰老相關(guān)的炎癥反應，影響癌前病變的免疫監(jiān)視［12，13］。此外，在雞毒支原體病的防治中，Sirt1的表達與槲皮素通過AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）途徑抑制炎癥因子的作用密切相關(guān)［14］。

盡管Sirt1在多種哺乳動物和家禽體內(nèi)的生理功能已得到廣泛研究，但其在骨骼肌發(fā)育及分化中的具體作用，尤其是在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞（BSMSCs）中的調(diào)控機制仍未得到充分揭示。雖有研究表明，Sirt1通過調(diào)控組蛋白和非組蛋白的乙酰化狀態(tài)，參與衛(wèi)星細胞增殖與分化的調(diào)控，這對于理解肌肉發(fā)育和修復機制至關(guān)重要［15］。然而，目前對Sirt1在牛骨骼肌中的具體調(diào)控作用的研究仍較為有限。在此研究背景下，本試驗采用BSMSCs體外成肌分化模型，通過處理Sirt1后觀察關(guān)鍵調(diào)控因子的變化，驗證Sirt1對BSMSCs增殖和分化的影響。目的是探究Sirt1在肌肉發(fā)育調(diào)控方面的作用，填補牛骨骼肌Sirt1調(diào)控作用的空白，同時為后續(xù)深入研究Sirt1對于肌肉分化的具體機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

本試驗所用的BSMSCs來源于天津市農(nóng)業(yè)動物繁殖與健康養(yǎng)殖重點實驗室［16］。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）、脫脂奶粉、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000均購自Thermo Scientific公司；蛋白酶抑制劑（PMSF）、RIPA緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技有限公司；6孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板購于北京白鯊易生物公司；All-in-oneTM qPCR Mix購于GeneCopoeia公司；EdU試劑盒購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購于上海雅酶生物公司；Sirt1、Pax7、GAPDH、MyHC、MyoG抗體購于杭州景杰生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設計和過表達載體構(gòu)建

由廣州銳博公司設計并合成物種牛的Sirt1 siRNA與陰性對照（si-Sirt1和si-NC），上海生工生物公司合成Sirt1過表達質(zhì)粒（pcDNA-Sirt1）。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

增殖期：用80％DMEM+20％FBS增殖培養(yǎng)基重懸細胞后均勻鋪于6孔與24孔細胞培養(yǎng)板中，放入37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達到70%～80%時轉(zhuǎn)染，6 h更換培養(yǎng)基，12 h后6孔板收集細胞蛋白，24孔板收集RNA。

分化期：當增殖期細胞密度達到相同密度時轉(zhuǎn)染，細胞稍融合后，在相同條件下更換為添加3%HS的分化培養(yǎng)基以誘導分化。48 h后提取蛋白與RNA。試驗分為4組：si-Sirt1組、si-NC組、pcDNA-Sirt1組和pcDNA-NC組，按照Lipofectamine 3000說明書進行轉(zhuǎn)染，到培養(yǎng)時間后提取各組細胞樣品。

1.2.3 RNA與蛋白提取

RNA提取：使用RNA快速提取試劑盒提取細胞總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于熒光定量PCR。

蛋白提取：用預冷PBS清洗細胞2次后，加入含PMSF的RIPA緩沖液，在冰上裂解10 min，4℃離心，取上清液。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，并根據(jù)濃度進行變性處理，用于后續(xù)Western blotting試驗。

1.2.4 熒光定量PCR

通過NCBI設計qRT-PCR試驗的引物（表1）。96孔定量板中按分組設計3個生物學重復，4個技術(shù)重復。按照All-in-oneTM qPCR Mix說明書設計熒光定量PCR儀（BIO-RAD）程序。

1.2.5 Western blotting檢測

使用SDS-PAGE凝膠試劑盒制備凝膠，將蛋白在凝膠上分離，隨后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉2 h，結(jié)束后裁剪所需蛋白條帶，4℃過夜孵育目標抗體。使用TBST洗3次，孵育二抗1 h，再次清洗3次后曝光，使用全能型成像系統(tǒng)（RAD-BIO）曝光與捕獲圖像，后續(xù)用Image J軟件分析印記灰度值。

1.2.6 EdU檢測

將BSMSCs細胞傳代到96孔板中培養(yǎng)，每組設置3個生物學重復。細胞與10 μmol·L-1的EdU培養(yǎng)基孵育3 h后，使用EdU試劑盒檢測BSMSCs的增殖狀態(tài)。在熒光倒置顯微鏡（Leica）下捕獲圖像，并用Image J軟件分析結(jié)果。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗至少設置3個生物重復。Western blotting與qRT-PCR結(jié)果采用Student’s t檢驗，EdU陽性細胞率用卡方檢驗，Graphpad Prism 9做柱狀圖。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，*Plt;0.05表示顯著；**Plt;0.01表示極顯著；n.s.P≥ 0.05表示不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 Sirt1在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞不同時期表達量的變化

為了檢測Sirt1在成肌分化前后的差異，分別" 在增殖期24 h（GM）和分化期1 d、2 d和3 d（DM1、DM2、DM3）收集細胞樣品。通過qRT-PCR和Western blotting檢測4個時期Sirt1的mRNA和蛋白表達水平（圖1）；與GM期相比，Sirt1的mRNA表達量在DM2時期極顯著下降（P＜0.01），而在DM1和DM3時期變化不顯著（P＞0.05）。在蛋白層面，DM2時期Sirt1的表達水平與增殖期相比無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果顯示，Sirt1可能參與了調(diào)控衛(wèi)星細胞的成肌分化過程。

2.2 Sirt1的干擾與過表達對細胞增殖的影響

為了探討Sirt1對衛(wèi)星細胞發(fā)育的作用，將siRNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，提取RNA和蛋白進行檢測（圖2）：干擾和過表達Sirt1后，增殖標志因子Pax7與Ki67的mRNA表達水平與陰性對照（NC組）相比差異均不顯著（P＞0.05），Pax7蛋白表達水平也沒有顯著差異（P＞0.05）。此外，EdU染色試驗結(jié)果顯示（圖3），經(jīng)過兩種不同處理后，染色的陽性細胞標記指數(shù)與NC組相比差異不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，無論是Sirt1的干擾還是過表達，對BSMSCs的增殖狀態(tài)均無顯著影響。

2.3 Sirt1的干擾與過表達對細胞分化的影響

為了評估Sirt1對衛(wèi)星細胞分化的影響。將轉(zhuǎn)染的細胞誘導分化后48 h提取樣品，qRT-PCR結(jié)果顯示（圖4）：Sirt1干擾處理后，MyHC和MyoG的mRNA表達量與NC組相比極顯著增加（P＜0.01）。在蛋白水平上，MyoG的相對表達量顯著上升（P＜0.05），而MyHC的蛋白相對表達無顯著差異（P＞0.05）。Sirt1過表達處理后，MyHC和MyoG在mRNA水平上與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。但MyoG的蛋白相對表達水平極顯著下調(diào)（P＜0.01）。此外，在40倍（40×）光鏡下觀察細胞形態(tài)（圖5），發(fā)現(xiàn)Sirt1敲低處理后的細胞，肌管數(shù)量明顯多于NC組，且肌管的直徑和長度大于NC組。而過表達Sirt1后，肌管數(shù)量減少，變細且長度變短。

3 討 論

當衛(wèi)星細胞激活后，它們通過對稱分裂增加其數(shù)量，或通過不對稱分裂產(chǎn)生新的衛(wèi)星細胞群。隨后，這些細胞通過增殖、相互融合或分化，最終修復受損的肌纖維，恢復肌肉的完整性和功能［17-19］。衛(wèi)星細胞的增殖和分化不僅受到肌源性調(diào)節(jié)因子的影響，還受到許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，各種信號通路的激活或抑制也會對衛(wèi)星細胞產(chǎn)生不同的影響，這些因素在調(diào)控骨骼肌生長發(fā)育方面是不可或缺的，對肌肉細胞譜系的增殖、分化和肌纖維的形成至關(guān)重要［20-23］。Sirt1在其中的作用逐漸引起了眾多研究的關(guān)注。

本研究發(fā)現(xiàn)（圖6），Sirt1通過去乙酰化作用負向調(diào)節(jié)BSMSCs的成肌分化，這與Sirt1在調(diào)控其他細胞類型中所展現(xiàn)的去乙酰化功能相一致。例如，Sirt1去乙酰化酶結(jié)構(gòu)域的消融會使組蛋白H4K16的乙酰化修飾水平升高，從而促進肌源性分化蛋白1（myogenic differentiation 1，MyoD1）的表達，導致C2C12過早分化［24，25］。這一機制表明Sirt1通過調(diào)控成肌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的乙酰化狀態(tài)，影響肌細胞的分化進程。此外，Sirt1還通過與AMPK的協(xié)同作用影響肌肉的能量代謝，AMPK激活后可提高細胞內(nèi)NAD+的水平，從而上調(diào)Sirt1的表達，進而通過去乙酰化調(diào)節(jié)PGC-1α的活性，最終影響線粒體的功能和骨骼肌的能量代謝［26，27］。這一機制進一步表明，Sirt1不僅在肌肉發(fā)育中具有關(guān)鍵調(diào)控作用，還在能量代謝和肌肉功能維持方面起著重要作用。另外，它的功能不僅限于肌肉發(fā)育，還擴展至骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1基因敲除會導致幼鼠的皮質(zhì)骨和小梁骨發(fā)育延遲［28，29］。并且Sirt1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出骨量減少和成骨細胞與破骨細胞比例失衡的現(xiàn)象，導致肌肉萎縮甚至死亡［30］。研究還表明，在人軟骨細胞中，Sirt1及其天然激活劑白藜蘆醇在骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用，白藜蘆醇通過提高軟骨中Sirt1的表達，影響腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）引起核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的高表達，從而保護細胞免受炎性因子的刺激，對骨關(guān)節(jié)起到抗炎作用，抑制OA疾病的進展［31，32］。這些研究結(jié)果提示，Sirt1可能是肌肉和骨相關(guān)疾病的潛在治療靶點，特別是在骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎等疾病中，Sirt1的激活可以通過多種機制減緩疾病進展。總的來說，Sirt1在哺乳動物的骨骼肌中，無論是肌肉的正常發(fā)育、能量代謝調(diào)控還是骨相關(guān)疾病的治療方面都發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié) 論

本試驗強調(diào)了Sirt1在調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育中的關(guān)鍵作用，它抑制BSMSCs的成肌分化；干擾Sirt1能有效促進肌衛(wèi)星細胞的分化進程，而過表達則抑制該過程，且對細胞增殖未產(chǎn)生顯著影響。本研究結(jié)果為治療牛肌肉肌源性缺陷和骨相關(guān)疾病提供了一定的理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)探索組蛋白去乙酰化酶Sirt1對BSMSCs成肌分化調(diào)控作用的具體機制提供了研究依據(jù)。

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（編輯 郭云雁）