民勤青土湖肉蓯蓉莖腐病病原菌的分離鑒定

摘 要 為明確甘肅民勤青土湖肉蓯蓉莖腐病病原菌種類，采用組織分離法，結合形態學特征與ITS分子方法對其進行分離鑒定。結果表明，從青土湖肉蓯蓉莖腐病中共分離出3種不同的病原菌，室內回接和田間發病癥狀基本一致，均表現出莖腐病典型癥狀，分別命名為RCRJF-1、RCRJF-2、RCRJF-3。在PSA培養基上觀察3個菌株的形態特征得知，RCRJF-1菌落圓形，淡紫色，白色氣生菌絲，背面產生淡紫色色素，大型分生孢子細長，鐮刀型，2～5隔，小型分生孢子長橢圓形，多無隔；RCRJF-2具有白色氣生菌絲，菌落淡粉色，菌落背面中心淡紫色，但在PSA培養基上不產孢，在PDA培養基上大型分生孢子2～3分隔，小型分生孢子0～1分隔，卵圓形或腎形，厚垣孢子球形，間生或串生；RCRJF-3具有棉絮狀氣生菌絲，表面玫瑰紅色、邊緣玫瑰紅色、中心部分黃棕色，菌落背面紫紅色，在PDA培養基上不產孢，在PSA培養基上大型分生孢子鐮刀型，多數3～5隔，小型分生孢子較少，成球棒狀。進一步ITS分子鑒定得知，RCRJF-1、RCRJF-2、RCRJF-3分別與層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）（登錄號MT560212）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（登錄號MT530243）、銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）（登錄號MH341217）具有較高的相似性，均為100%。結合形態學特征，確定引起甘肅民勤青土湖肉蓯蓉莖腐病的致病菌為層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum），分離頻率分別為52.38%、31.11%和16.51%，其中層出鐮刀菌（F. proliferatum）為優勢致病菌。

關鍵詞 肉蓯蓉；莖腐病；病原菌；分離；鑒定

肉蓯蓉（Cistanche deserticola Y. C. Ma）為寄生于荒漠、沙漠鹽生植物根部的寄生植物，寄主非常廣泛，包括梭梭、紅柳、鹽穗木、四翅濱藜、堿蓬等^［1］，它具有益精血、補腎壯陽、潤腸通便、抗衰老、促進代謝、調整內分泌和強筋骨等功效^［2］，素有“沙漠人參”之美譽，是中國傳統的名貴中藥材^［1］，2020年被列為藥食兩用物質，這為肉蓯蓉產業的發展提供了新的機遇，也對人工種植肉蓯蓉的品質有了更高要求，加之野生資源有限、市場需求量大，有利促進了肉蓯蓉人工種植產業的發展。

武威地處河西走廊東端，在防沙治沙造林過程中，以梭梭為主要的治沙造林樹種，這為改善當地生態環境、生態修復的同時也為發展林下經濟—梭梭接種肉蓯蓉提供了豐富的寄主資源，同時為沙區的資源利用創造了條件，實現自然資源與規模經濟的優勢互補，發展肉蓯蓉，可以把大量的閑置多年的荒漠土地利用起來，當地已開展了梭梭接種肉蓯蓉的示范種植，面積達到0.67余萬hm²，其勞動密集性的特征可有效帶動沙區群眾增加收入^［3］。然而，隨著種植面積的不斷增加，在肉蓯蓉種植基地肉蓯蓉莖腐病［學者將主要造成肉蓯蓉地下莖（其藥用部位）腐爛的病稱為肉蓯蓉莖腐病^［4］發病嚴重，嚴重制約了當地肉蓯蓉產業的發展。民勤青土湖作為武威市肉蓯蓉主產區之一，種植面積大，產量高，但莖腐病發病嚴重，一般地塊發病率為8%～12%，重者高達40%，嚴重制約了當地肉蓯蓉產業發展。有學者在寧夏地區分離到的肉蓯蓉莖腐病的主要病原菌為接骨木鐮刀菌 （Fusarium sambucinum）^［4］，但民勤青土湖肉蓯蓉莖腐病癥狀與寧夏地區肉蓯蓉莖腐病癥狀又有不同之處，如在民勤青土湖分離到的病原菌引起的癥狀除了具有寧夏分離到病原菌引起的癥狀外，還在發病時出現黑色斑點，嚴重時整體發黑，但堅硬不腐爛這一癥狀。

對于該地區肉蓯蓉莖腐病的病原菌還未見相關研究，且對該病害的防治以生物防治為主，研究其確切的病原菌，可為今后生物防治中拮抗菌的篩選提供理論依據。故本研究通過采集青土湖肉蓯蓉基地的莖腐病病斑，對其進行分離、致病性檢測，并結合形態學特征及分子生物學特征對其進行鑒定，確定該地區肉蓯蓉莖腐病病原菌種類，以期為今后肉蓯蓉莖腐病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 采樣

2020年4月至2022年4月從民勤縣青土湖肉蓯蓉種植基地不同地點采集60株發病植株（采集剛發病能分辨出病健交界處的植株）。

1.2 培養基

PDA固體培養基和PSA固體培養基。

1.3 病原菌分離與鑒定

將采集的60株發病植株進行表面消毒，在病健交界處選取1 cm小塊，置于PDA上25℃恒溫培養，每株3個重復，共180皿，觀察培養，5 d后挑取菌落邊緣菌絲體在PDA固體培養基上保存。分離菌用單孢分離法進行純化。同時按照菌落形態等特征將菌株分類^［5］，計算分離頻率^［6-7］。

1.4 致病性測定

將不同分類的菌株在PDA培養基上培養 7 d，挑選大小一致、健康的肉蓯蓉莖段，用清水沖洗干凈，然后用70%酒精進行表面消毒，再用無菌水反復沖洗后，備用。根據柯赫氏法則進行離體回接驗證，每個肉蓯蓉的莖段用滅菌刀片劃出3 cm×3 cm的十字交叉傷口，將培養7 d的病原菌制備直徑5 mm的菌塊放到傷口處，25℃條件下培養，觀察，設3次重復，PDA空白培養基做為對照，發病后再次分離。

1.5 病原菌鑒定

形態學鑒定：將經過PSA和PDA培養7～10 d的病原菌挑取菌絲，采用蓋玻片法^［8］觀察其形態特征，根據相關文獻^［9-10］進行鑒定。

分子生物學鑒定：采用CTAB法^［11］提取病原菌DNA、通用引物ITS1和ITS4^［12］進行PCR擴增。測序結果由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，在NCBI上進行比對，利用 MEGA11軟件的（Neighbor-Joining）構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 田間罹病肉蓯蓉病害癥狀

在甘肅省民勤縣青土湖肉蓯蓉種植基地調查發現，其發病癥狀包括：肉質莖生長受到阻礙等一系列癥狀與程齊來等^［4］發現的一致（圖1-A），或者有的初期出現棕黑或者黑色斑點，嚴重時整體發黑，但堅硬不腐爛（圖1-B和1-C），內部組織變為褐色（圖1-D），有的變為黑色（圖1-E）。

2.2 病原菌鑒定結果

2.2.1 病原菌的類型和形態特征 在民勤縣青土湖肉蓯蓉種植基地不同地點采集60株發病植株，共分離獲得315株純培養分離物。根據在培養基上的一些形態特征和分生孢子形態，這些分離物可分為3種類型（圖2）。

第一類的分離物（分離頻率為52.38%），在PSA培養基上菌落圓形，菌落為淡紫色，氣生菌絲白色（圖2-A），背面產生淡紫色色素（圖2-B），大型分生孢子細長，鐮刀型，2～5隔，大小為（10.31～28.44） μm×（1.47～4.5） μm，小型分生孢子長橢圓形，多無隔，大小為（2.56～6.32） μm×（1.21～3.09） μm（40×倍鏡下，下同），依據形態學特征，將該菌株初步鑒定為層出鐮刀菌。挑選典型菌株并命名為RCRJF-1（圖2-C和2-D）。

第二類的分離物（分離頻率為31.11%），在PSA培養基上氣生菌絲白色，菌落淡粉色（圖2-E），菌落背面中心淡紫色（圖2-F），在PSA培養基上不產孢，在PDA培養基上為大型分生孢子，2～3分隔，大小為（18.34～36.01） μm×（1.46～4.51） μm，小型分生孢子0～1分隔，卵圓形或腎形，大小為（4.51～9.76） μm×（1.32～3.35） μm，厚垣孢子球形，間生或串生，直徑為6.12～9.12 μm（圖2-G和2-H）。依據形態學特征，將該菌株初步鑒定為尖孢鐮刀菌。挑選典型菌株并命名為RCRJF-2。

第三類的分離物（分離頻率為16.51%），在PSA培養基上氣生菌絲棉絮狀，表面玫瑰紅色、邊緣玫瑰紅色、中心部分黃棕色（圖2-I），菌落背面紫紅色（圖2-J）；在PDA培養基上不產孢，在PSA培養基上大型分生孢子鐮刀型，多數3～5隔，大小為（13.56～24.87） μm×（2.19～3.89） μm；小型分生孢子成球棒狀、較少（圖2-K和2-L）。依據形態學特征將該菌株初步鑒定為銳頂鐮刀菌。挑選典型菌株并命名為RCRJF-2。

2.2.2 病原菌致病性測定 回接與再分離：對照（CK）沒有感病，層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）回接后肉蓯蓉組織發病率達到100%。各個肉蓯蓉組織上均長出白色絮狀致密菌絲，然后逐漸布滿整個組織的表面，切開后可看到內部組織褐變并逐漸變黑（圖3）。所測層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）菌株全部能引起發病，與采集的發病植株發病特征基本一致。取發病植株進行病原菌再分離，分離物與接種菌株的形態特征基本一致，根據柯赫氏法則^［13］，證明所接種的菌株均為致病菌。

2.2.3 病原菌的分子鑒定 用引物ITS1和ITS4分別對菌株RCRJF-1、RCRJF-2和RCRJF-3進行PCR擴增，將序列提交到GenBank，獲得RCRJF-1登錄號OQ744649、RCRJF-2登錄號OQ744657、RCRJF-3登錄號 OQ744678。同源性序列分析結果表明，RCRJF-1與層出鐮刀菌（F.proliferatum）（登錄號MT560212）的相似性為100%、RCRJF-2與尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）（登錄號MT530243）的相似性為100%，RCRJF-3與銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）（登錄號MH341217）的相似性為100%，系統發育樹顯示（圖4），RCRJF-1與層出鐮刀菌（F. proliferatum）聚為一個分支，支持率99%，RCRJF-2與尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）聚為一個分支，支持率99%，RCRJF-3與銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）聚為一個分支，支持率100%，結合形態特征與分子生物學鑒定結果，將RCRJF-1鑒定為層出鐮刀菌（F. proliferatum），RCRJF-2鑒定為尖孢鐮刀菌（F. oxysporum），RCRJF-3鑒定為銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）。

3 討 論

肉蓯蓉屬于藥食用同源物種，商品為有機產品，在生產過程中不使用任何農藥化肥，而莖腐病的發生嚴重影響了其產量和質量，為提高其生物防治成效，本研究對青土湖肉蓯蓉基地的肉蓯蓉莖腐病病原菌進行了分離鑒定，通過治病性測定、發病率調查，結合傳統培養及分子生物學方法從該地區肉蓯蓉莖腐病病斑中分離到3種病原菌，均屬于鐮刀菌屬，分別為層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum），其中主要致病菌為層出鐮刀菌（F. proliferatum），分離頻率為 52.38%；銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）的分離頻率最低，為16.51%。根據柯赫氏法則回接后，層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）都能引起肉蓯蓉典型癥狀，故為肉蓯蓉莖腐病病原菌，且優勢致病菌為層出鐮刀菌（F. proliferatum）。

鐮刀菌屬是農作物最主要的致病菌之一，嚴重影響農作物的生長和產量^［14］。無論在糧食作物、藥用植物、經濟作物及觀賞植物上都有鐮刀菌發生^［15］。層出鐮刀菌（F. proliferatum）可侵染多種植物，造成植物根、莖、葉的腐爛病害，引起苗枯、穗腐、根部腐爛等病害，可造成嚴重的經濟損失^［16］，如李國良等^［17］在苜蓿根腐病中分離、鑒定出層出鐮刀菌（F. proliferatum）為致病菌，可使苜蓿植株矮小、根部中柱部分褐變或腐爛中空；Isack等^［18］研究發現層出鐮刀菌（F. proliferatum）也可以導致洋蔥發生根腐病，嚴重時造成洋蔥鱗莖腐爛，還能引起大蒜、玉米、蘆筍等作物的病害。尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）可以導致植物枯萎病，表現出根腐、莖腐等多種病害癥狀，受侵染的寄主植物可達100多種，經常性侵染寄主植物的維管束系統，破壞植物的輸導組織，造成植物萎蔫甚至死亡，從而影響產量和品質^［14］，如奚安^［15］研究出尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）是馬鈴薯干腐病的主要致病菌之一，可導致馬鈴薯嚴重時發病部位表面凹凸不平，有白色或淡黃色菌絲，沿著病斑切開，病組織呈現褐色有空腔。銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）對生態環境適應性強，寄主范圍廣泛，如魏巍等^［19］研究發現銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）能引起馬鈴薯干腐病，楊曉賀等^［20］發現銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）也可以引起蔬菜等作物的根部病害。這與本研究分離出來的層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）均能引起肉蓯蓉莖腐病的發生結果相符，說明本研究分離到的3種鐮刀菌均屬于致病菌。

關于肉蓯蓉莖腐病病原菌，已有學者進行過相關研究。程齊來等^［4］在寧夏肉蓯蓉種植區分離到1種肉蓯蓉莖腐病的病原菌，為接骨木鐮刀菌（F. sambucinum），而本研究雖然分離到3種肉蓯蓉莖腐病的致病菌，但未分離到接骨木鐮刀菌（F. sambucinum），與程齊來在寧夏地區分離的病原菌不同，這可能是由于采集的肉蓯蓉病株來源于不同的地域和氣候條件有關，也可能與病狀間的差異有關。如寧夏地區分離到的接骨木鐮刀菌（F. sambucinum）引起的肉蓯蓉病害主要表現為肉質莖生長受阻等特征，而在民勤青土湖分離到的病原菌引起的癥狀除了具有寧夏分離到接骨木鐮刀菌（F. sambucinum）引起的的癥狀外，還在發病時出現黑色斑點，嚴重時整體發黑，但堅硬不腐爛這一癥狀。據文獻報到，中草藥根腐病的病原不僅繁多，而且不同病原引發的癥狀也都不一樣，并且隨著發病時間延長和優勢菌的變化，癥狀表現也不一樣^［21］，如畢武等^［22］認為引起西洋參根腐病的病原菌為柱孢菌屬真菌，表現癥狀為銹腐，而鐮刀菌屬真菌引起黑腐癥狀；引發三七根腐病的病原菌為毀滅柱孢（C.destructans）和人參柱孢（C. dydinum），癥狀為典型的黃腐等^［23］。因此本試驗分離出的層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）可以歸為肉蓯蓉莖腐病的新病原菌。

在肉蓯蓉莖腐病病原菌鑒定中，采用傳統培養和分子生物學鑒定相結合的方式，以進一步確定其鑒定結果的準確性。形態學鑒定過程中，在3個病原菌中均觀察到了鐮刀菌的典型特征—鐮刀孢子，可以初步將其鑒定為鐮刀菌。但是在各病原菌孢子特征觀察過程中，發現3個病原菌的產孢特征有所差異，比如PDA培養基上只有尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）產孢、且厚垣孢子明顯，可初步鑒定為尖孢鐮刀菌（F. oxysporum），而層出鐮刀菌（F. proliferatum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）不易產孢；但是在PSA培養基上層出鐮刀菌（F. proliferatum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）都能產孢，而尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）不易產孢。另外，在PSA培養基和PDA培養基上觀察到3種鐮刀菌菌落長得都非?？欤a孢量大，這就使它們在自然界中繁殖、傳播都處于優勢，從而成為肉蓯蓉的優勢致病菌^［19］。

本研究將傳統的形態學觀察與現代分子生物學技術相結合，鑒定出肉蓯蓉莖腐病病原菌為層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum），這將為更好地防治肉蓯蓉莖腐病奠定一定的基礎，同時也為下一步開展對該病害的綜合控制技術研究奠定了理論基礎，但是有關病原菌的生理生化方面未做詳細探討，有待進一步深化研究。

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Isolation and Identification of Pathogens Causing Stem Rot of Cistanche deserticola in Qingtu Lake，Minqin

LIU Wei¹，HE Cai¹，JIN Na¹，ZHAO Lianxin¹，JIN Min¹，

ZHANG Jun¹，LI Qiang¹，LI Dong¹ and DUAN Aili²

（1.Wuwei Academy of Forestry Science of Gansu Province，Wuwei Gansu 733000，China；

2.Wuwei Food Inspection and Testing Center，Wuwei Gansu 733000，China）

Abstract To clarify pathogen species causing stem rot in Cistanche deserticola at Qingtu Lake of Minqin，Gansu Province，the tissue isolation method，morphological characteristics and ITS molecular methods were used for pathogen isolation and identification. The results showed that three different pathogens were isolated from stem rot in C.deserticola at Qingtu Lake，the symptoms observed both in indoor and field were essentially the same，showing typical characteristics of stem rot. These pathogens were designated as RCRJF-1，RCRJF-2，and RCRJF-3，respectively. The ITS molecular identification showed that RCRJF-1，RCRJF-2 and RCRJF-3 exhibited 100% similarity to Fusarium proliferatum （accession number MT560212），Fusarium oxysporum （accession number MT530243） and Fusarium acuminatum （accession number MH341217），respectively. Based on morphological characteristics，it was determined that the pathogens causing the stem rot in C.deserticola in Qingtu Lake，Minqin，Gansu were F. proliferatum，F. oxysporum，and F. acuminatum. The isolation frequencies were 52.38%，31.11%，and 16.51%，respectively，with F.proliferatum identified as the dominant pathogen.

Key words Cistanche deserticola; Stem rot; Pathogen; Separation; Identification

Received 2023-05-25

Returned 2023-09-26

Foundation item Science and Technology Planof Gansu Province （Technology Innovation Guidance Plan） （No.21CX6NH279）; Science and Technology Plan of Market Supervision Administration of Gansu Province（No.SSCJG-SP-A202209）;Central Finance Forest and Grass Science and Technology Promotion Demonstration Project （No.Gan［2023］ZYTG020）;the Second Group of Longyuan Young Talents in Gansu Province （No.［2023］11）.

First author LIU Wei，female master，senior forestry engineer. Research area：desertification prevention and economic forests.E-mail：weiweipeng.3800006@163.com

Corresponding author HE Cai，female master，senior forestry engineer.Research area：desertification prevention and economic forests. E-mail：hcyldfcl@163.com

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）