基于轉錄組測序篩選肉雞腹水綜合征相關候選基因

摘 要：

旨在從心和肺組織中篩選介導肉雞腹水綜合征發生的關鍵候選基因與通路。本研究以33日齡快速型白羽肉雞父系為素材，選取患腹水綜合征公雞5只，正常公雞3只，通過剖檢與血液生化指標測定確定腹水綜合征公雞發病情況，分為腹水組與正常組，腹水組5只公雞，正常組3只公雞。對腹水組與正常組進行血液生化指標測定與比較分析，解剖取左心室心肌組織制作HE切片，取心、肺組織樣品進行轉錄組測序。血液生化結果顯示腹水組紅細胞壓積（HCT）、血紅蛋白（HGB）和粒細胞百分比（GRA）非常顯著高于正常組（P＜0.01）。腹水組淋巴細胞百分比（LYM）非常顯著低于正常組（P＜0.01）。腹水組二氧化碳分壓（PCO2）、總鈣（Ca）含量非常顯著高于正常組（P＜0.01），腹水組剩余堿（Beb）含量顯著低于正常組（P＜0.05）。HE切片結果顯示，正常組心肌組織肌原纖維排列整齊，細胞間未見血細胞沉積；腹水組心肌細胞中肌原纖維結構紊亂，大量血細胞沉積在肌原纖維之間。轉錄組分析篩選到肺組織差異表達基因969個，包括417個上調基因和552個下調基因，心組織差異表達基因809個，包括397個上調基因和412個下調基因。通路富集顯著富集到了細胞周期（mitotic cell cycle）、著絲粒復合物組裝（centromere complex assembly）、氧氣結合（oxygen binding）、神經活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、細胞黏附分子（cell adhesion molecules）、細胞衰老（cellular senescence）、細胞外基質-受體相互作用（ECM-receptor interaction），運動蛋白（motor proteins）。從富集通路中篩選與肉雞腹水綜合征相關的基因進行實時熒光定量PCR驗證，結果KIF20A、NUSAP1、HBAD、TFRC、HBBA基因在腹水組和正常組間差異表達趨勢與轉錄組測序結果一致，可作為肉雞腹水綜合征重要候選基因。本研究利用轉錄組技術篩選到與肉雞腹水綜合征的發生相關的重要通路和候選基因，對研究肉雞腹水綜合征的發病機制和預防具有十分重要的意義。

關鍵詞：

肉雞；腹水綜合征；轉錄組；差異表達基因

中圖分類號：

S831.2"""" 文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0559-12

收稿日期：2024-09-02

基金項目：農業生物育種國家科技重大專項（2023ZD0405302）

作者簡介：蘇 蒙（1999-），女，滿族，河北承德人，碩士，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail： sm18310082450@163.com

*通信作者：李慶賀，主要從事家禽功能基因組和育種研究，E-mail：liqonghe@caas.cn

Identification of Candidate Genes Associated with Ascites Syndrome in Broilers Based on Transcriptome Sequencing

SU" Meng， LIU" Sha， SONG" Danli， GAO" Qianmei， ZHENG" Maiqing，"" WEN" Jie， ZHAO" Guiping， LI" Qinghe*

（Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract：

This study aimed to identify key candidate genes and pathways in cardiac and pulmonary tissues that mediate the development of ascites syndrome in broiler chickens.Taking the sires of fast-growing white-feathered broilers at 33 days of age as the research materials， 5 roosters with ascites syndrome and 3 normal roosters were selected. The occurrence of ascites syndrome in the roosters was determined through necropsy and the measurement of blood biochemical indicators. The subjects were categorized into an ascites group （5 roosters） and a control group （3 roosters）.The results of blood biochemical analysis indicated that hematocrit （HCT）， hemoglobin （HGB）， and granulocyte percentage （GRA） in the ascites group were significantly higher than those in the normal group （Plt;0.01）.The lymphocyte percentage （LYM） in the ascites group was significantly lower than that in the normal group （Plt;0.01）.Additionally， the partial pressure of carbon dioxide （PCO2） and total calcium （Ca） levels were significantly elevated in the ascites group compared to the normal group （Plt;0.01）， while the base excess （Beb） content was significantly lower in the ascites group （Plt;0.05）.The results of HE staining showed that in the normal group， the myofibrils in the myocardial tissue were arranged neatly，with no evidence of blood cell deposition between cells. In the ascites group， myocardial fibers exhibited structural disarray，and a large number of blood cells were deposited between the myofibrils. Transcriptome analysis identified 969 differentially expressed genes （DEGs） in lung tissue， including 417 upregulated genes and 552 downregulated genes. In cardiac tissue， 809 DEGs were identified， comprising 397 upregulated genes and 412 downregulated genes. Pathway enrichment analysis revealed significant enrichment in processes such as the mitotic cell cycle， centromere complex assembly， oxygen binding， neuroactive ligand-receptor interaction， cell adhesion molecules， cellular senescence， extracellular matrix （ECM）-receptor interaction， and motor proteins. Genes associated with ascites syndrome in broiler chickens were selected from enriched pathways and validated using real-time quantitative PCR. The results showed that the expression trends of KIF20A， NUSAP1， HBAD， TFRC， and HBBA genes differed between the ascites and normal groups， consistent with transcriptome sequencing findings，and these genes could be regarded as important candidate genes for ascites syndrome in broilers.The study， utilizing transcriptome technology， has identified significant pathways and candidate genes related to the development of ascites syndrome in broiler chickens， providing important insights into the disease mechanism and prevention strategies.

Key words：

broiler; ascites syndrome; transcriptome; differentially expressed genes

*Corresponding author： LI Qinghe， E-mail：liqonghe@caas.cn

在畜禽養殖業中，肉雞作為一種重要的經濟動物，其健康狀況直接關系到養殖業的效益與可持續發展。然而，隨著養殖規模的擴大和集約化程度的提高，肉雞疾病問題日益凸顯，其中肉雞腹水綜合征（ascites syndrome， AS）作為一種常見的營養代謝性疾病，給養殖業帶來了嚴重的經濟損失。據相關文獻報道，該病癥在肉雞群中的發病率可達5%至20%［1］。肉雞腹水綜合征醫學上也稱肉雞肺動脈高壓綜合征（pulmonary hypertension syndrome，PHS），在缺氧狀態下，肉雞肺部血管發生收縮，肺動脈阻力顯著增加，進而誘發肺動脈高壓。長期的高壓負荷導致右心室代償性肥大，心功能逐漸衰竭，最終引發腹腔內大量積液的形成［2］。其核心病理特征表現為右心室肥大、肺動脈高壓以及顯著的腹腔積液［3］。

肉雞腹水綜合征的發病機制與心肺功能障礙密切相關。AS的發生伴隨著心肺組織結構的改變。Guo等［4］通過比較正常雞與腹水雞肺組織HE切片發現，腹水雞肺組織呼吸道毛細血管萎縮，肺部充血水腫。Li等［5］比較正常雞與腹水雞心組織HE切片發現，腹水雞肌原纖維紊亂、血細胞沉積在肌原纖維之間的血管中。

血液生化指標是AS機體健康狀況的主要指標，也是疾病診斷和檢測的指標之一［6］。有研究通過對比腹水雞與正常雞血液血常規指標發現紅細胞數、血紅蛋白數、淋巴蛋白數存在顯著差異［4］。Van As等［7］通過建立預測模型比較腹水雞與正常雞血液生化指標提出，雞靜脈血二氧化碳分壓和pH是診斷雞腹水綜合征的病理學關鍵指標。

在AS的發病機制中，遺傳因素是很重要的一點。研究發現，在相同飼養條件下，不同肉雞品種的腹水綜合征發病率不同［8］。例如，快速生長型肉雞品種由于其對高能量、高蛋白飼料的強烈需求以及快速增重的生理特點，更容易出現心肺功能負擔過重，從而誘發腹水綜合征。

隨著高通量測序技術的飛速發展，轉錄組測序（RNA-seq）已成為解析復雜疾病基因表達模式的重要工具［9］。在AS肉雞的研究中，RNA-seq技術展現出了其獨特的優勢。通過深度測序和生物信息學分析，研究人員能夠系統地比較正常肉雞與腹水綜合征肉雞之間的基因表達差異，從而揭示疾病發生發展的分子機制。這一過程中，差異表達基因（DEGs）的篩選是核心環節。Liu等［10］利用RNA-seq技術深入分析了腹水綜合征肉雞肺動脈的轉錄組變化，結果顯示Ribosome、Translation等通路的顯著富集，為理解腹水綜合征的病理生理過程提供了新的視角。這一發現不僅深化了人們對本病分子基礎的認識，也為后續的功能驗證和干預策略設計奠定了基礎。目前為止，已經對AS進行了幾項研究，包括肝組織［11］、心組織［12-13］和脈管系統［14］。然而，對AS肉雞心、肺組織轉錄組聯合分析的研究尚未見報道。

綜上，本研究利用高通量測序技術，在轉錄組水平上全面研究了AS肉雞心、肺組織的變化，篩選了AS發生發展過程中心、肺組織中的重要通路和候選基因，對研究AS的發病機制和預防具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣本采集

試驗動物選取白羽肉雞父系種雞，試驗期間所有雞單籠飼養，自由采食飲水。在33日齡選取腹水雞5只，正常雞3只進行靜脈血采集，每只雞采集2 mL靜脈血置于抗凝采血管、2 mL靜脈血置于肝素鈉采血管中，使用TEK-II全自動動物血液分析儀進行血常規檢測，對腹水雞與正常雞紅細胞壓積（HCT）、血紅蛋白（HGB）、粒細胞百分比（GRA）、淋巴細胞百分比（LYM）進行比較。西門子RAPID POINT 500血氧檢測儀進行血氧水平檢測，對腹水雞與正常雞二氧化碳分壓（PCO2）、總鈣（Ca）、剩余堿（Beb）含量進行比較。隨后進行屠宰，屠宰后，所有雞均選取左心室組織樣品、左肺下葉組織樣品于液氮中速凍并儲存于-80 ℃冰箱。

1.2 組織切片制作與數據采集

選取5只腹水雞、3只正常雞的右心室樣本用4%多聚甲醛固定24 h，通過脫水、透明、浸蠟和包埋一系列處理后，于切片機切成4 μm厚薄片，進一步黏片和脫蠟后于蘇木精水溶液中染色3～8 min，伊紅染液中染色1～3 min。隨后進行脫水和透明處理，最終用中性樹膠固定后置于正置光學顯微鏡下進行圖片采集。

1.3 轉錄組測序與數據處理

使用氯仿法提取樣本的總RNA，通過Nano DropND-2000（Agilent）對總RNA的純度及濃度進行檢測。將合格的RNA樣品進行cDNA文庫的構建，并在Illumina平臺上進行測序。利用SeqPrep［15］軟件對rawreads進行質控，HISAT2軟件將質控后的cleanreads比對到雞（Gallus gallus）的參考基因組上，StringTie軟件進行轉錄本組裝，subread軟件中的featureCounts工具進行表達定量，獲得原始基因表達量數據。

1.4 差異表達基因分析和KEGG與GO富集分析

用DESeq2軟件對原始測序數據進行分析，基于差異倍數（Fold Change）≥1.5且P-value≤0.05為標準篩選差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）。腹水組與正常組基因表達水平的差異以及差異的統計學顯著性通過火山圖顯示，對符合標準的基因通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）進行GO功能注釋（包括分子功能、生物學過程和細胞組分），通過KOBAS（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）進行通路富集分析。以P＜0.05為標準篩選顯著富集通路。

1.5 實時熒光定量PCR驗證

cDNA反轉錄參照FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑試劑盒（天根，北京）操作說明，反轉錄產物于-20 ℃凍存備用，RT-qPCR以β-actin為內參基因，根據NCBI GenBank中雞KIF20A、NUSAP1、HBAD、TFRC、HBBA基因和β-actin基因序列設計引物（表1）。擴增體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix（Vazyme）10.0 μＬ，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol·L-1），cDNA模板2.0 μL，7.2 μL水補足20 μL體系。擴增程序：95 ℃ 30s；95 ℃ 10s；60 ℃ 30s，40個循環。采用7500型熒光定量PCR儀（ABI，美國）對5個候選基因和β-actin進行分析，每個樣品設置3個技術重復。基因的相對表達量采用2-ΔΔCT法計算。

2 結 果

2.1 不同分組血液生化比較分析

血液生化分析結果如圖1所示，血常規結果顯示，t檢驗分析表明，腹水組紅細胞壓積（HCT）、血紅蛋白（HGB）和粒細胞百分比（GRA）非常顯著高于正常組（P＜0.01）。腹水組淋巴細胞百分比（LYM）非常顯著低于正常組（P＜0.01）。雞患AS后血常規會發生紅細胞數量增多、血紅蛋白水平上升、粒細胞百分比上升、淋巴細胞百分比下降等異常變化。

血氧檢測結果顯示，腹水組二氧化碳分壓（PCO2）、總鈣（Ca）含量非常顯著高于正常組（P＜0.01），腹水組剩余堿（Beb）含量顯著低于正常組（P＜0.05）。雞患AS后血氧水平會出現二氧化碳分壓增高、總鈣含量升高、剩余堿含量下降等異常變化。

2.2 不同分組心肌樣本組織學形態比較

對腹水組與正常組的心肌組織HE切片進行觀察（圖2），比較分析發現，正常組心肌組織肌原纖維排列整齊，細胞間未見血細胞沉積；腹水組心肌細胞中肌原纖維結構紊亂，大量血細胞沉積在肌原纖維之間。

2.3 不同組織差異表達基因分析

對腹水組與正常組的心、肺組織樣品進行轉錄組測序與比較分析，以（Fold Change）≥1.5，P-value≤0.05篩選肺組織差異表達基因，得到969個差異表達基因，包括417個上調基因和552個下調基因，篩選心組織差異表達基因，得到809個差異表達基因，包括397個上調基因和412個下調基因（圖3）。將心、肺組織差異表達基因進行聯合分析，篩選出心、肺組織共同差異表達基因159個（圖4）。

2.4 DEGs的KEGG通路分析

對心組織、肺組織篩選出的DEGs及心肺共同DEGs進行KEGG通路富集分析，結果顯示（圖5），肺組織篩選出的969個差異表達基因顯著富集到了神經活性配體-受體相互作用、運動蛋白、細胞黏附分子、p53信號通路、MAPK信號通路等與肺發育相關信號通路。心組織篩選出809個差異基因顯著富集到了細胞衰老、細胞黏附分子等與心發育相關信號通路。對心、肺組織159個共同差異表達基因進行KEGG功能富集分析，顯著富集到了細胞黏附分子、運動蛋白、細胞衰老等與心肺發育相關信號通路。

2.5 DEGs的GO功能注釋

對心、肺組織篩選出的DEGs及心、肺共同DEGs進行GO功能注釋，結果顯示，肺組織969個差異基因主要注釋到了細胞周期、氧氣結合等可能與腹水綜合征的發生相關的條目。心組織809個差異基因主要注釋到了氧氣結合、藥物結合等可能與腹水綜合征的發生相關的條目。對心、肺159個共同差異基因進行GO功能注釋，主要注釋到了氧輸送、細胞分裂、微管結合等可能與腹水綜合征的發生相關的條目（圖6）。

肺組織與心組織共同富集到了8個可能與腹水綜合征的發生相關的條目/通路（表2）。包括細胞周期、著絲粒復合物組裝、氧氣結合、神經活性配體-受體相互作用、細胞黏附分子、細胞衰老、細胞外基質-受體相互作用、運動蛋白。

2.6 肉雞腹水綜合征候選基因驗證

以腹水組與正常組肉雞樣本為素材，從富集通路中篩選與AS相關的KIF20A、NUSAP1、HBAD、TFRC、HBBA 5個基因進行熒光定量PCR驗證，結果如圖7所示。基因KIF20A、NUSAP1在腹水組個體中表達量顯著低于正常組個體，基因HBAD、TFRC、HBBA在腹水組個體中表達量顯著高于正常組個體。基因的表達趨勢與轉錄組測序數據一致。

3 討 論

有研究表明，缺氧是AS的主要病因，缺氧刺激心肺系統代償機制的形成，包括肺血管阻力增加［16］、氧自由基產生［17］、代謝重編程［18］，導致肺動脈高壓，進而導致AS的發生。呼吸系統和循環系統對肉雞的發育都很重要。心、肺、血管系統之間的任何循環的缺乏都會導致上述病理級聯反應，從而導致AS的發生。因此，心、肺是AS的主要靶器官。雖然人們對AS的病理進展進行了多年的研究，但其發生發展的分子機制尚未完全闡明。本研究采集腹水組與正常組心、肺組織樣品，利用高通量測序技術從轉錄組水平篩選與AS相關的候選基因。

為了在收集用于RNA-seq的樣品之前正確鑒定AS肉雞，本研究對腹水組與正常組進行一系列表型測定。血常規檢測發現，腹水組紅細胞壓積（HCT）、血紅蛋白（HGB）、粒細胞百分比（GRA）非常顯著高于正常組，腹水組淋巴細胞百分比（LYM）非常顯著低于正常組。紅細胞的多少及血紅蛋白含量的高低，反映了動物血液載氧能力的強弱。本試驗結果表明，在肉雞腹水形成的過程中，紅細胞壓積以及血紅蛋白都出現了不同程度的升高。有研究發現，肉雞機體的新陳代謝增強會引起耗氧量及產熱量的增加，進一步加劇機體的缺氧程度，引起血液攜氧量的增加，從而引起紅細胞壓積和血紅蛋白含量升高，加重心負擔，繼而形成腹水［19-20］。而機體缺氧還會導致炎癥因子表達上升，從而激活粒細胞的產生，抑制淋巴細胞的產生。血氧水平檢測發現，腹水組二氧化碳分壓（PCO2）、總鈣（Ca）含量非常顯著高于正常組，腹水組剩余堿（Beb）含量顯著低于正常組。產生這一變化可能是由于心肺缺血缺氧，從而導致機體二氧化碳積累，乳酸含量上升，血液pH含量下降。血液生化指標是反映機體健康狀況的主要指標，也是疾病診斷和檢測的指標之一［6］。綜上，本研究通過血液生化指標的測定進一步明確了腹水雞的發病情況。

腹水組與正常組肉雞心組織HE切片比較發現，腹水組心肌細胞中肌原纖維結構紊亂，大量血細胞沉積在肌原纖維之間。表明肉雞患AS時心肌組織會發生病變，證實了AS肉雞心組織中的病理變化。同時，解剖發現腹水組肉雞腹腔與心包內存在黃色積液，以上表型檢測均說明腹水組肉雞患病。

研究進一步對腹水組與正常組肉雞心、肺組織進行RNA-Seq分析，以確定可能的候選基因和信號通路在心、肺組織中的差異表達。在GO功能注釋和KEGG通路分析中，注釋到與AS的發生相關的信號通路8條，包括有絲分裂細胞周期（mitotic cell cycle）、著絲粒復合物組裝（centromere complex assembly）、氧氣結合（oxygen binding）、神經活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、細胞黏附分子（cell adhesion molecules）、細胞衰老（cellular senescence）、細胞外基質-受體相互作用（ECM-receptor interaction）和運動蛋白（motor proteins）。細胞黏附分子（CAMs）參與調節細胞分化、細胞周期、細胞遷移和細胞存活［21］，Tadzic等［22］試驗已證明，血壓升高與血清CAM濃度升高有關。神經活性配體-受體相互作用通路涉及神經系統中的神經活性配體和其對應受體之間的相互作用。研究表明人肺動脈高壓的發生和發展與細胞因子-細胞因子受體相互作用和神經活性配體-受體相互作用失調有關［23］。有研究發現，細胞外基質-受體相互作用細胞受體通過介導整合素等跨膜分子［24］，直接或間接調節細胞活動，如分化［25］、代謝［26］、遷移［27］、侵襲、增殖［28］和細胞凋亡。機體的正常生理活動需要維持ECM和細胞之間的平衡，任何不平衡都會導致各種病理反應。氧氣結合通路主要涉及氧氣的運輸和利用，腹水征的發生通常與低氧環境密切相關。在低氧條件下，雞的心肺系統會受到壓力，導致血液中氧含量不足，增加機體心的負擔，最終可能導致心衰竭和腹水的形成［29］。

運動蛋白利用化學能推動細胞內的各種生物過程，包括細胞內物質的運輸、細胞運動和細胞分裂等；細胞周期在生物體的發育、組織修復和細胞增殖中發揮關鍵作用；著絲粒復合物組裝通路異常會導致細胞增殖異常，進而影響心、肺組織發育；細胞衰老通常是對細胞損傷或應激的響應。運動蛋白、細胞周期、著絲粒復合物組裝和細胞衰老通路可能通過影響腹水雞心、肺組織發育過程從而影響機體循環系統的穩定工作，進而導致肉雞AS的發生。

對富集分析顯著差異通路中的基因進行RT-qPCR測定，KIF20A、NUSAP1在腹水組個體中表達量顯著低于正常組個體，基因HBAD、TFRC、HBBA在腹水組個體中表達量顯著高于正常組個體。

有研究通過轉錄組測序鑒定發現KIF20A是COVID-19心肌炎發生的關鍵基因，是COVID-19心肌炎未來研究的潛在生物標志物和治療靶點［30］。TFRC基因編碼一種細胞表面受體，該受體是通過受體介導的內吞作用攝取鐵所必需的，并且是紅細胞生成和神經發育所必需的。轉鐵蛋白受體基因位于9號染色體上，在一項研究中發現它與腹腔中的腹水積聚有關［31-32］。

很多研究都證明以上基因和腹水征有關，但本研究篩選出的NUSAP1、HBBA調控雞腹水征的機制尚不清楚，有待進一步的研究。有研究表明，HBAD是雞AS的關鍵候選基因［33］，由此推測屬于同一基因家族的HBBA可能同樣對雞AS有影響。NUSAP1可能影響肺腺癌的發生發展，研究推測其可能在肺腺癌的發展中充當癌癥正因子，是一種潛在的診斷和預后分子標志物［34］。因此這些基因也可能是影響AS的候選基因。

4 結 論

腹水雞會出現紅細胞數量增多、血紅蛋白水平上升、粒細胞百分比上升、淋巴細胞百分比下、二氧化碳分壓增高、總鈣含量升高、剩余堿含量下降等血常規及血氧指標異常變化；AS肉雞心肌組織會發生肌原纖維結構紊亂，同時血細胞大量沉積；研究利用RNA-Seq技術在肉雞心、肺組織中共鑒定到了1 778個顯著的DEGs。KEGG富集與GO注釋發現組織發育、氧氣結合、機體免疫可能影響AS的發生。候選基因KIF20A、NUSAP1、HBAD、TFRC、HBBA可作為AS候選基因用于后期深入功能驗證，為肉雞AS的研究提供理論基礎。

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（編輯 郭云雁）