miR-665靶向BCL2L11調控武安山羊成肌細胞增殖

摘 要：

旨在利用分子生物學方法探究miR-665靶向調控BCL2L11對山羊成肌細胞增殖的影響。本研究選取1月齡和9月齡的健康山公羊各3只，各年齡段體重均接近且飼養環境相同。本試驗通過RT-qPCR分析BCL2L11在武安山羊不同組織中的表達情況；利用RT-qPCR檢測了不同月齡武安山羊背最長肌組織中BCL2L11和miRNA-665的表達情況；構建了BCL2L11 3′UTR野生型和突變型載體，以及miR-665 mimics和對照組，將其共轉染到HEK293T細胞，通過使用雙熒光素酶報告基因檢測系統鑒定了miR-665與BCL2L11存在靶向性關系。在山羊成肌細胞轉染miR-665 mimic及陰性對照，采用RT-qPCR檢測了細胞凋亡標志因子XIAP和Fas表達水平，同時利用EdU試驗分析miR-665過表達對山羊成肌細胞增殖的影響。結果表明，BCL2L11在背最長肌組織中高表達；miR-665和 BCL2L11在9月齡和1月齡山羊背最長肌組織中表達情況存在差異，miR-665在1月齡的表達量高于9月齡，而BCL2L11則相反，兩者存在負調控現象；通過雙熒光素酶報告分析顯示，當轉染過表達miR-665 mimic后，顯著抑制了BCL2L11熒光素酶的活性，同時靶基因BCL2L11 的mRNA表達水平也明顯降低。為進一步驗證miR-665的功能，轉染miR-665 mimic后發現細胞凋亡標志基因XIAP與Fas的表達量也顯著降低；EdU試驗分析顯示，過表達miR-665后促進了成肌細胞的增殖。綜上所述，在山羊背最長肌組織中miR-665作為BCL2L11的調控元件，能夠顯著抑制山羊成肌細胞中BCL2L11的表達水平，當miR-665過表達后，能夠促進成肌細胞的增殖情況。

關鍵詞：

miR-665；BCL2L11；肌肉；武安山羊；成肌細胞

中圖分類號：

S827.2 """"文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0582-09

收稿日期：2024-08-09

基金項目：天津市科技計劃項目（23YFZCSN00170；23ZYCGSN00090）；天津市自然科學基金（23JCYBJC00260）；天津市農業科學院種業創新項目（2024ZYCX012）

作者簡介：馮 婧（1986-），女，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，主要從事營養與繁殖調控研究，E-mail：fengjing_2024@126.com

*通信作者：張金龍，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： jlzhang1010@163.com

miR-665 Targeting BCL2L11 Regulates the Myoblasts Proliferation of Wu’an Goat

FENG" Jing1，2，3， SHENG" Hui1，2，3， ZHANG" Xiaosheng1，2，3， GUO" Xiaofei1，2，3 ， YAO" Dawei1，2，3， LI" Yupeng1，2，3， CHEN" Longbin 1，2，3， ZHANG" Jinlong1，2，3*

（1.Institute of Animal Science and Veterinary， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300381，" China;

2.Tianjin Key Laboratory of Animal Molecular Breeding and Biotechnology， Tianjin 300381，" China;

3.Tianjin Engineering Research Center of Animal Healthy Farming， Tianjin 300381，" China）

Abstract：

This study aimed to use molecular biological methods to explore the effect of miR-665 targeting BCL2L11 on the myoblasts proliferation of goat. Three healthy male Wu’an goats aged 1 month and 9 months each， with similar body weights and feeding environments for each age group was selected.The expression of BCL2L11 and miRNA-665 in the longest dorsal muscle tissue of Wu′an goats at different ages was detected using RT-qPCR; The expression of BCL2L11 in different tissue of Wu′an goats was also detected by RT-qPCR; Wild-type and mutant vectors of BCL2L11 3′UTR， as well as miR-665 mimics and control groups， were constructed and cotransfected into HEK293T cells. The targeting relationship between miR-665 and BCL2L11 was identified using a dual luciferase reporter gene detection system. The goat myoblasts were transfected with miR-665 mimic and negative control， and the expression levels of apoptosis markers factors XIAP and Fas were detected by RT-qPCR， and the effect of miR-665 overexpression on the proliferation of goat myoblasts was analyzed by EdU test simultaneously. The results showed that BCL2L11 was highly expressed in the longissimus dorsi muscle tissue; There were differences in the expression of miR-665 and BCL2L11 in the longissimus dorsi muscle tissue of goats aged 9-months and 1-months， and the expression of miR-665 at 1-month was higher than that at 9-month，while the expression of BCL2L11 was opposite，and the two were negative regulated;The dual luciferase report analysis showed that， after transfecting overexpressed miR-665 mimic， the luciferase activity of BCL2L11 was significantly inhibited， and the mRNA expression level of the target gene BCL2L11 was also significantly reduced. In order to further verify the function of miR-665， the expression of apoptosis marker genes XIAP and Fas was also significantly reduced after transfection of miR-665 mimic; EdU test analysis showed that the proliferation of myoblasts increased significantly after overexpression of miR-665. To sum up，miR-665 as a regulatory element of BCL2L11 in goat longissimus dorsi muscle tissue， could significantly inhibit the expression level of BCL2L11 in goat myoblasts，when miR-665 was overexpressed， it could promote the proliferation of myoblasts.

Key words：

miR-665; BCL2L11; muscle; Wu’an goat; myoblast

*Corresponding author： ZHANG Jinlong， E-mail： jlzhang1010@163.com

山羊是人類最早馴化的家畜之一，在10 000多年前的新石器時期已存在馴養山羊的歷史［1］。在漫長的馴化和選育過程中，山羊表現出了較好的肉質特性。因此，為了滿足消費者對羊肉日益增長的需求，經過長久以來的人工選育和改良，培育出了多個山羊品種［2］。在中國北方地區已培育出幾個優良品種，并表現出良好的遺傳穩定性，如武安山羊［3］。

microRNA（miRNA）是一類較小的非編碼RNA，在基因表達的轉錄后調控中發揮重要的作用，通過與靶基因mRNA的3′UTR區結合以促進mRNA的降解或抑制翻譯，從而進一步發揮生物學功能［4］。研究發現，miRNA不僅通過經典的RNA干擾機制調控基因表達，還可以通過與多種功能蛋白相結合來直接調控蛋白質的功能［5，6］。miRNA的非經典作用機制，包括miRNA前體可編碼多肽、miRNA與其他功能蛋白相結合、miRNA直接激活TLR受體蛋白、miRNA提高蛋白表達水平等，在發揮抑制劑作用的同時，也能夠在翻譯的過程中起到上調靶向mRNA表達的作用［7］。因此，miRNA作為分子調控元件參與調節各種生物學功能，如細胞生長、增殖、凋亡及分化［8-10］。大量研究表明，miRNA對生物體重要組織器官的生長發育起到至關重要的調節作用，比如參與肌肉發育調控［11］，治療肌肉損傷修復［12］。研究證明，miRNA在衰老和病理過程中多個水平上調控肌肉的穩態，通過控制肌肉發生、肌肉生長（肥大）和萎縮以及肌肉與其他組織的相互作用來實現［13］。另有研究發現，miR-665在不同細胞中有著促增殖、抑制凋亡的作用［14］。這些研究強調了miRNA介導并調控肌肉發育過程的重要性，因此探究新的能夠影響肌肉發育的miRNA則成為值得關注的焦點。

BCL2L11是BCL2家族的成員，位于線粒體的外膜中，是介導興奮性細胞凋亡、凋亡誘導因子易位和線粒體去極化的重要調節因子［15］。研究表明，BCL2L11具有調控山羊顆粒細胞凋亡的作用［16］。細胞凋亡是由半胱天冬酶激活并介導的一種細胞程序性死亡過程。細胞凋亡可以通過線粒體依賴性途徑由BCL2家族蛋白調節，抗凋亡的BCL2成員具有多個結構域，此外BCL2家族的促凋亡成員，包括BCL2L11，是僅含BH3結構域的蛋白［17］。盡管BCL2L11在很多生物過程中的作用已報道，但BCL2L11在山羊肌肉組織中的表達情況尚未見報道。

本研究旨在探究過表達或干擾miR-665對武安山羊成肌細胞增殖的影響，利用軟件預測到miR-665與其靶基因BCL2L11的結合位點，為闡明miR-665在武安山羊成肌細胞中的遺傳調控機制，解釋miR-665對于BCL2L11基因的抑制作用，從而為探究其影響成肌細胞增殖的分子機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用武安山羊均飼養于天津市農業科學院畜牧獸醫研究所試驗羊場，考慮1月齡的山羊處于快速生長階段，9月齡的山羊已經接近成熟，其肌肉組成和功能可能已經穩定，兩者的對比選擇對肌肉發展和生理變化研究較為典型或有意義，故隨機選擇1月齡和9月齡山羊各3只，共6只，所有試驗羊飼養環境相同。屠宰后，取其心、肝、脾、肺、腎、背最長肌組織，取樣后迅速裝入2 mL RNase-Free凍存管中，迅速放入液氮，移至實驗室-80 ℃冰箱儲存。山羊成肌細胞在實驗室中分離并保存于液氮中，HEK293T細胞購自北京綠源博德公司，保存于液氮中。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養基、Opti-MEM培養基、胰蛋白酶-EDTA （0.25%）、FBS均購自Gibco公司（美國）；青霉素-鏈霉素-新霉素 （PSN） 抗生素混合物購自賽默飛公司（中國）；反轉錄及定量試劑盒購自TaKaRa公司（日本）；200目、400目細胞篩購自索萊寶公司（中國）；EdU試劑盒購自碧云天公司（中國）；雙熒光素酶活性測定試劑盒購自Promega（美國）；Trizol、Lipofectamine2000均購自Invitrogen（美國）；miRNA定量引物、mimic及mimics NC由廣州銳博生物科技有限公司（中國）合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 成肌細胞分離及培養

從屠宰場收集不同月齡山羊背最長肌組織，將組織用75%酒精沖洗和消毒后，置于裝有PBS+2%三抗的凍存管中，送至細胞間。取出組織放到無菌培養皿中，用PBS+2%三抗清洗3次，剪去多余結締組織，再次清洗后晾干。在含EDTA的胰蛋白酶中將組織剪碎，放到冰箱4 ℃過夜。次日放于37 ℃培養箱消化1 h，加FBS停止消化，用移液槍反復吹打直至組織塊消失。所得液體先過400目細胞篩，濾液再過200目細胞篩，得到含有肌細胞的濾液。1 500 r·min-1離心5 min，收集細胞沉淀，加入配置好的細胞培養基以2×105個·孔-1的密度鋪到培養皿中，在37 ℃ 5% CO2培養箱中，飽和濕度培養。

1.3.2 總RNA提取及cDNA合成

在組織或細胞中加入1 mL Trizol裂解液，冰上靜置5～10min。加入1/5體積的氯仿，振蕩混勻后靜置3 min，1 200 0 ×g 4 ℃離心15 min。將所得最上層水相轉移到新管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min。再次離心10 min，去上清。所得沉淀中加入75%冰乙醇洗滌，7 500 ×g 4 ℃離心5 min，洗滌兩次。待沉淀徹底干燥后，加入30 μL RNase-Free ddH2O溶解沉淀。用分光光度計檢測RNA濃度與純度。檢測合格的RNA用于反轉錄，總體系為20 μL：1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ+1.0 μL Oligo dT Primer+1.0 μL Random 6 mers+4.0 μL 5×PrimeScript Buffer+1.0 μg RNA原液，用RNase-Free ddH2O補足至20 μL。反轉錄程序：37℃ 15 min，85℃ 5 s。所得cDNA保存在-20℃冰箱中。

1.3.3 引物設計

查詢NCBI上山羊的BCL2L11、XIAP、FAS、RPL-19基因CDS區序列，利用Premier 5軟件設計引物序列，序列提交至生工生物工程（上海）股份有限公司合成，miR-665及U6引物由廣州銳博生物科技有限公司（中國）合成。利用Premier 5軟件設計引物序列（表1）。

1.3.4 細胞轉染

收集細胞沉淀，將6孔板中加入適量的細胞懸液，培養基補足至2 mL，待次日細胞密度長至80%～90%后進行轉染。去除原培養基，用PBS清洗一遍，加入1.5 mL提前37 ℃預熱的OPTI-MEM。將4 μg的DNA用250 μL預熱的OPTI-MEM稀釋，作為轉染試劑A。將Lipofecta mine 2000試劑用250 μL預熱的OPTI-MEM稀釋，作為轉染試劑B。將配好的A液加入到等體積的B液中，輕輕攪動混勻，室溫靜置25 min。將AB混合液加入到每個孔中，每孔各加500 μL。輕搖混勻后，將6孔板放入37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中培養6 h后，去除轉染試劑，更換為原完全培養基，繼續培養24～48 h后收集細胞待后續試驗使用。

1.3.5 RT-qPCR檢測

將cDNA通過TB GreenPremix Ex TaqTMII試劑盒進行定量試驗。總體系為20 μL：10 μL 2×Tap PCR Mix+上游引物和下游引物各0.8 μL+2 μL cDNA模板+6.4 μL ddH2O。RT-qPCR程序如下：預變性為95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，40個循環。分別以U6和RPL19作為內參，通過2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.3.6 雙熒光素酶報告測定

通過Targetscan發現BCL2L11的3′UTR 存在miR-665結合位點。將BCL2L11 3′UTR的野生型（WT）和突變型（MT）片段分別重組到pcDNA3.1載體（Promega，WI，USA）中。miR-665序列插入psi-CHECK2載體中分別合成miR-665 mimics和mimics NC質粒。隨后將wt和mt質粒共轉染到具有陰性對照和miR-665模擬物的HEK293T細胞中。轉染48h后，裂解細胞，用雙熒光素酶報告分析系統（Promega，麥迪遜，威斯康星州，美國）定量檢測熒光素酶活性。結果見圖1。

1.3.7 EdU檢測

將成肌細胞接種在12孔板中，密度為5×104個·孔-1，培養24 h，用模擬物轉染48 h后向每個孔中加入10 μmol·L-1的EdU，將細胞再孵育2 h，用3.7%甲醛固定，然后孵育15 min，并在室溫下用0.5%Triton X-100在PBS中滲透20 min。用PBS洗滌3次，將Click-iT反應混合物加入每個孔中，然后將細胞孵育30 min，用DAPI室溫避光染色30 min。使用熒光顯微鏡拍照觀察。

1.3.8 數據分析

使用 SPSS 17.0進行統計分析。使用單因素方差分析評估兩組之間的差異。數據以“均值±標準誤”來表示。Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 武安山羊BCL2L11組織表達譜分析

使用實時定量PCR檢測BCL2L11基因在武安山羊9月齡不同組織中的表達情況，由圖2可知，BCL2L11在武安山羊心、肝、脾、肺、腎、背最長肌組織中均表達，其中在背最長肌組織中表達量最高。

2.2 miR-665和BCL2L11在武安山羊背最長肌組織中表達

通過對9月齡和1月齡武安山羊背最長肌組織中miR-665和BCL2L11基因定量后，如圖3所示，BCL2L11在9月齡武安山羊背最長肌組織中表達量顯著高于1月齡（P＜0.05），而miR-665表達量則是在1月齡中最高（P＜0.01）。結果顯示，BCL2L11與miR-665表達負相關，預測兩者之間存在潛在的靶向關系，初步推測BCL2L11是miR-665的靶基因之一，并且與不同月齡山羊肌肉發育相關。

2.3 miR-665與BCL2L11靶向關系驗證

為了進一步研究miR-665與BCL2L11靶向性關系，通過Targetscan網站預測了miR-665在BCL2L11的結合位點，發現BCL2L11的3′UTR區存在一個miR-665的結合位點，隨后將覆蓋BCL2L11基因3′UTR區域作為模板設計引物，進行PCR擴增。然后構建了野生型重組質粒pcDNA3.1-BCL2L11-WT和突變型重組質粒pcDNA3.1-BCL2L11-MT。試驗分為4組，分別是I組（pcDNA3.1-BCL2L11-WT、miR-665 mimic）；II組（pcDNA3.1-BCL2L11-WT、mimic NC）；III組（pcDNA3.1-BCL2L11-MT、miR-665 mimic）；IV組（pcDNA3.1-BCL2L11-MT、mimic NC），共轉染到HEK293T細胞。由圖4可知，當過表達miR-665后，野生型質粒的熒光活性顯著降低（P＜0.01），而突變型質粒沒有顯著作用（P＞0.05）。結果表明miR-665可與BCL2L11 3′UTR區結合。

2.4 過表達miR-665對BCL2L11表達的影響

為了確定miR-665能否作為調控BCL2L11表達的調控元件，通過轉染miR-665 mimic和mimic NC，培養48h，提取細胞的總RNA，反轉錄后定量檢測BCL2L11的表達情況。如圖5所示，與對照組相比，過表達miR-665后，BCL2L11 mRNA的表達量顯著降低（P＜0.05），表明miR-665與BCL2L11之間存在靶向性關系，能夠降低BCL2L11的表達。

2.5 過表達miR-665對細胞凋亡因子XIAP和Fas表達的影響

為了確定綿羊miR-665是否通過調控BCL2L11表達影響成肌細胞增殖，使用miR-665 mimic和mimic NC轉染到山羊成肌細胞中，轉染48h后，提取細胞總RNA，通過定量檢測細胞凋亡標志因子XIAP和Fas的mRNA表達情況。如圖6所示，轉染miR-665 mimics后，XIAP和Fas的mRNA表達量顯著降低（P＜0.05）。圖7的EdU分析顯示，過表達miR-665后顯著促進成肌細胞的增殖。

3 討 論

細胞凋亡是程序性細胞死亡的一種形式，首先接受來自內部和外部的死亡信號并作出反應，再進入死亡程序，如核固縮、細胞皺縮、細胞膜起泡和DNA片段化等［17，18］。肌肉作為主要的耗能組織之一，是代謝系統的重要組成部分。在哺乳動物中，miRNA已被證明可以調節肌肉生物學的各個方面，從發育到損傷修復，再到肌肉病理等方面［19-21］。有研究者發現，在人原代成肌細胞的體外分化過程中發現60個miRNA差異表達，其中43個上調，17個下調［22］。小鼠中發現，在股四頭肌的miRNA表達譜中鑒定出353個miRNA的表達［23］。這些研究結果表明miRNA在肌肉發育過程中有著重要的作用。最早檢測肌肉表達的miRNA的研究之一，確定了3種肌肉特異性miRNA，分別是miR-1、miR-133和miR-206，它們在人和鼠肌母細胞分化過程中發揮作用［24］。在探究miR-1對肌管細胞衰老影響的研究中發現，miR-1上調可以促進細胞衰老，而miR-1下調則抑制細胞衰老［25］。另有研究發現，綿羊過度肌肉生長是由于肌肉生長抑制素的3′UTR結合了miR-1和miR-206所引起的［26］。有人提出，這些miRNA通過誘導與慢肌纖維形成相關的基因表達和抑制與快速肌纖維形成有關的基因表達來參與肌纖維編程［27］，并與肌肉發育和肌內脂肪沉積有密切相關［28］。

BCL2L11作為重要的細胞凋亡調節劑，通過激活凋亡蛋白（BAX）和抗凋亡蛋白（BCL-2）的方式誘導細胞凋亡，本研究利用分子生物學方法探究miR-665靶向調控BCL2L11對山羊成肌細胞增殖的影響。在正常生理下條件，BCL2L11被動力蛋白輕鏈1隔離形成微管上的復合物，BCL2L11釋放磷酸化后刺激凋亡發生。BCL2L11促進許多腫瘤細胞類型的凋亡，通過miRNA-30c-5p/Bcl2樣蛋白11信號軸抑制細胞活力并誘導細胞凋亡［29］。另有研究發現，當增加BCL2L11蛋白表達可以導致肺動脈平滑肌細胞凋亡［30］。因此本試驗旨在研究BCL2L11是否為miR-665靶標，對山羊背最長肌組織表達情況產生影響。基于課題組前期的全轉錄組測序分析數據，分析篩選到武安山羊背最長肌組織中的差異表達基因BCL2L11以及其調控元件miR-665，通過RT-qPCR分析BCL2L11在武安山羊不同組織中的表達情況；又利用RT-qPCR檢測了不同月齡武安山羊背最長肌組織中BCL2L11和miRNA-665的表達；構建了BCL2L11 3′UTR野生型和突變型載體，以及miR-665 mimics和對照組，將其共轉染到HEK293T細胞，通過使用雙熒光素酶報告基因檢測系統鑒定了miR-665與BCL2L11存在靶向性關系。試驗收集了山羊成肌細胞，在細胞中轉染miR-665 mimic及陰性對照，利用RT-qPCR檢測了細胞凋亡標志因子XIAP和Fas表達水平，同時利用EdU試驗分析miR-665過表達對山羊成肌細胞增殖的影響。結果表明，miR-665和 BCL2L11在9月齡和1月齡山羊背最長肌組織中相對表達量存在差異，BCL2L11在9月齡背最長肌組織中表達量顯著高于1月齡，而miR-665在1月齡的表達量極顯著高于9月齡，兩者存在負調控現象。楊麗麗等［31］的研究結果表明，隆林山羊背最長肌在1月齡和10月齡時存在差異表達的環狀RNA，這些環狀RNA可能參與肌肉發育的調節，這與本試驗結果miR-665在9月齡極顯著增高較一致。通過雙熒光素酶報告分析顯示，當轉染過表達miR-665 mimic后，顯著抑制了BCL2L11熒光素酶的活性，同時靶基因BCL2L11 的mRNA表達水平也明顯降低。為進一步驗證miR-665的功能，轉染miR-665 mimic后發現細胞凋亡標志基因XIAP與Fas的表達量也顯著降低；EdU試驗分析顯示，過表達miR-665后成肌細胞的增殖明顯增多。

總之，本研究確定了miR-665作為BCL2L11的調控元件，可以抑制靶基因BCL2L11所引起的成肌細胞凋亡。在山羊背最長肌組織中miR-665作為BCL2L11的調控元件，能夠顯著抑制山羊成肌細胞中BCL2L11的表達水平，當miR-665過表達后，能夠促進成肌細胞的增殖。

4 結 論

研究發現，miR-665靶向調控BCL2L11表達對山羊成肌細胞增殖有顯著促進作用。當過表達miR-665能夠顯著抑制BCL2L11表達，進而抑制細胞的凋亡，為探究BCL2L11在山羊成肌細胞中的調控機制奠定了理論基礎。

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（編輯 郭云雁）