抗營養(yǎng)因子大豆凝集素夾心ELISA檢測方法的建立

摘 要 為建立靈敏、特異的大豆凝集素（soybean agglutinin，SBA）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測方法。試驗以SBA鼠源單克隆抗體為捕獲抗體，SBA兔源多克隆抗血清為檢測抗體，羊抗兔酶標抗體為二抗，通過對抗體的工作濃度及反應時間優(yōu)化，建立SBA的雙抗體夾心ELISA檢測方法，并用建立的方法檢測大豆、大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕中SBA含量。結(jié)果表明：建立SBA雙抗夾心ELISA檢測方法的檢測范圍為39.06～1 250 ng/mL，檢出限為3.00 ng/mL，樣品添加回收率為 77.96%～116.15%，變異系數(shù)為6.11%～18.34%，與大豆中胰蛋白酶抑制因子BBI、KTI，大豆球蛋白glycinin及大豆伴球蛋白-conglycinin等其他抗營養(yǎng)因子均無交叉反應。大豆中SBA含量顯著高于大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕（Plt;0.05）；大豆粕中SBA含量顯著高于膨化大豆粕及酶解大豆粕（Plt;0.05）；膨化大豆粕顯著高于酶解大豆粕中SBA含量（Plt;0.05）。綜上，本研究建立了靈敏度高、特異性好的SBA雙抗夾心ELISA檢測方法，該方法可用于飼料中大豆凝集素的監(jiān)控檢測。

關(guān)鍵詞 大豆凝集素；抗營養(yǎng)因子；多克隆抗體；單克隆抗體；夾心ELISA

大豆是優(yōu)質(zhì)的食品及飼料原料。大豆中蛋白質(zhì)、必需脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素和膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，是人和動物獲取營養(yǎng)的重要來源，大豆中一些成分對人的一些慢性疾病起到預防的作用，對動物生產(chǎn)性能及產(chǎn)品品質(zhì)具有改善作用^［1-4］。然而大豆及其制品中含有的抗營養(yǎng)因子及致敏蛋白^［5-6］，不僅會降低人體及動物對其他營養(yǎng)成分的吸收率，嚴重時還會對人體健康構(gòu)成威脅，在一定程度上對大豆食品開發(fā)利用產(chǎn)生不良影響。大豆凝集素（soybean agglutinin，SBA）是大豆中主要抗營養(yǎng)因子，約占大豆蛋白含量的10%，作為含量較高、副作用明顯的一類抗營養(yǎng)因子，對人及動物機體存在極大的潛在危害，首先是對腸道及其內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生不良影響^［7］，從而影響動物機體代謝性能，導致動物蛋白氮損失增加，降低了動物生長速度，甚至由于營養(yǎng)不良導致動物死亡，尤其是對幼齡動物危害極大^［8］。因此，對大豆凝集素進行滅活，建立SBA的準確識別與定量檢測方法對降低凝集素危害尤為必要。

目前，大豆凝集素滅活主要采用膨化技術(shù)及發(fā)酵酶解技術(shù)^［9］。而檢測技術(shù)方面，到目前為止，科研工作者建立了多種SBA的檢測方法，包括紅細胞血凝試驗法^［10］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法^［11］、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）^［12］、火箭電泳^［13］、電化學發(fā)光生物傳感器^［14］及酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測法^［15-16］、拉曼光譜檢測法^［17］等方法。在上述這些方法中，ELISA檢測方法操作相對比較簡單，耗時較短，而且該方法特異性強，靈敏度高。SBA分子質(zhì)量約120 ku，屬于大分子蛋白質(zhì)物質(zhì)，其抗原決定簇不是單一的，因此與間接競爭ELISA檢測模式^［15］相比雙抗體夾心ELISA檢測模式效果更好。盡管張海全^［16］利用紅細胞膜對SBA的吸附作用，建立了近似于雙抗體夾心模式ELISA檢測方法，但其使用的紅細胞膜易受紅細胞來源及純凈度影響，影響到所建立ELISA方法的穩(wěn)定性及重復性。

為建立簡便、靈敏、穩(wěn)定的SBA檢測方法，本研究基于已制備的SBA兔源多克隆抗血清及鼠源單克隆抗體，通過ELISA條件的優(yōu)化，建立SBA雙抗體夾心間接ELISA檢測方法，以期進一步補充完善SBA的免疫學快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SBA、大豆中Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子（BBI）、大豆中Kunitz胰蛋白酶抑制因子（KTI）、大豆致敏蛋白Glycinin、大豆致敏蛋白 β-conglycinin（純度均≥90%，購自Sigma公司；羊抗兔酶標二抗（GaRIgG-HRP），購自索萊寶北京生物科技有限公司；ELISA試驗所用的包被液（CBS）、稀釋液（PBS）、洗滌液（PBST）、封閉液、顯色液及終止液等，均由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室配制；SBA 鼠源單克隆抗體（mAb）及SBA兔源多克隆抗血清（pAb），均為河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室制備。

1.2 主要儀器

酶標儀（型號為550），購自Bio-Rad公司；多功能冷凍離心機（型號為2-6），購自Sigma公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（型號為371），購自賽默飛世爾科技公司。多功能高速粉碎機（型號為拉扣型），購自紅太陽機電有限公司。

1.3 雙抗體夾心間接ELISA

雙抗體夾心ELISA具體步驟，參照文獻［18］的描述并稍作修改。

用CBS溶液將SBA鼠源單抗稀釋到試驗所需的濃度，包被聚苯乙烯酶標板，4℃條件下保存，備用；將樣品液或SBA標準溶液加入酶標板孔中，37℃孵育30 min，PBST洗板；加入SBA兔源多克隆抗血清，37℃孵育30 min，PBST洗板；加入GaRIgG-HRP，37℃孵育30 min，PBST洗板；加入顯色液室溫顯色10 min，然后加入終止液終止顯色，在450 nm波長下，測定吸光度值，即OD_450nm值。

1.4 雙抗體夾心間接ELISA條件優(yōu)化

1.4.1 抗體最佳工作濃度確定 采用方陣棋盤法確定捕獲抗體（鼠源單克隆抗體）與檢測抗體（兔源多克隆抗血清）最佳工作質(zhì)量濃度。用包被液CBS將SBA鼠源單抗稀釋成不同的質(zhì)量濃度，分別以1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000、1∶12 000的稀釋度包被酶標板，各稀釋度設置為兩行（陰性和陽性各1行）。在酶標板中包被相同濃度抗體的兩行中，分別加入已知濃度的SBA標準溶液和PBS溶液，37℃孵育30 min，洗板拍干。將SBA兔源多克隆抗血清，分別以1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000、1∶12 000的稀釋度加入每列酶標板，按稀釋度由小到大順序加入，37℃孵育30 min，洗板拍干。其余操作步驟同“1.3”，顯色終止后，用酶標儀讀值，計算P/N值，P/N最大值對應的單抗及多抗?jié)舛燃礊榭贵w最佳工作質(zhì)量濃度。

1.4.2 捕獲抗體最佳反應時間的確定 依據(jù)優(yōu)化好的抗體工作質(zhì)量濃度包被酶標板，將確定質(zhì)量濃度的標準品加入之后，捕獲抗體與樣品液反應時間設為20、30、40、50、60、70 min，其余試驗步驟按照“1.3”進行，選擇P/N值最大且N值較小時所對應的時間為最佳反應時間。

1.5 雙抗體夾心間接ELISA檢測方法標準曲線的繪制

用PBS配制確定濃度的樣品液，設置SBA質(zhì)量濃度梯度為5 000、2 500、1 250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77、4.88 ng/mL，按“1.3”步驟進行檢測，分別將SBA質(zhì)量濃度的對數(shù)值和OD_450nm值設為橫、縱坐標，繪制標準曲線，其格式為y=ax+b，其中y為不同濃度SBA對應的OD_450nm值，x為SBA質(zhì)量濃度的對數(shù)值。

1.6 雙抗體夾心間接ELISA檢測方法性能的鑒定

1.6.1 檢出限鑒定 雙抗體夾心間接ELISA方法的檢出限測定采用李燕虹^［18］報道的方法，即用建立的ELISA檢測方法重復測定空白樣品20次，得到空白樣品OD_450nm平均值（x^-）和標準偏差（SD），將X^--2SD值代入該方法標準曲線線性回歸方程，計算得到對應濃度即為檢出限，檢出限越低則靈敏度越高。

1.6.2 準確度鑒定 通過添加回收試驗驗證方法的準確度。用PBS將SBA分別稀釋成不同質(zhì)量濃度，用建立的ELISA檢測方法檢測樣品中的SBA含量（重復檢測4次），計算測定值與實際添加量的比值，計算添加回收率來鑒定方法的準確度。

1.6.3 特異性鑒定 用建立ELISA檢測方法測定質(zhì)量濃度為10 μg/mL BBI、KTI、Glycinin、β-conglycinin的標準品，設置空白對照，酶標儀讀值，計算P/N值，若P/Nlt;2.1，表明方法特異性良好。

1.7 樣品檢測

把從不同飼料公司得到的大豆（粗蛋白 35.4%）、酶解大豆粕1（粗蛋白51.2%）、酶解大豆粕2（粗蛋白50.7%）、大豆粕（粗蛋白 46.8%）、膨化大豆粕（粗蛋白43.4%）進行粉碎混勻，各準確稱取約1 g，分別加入到15 mL離心管，每管加入10 mL PBS振蕩混勻提取10 min，靜置5 min，取上清，按“1.3”步驟進行測定，每個樣品測定3次。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，數(shù)值表示為“平均值±標準差”，采用Compare Means 模塊下One-way ANOVA進行分析，Plt;0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙抗體夾心間接ELISA檢測方法抗體最佳工作濃度的確定

方陣棋盤試驗結(jié)果顯示（表1），鼠源單抗和兔源多克隆抗血清稀釋倍數(shù)均為1∶8 000時，P/N值最大且此時N值較小，因此把1∶8 000稀釋設定為SBA鼠源單抗及兔源多抗血清的最佳工作質(zhì)量濃度。

2.2 雙抗體夾心間接ELISA檢測方法捕獲抗體最佳反應時間的確定

將工作濃度的鼠源單抗包被酶標板，用800 ng/mL的SBA標準品作為陽性樣品分別進行檢測，結(jié)果如表2所示，俘獲抗體與SBA最佳反應時間為30 min。

2.3 雙抗體夾心間接ELISA檢測方法標準曲線的建立

由圖1-A可以看出，由5 000、2 500、1 250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77、4.88 ng/mL的SBA標準溶液，夾心ELISA測定OD_450nm建立的曲線，按線性方程計算時，其方程式為y=0.567 9x-0.264 5，線性關(guān)系為R²= 0.963 3。而由圖1-B可以看出，由1 250、625、312.5、156.25、78.13、39.06 ng/mL的SBA標準溶液，測定OD_450nm值建立的曲線，按線性方程計算時，其方程式為y=0.568 2x-0.184 5，線性關(guān)系為R²=0.985 3。因此，確定圖1-B為線性標準曲線，線性檢測范圍為39.06～1 250 ng/mL。

2.4 雙抗體夾心間接ELISA檢測方法的性能 鑒定

2.4.1 檢出限確定 用制備的夾心ELISA試劑盒測定20個空白樣品，計算20個空白樣品的OD_450nm平均值為0.1001，標準差SD為0.015 1，-2SD為0.069 7，代入標準曲線線性回歸方程，計算方法檢出限為2.80 ng/mL，考慮試驗操作可能存在的誤差，將檢出限設定為3.00 ng/mL。

2.4.2 準確度鑒定 用SBA濃度分別為500 ng/mL、50 ng/mL、20 ng/mL的標準品經(jīng)建立的夾心間接ELISA方法檢測后，將測定的OD_450nm讀值代入到標準曲線，求出樣品中SBA含量，計算回收率，如表3所示，樣品回收率為77.96%～116.15%，表明方法準確度較高。

2.4.3 特異性鑒定 以10 μg/mL的BBI、KTI、Glycinin、β-conglycinin標準溶液作為檢測樣品，采用雙抗體夾心間接ELISA檢測方法測定P、N值，計算P/N值。結(jié)果見表4，P/N值均小于2.1接近于1，說明10 μg/mL的BBI、KTI、Glycinin、β-conglycinin溶液對建立的夾心ELISA方法來說幾乎可以認為是陰性樣品，證明建立的ELISA檢測方法特異性良好，與大豆中其他抗營養(yǎng)因子均無交叉反應，說明建立的SBA檢測方法只選擇性地與SBA反應，而與其他物質(zhì)沒有 反應。

2.5 樣品檢測

采用建立的夾心ELISA檢測大豆、豆粕等樣品，結(jié)果見表5，由于不同的樣品蛋白質(zhì)含量不同，為了便于比較，把SBA含量表示為每克蛋白質(zhì)中的含量。由表5可以看出，大豆、大豆粕、膨化大豆粕、酶解大豆粕1、酶解大豆粕2中SBA含量分別為779 087.41、1 542.48、1 335.85、349.94和332.06 ng/g蛋白。大豆中SBA含量顯著高于大豆粕、膨化大豆粕、酶解大豆粕（Plt; 0.05）。大豆粕中SBA含量顯著高于膨化大豆粕、酶解大豆粕（Plt;0.05）；膨化大豆粕中SBA含量顯著高于酶解大豆粕（Plt;0.05）；而兩種酶解大豆粕中SBA含量差異不顯著（P≥0.05）。

3 討論與結(jié)論

免疫學檢測方法中，ELISA檢測方法由于操作簡單，檢測耗時短，檢測結(jié)果靈敏性好，特異性強，因此在食品飼料農(nóng)藥殘留檢測^［19-20］、獸藥殘留檢測^［21-22］、違禁添加物檢測^［23-25］、過敏原及抗營養(yǎng)物質(zhì)檢測^［5，18］、霉菌毒素檢測^［26-27］、環(huán)境污染物監(jiān)測^［28-29］、人及動物疫病診斷檢測^［30-31］等領(lǐng)域得到廣泛應用。

本研究建立的SBA雙抗體夾心ELISA檢測方法，線性范圍為39.06～1 250 ng/mL，張海全^［16］建立大豆凝集素ELISA檢測方法的檢測范圍為10～10 000 ng/mL，比本研究的檢測范圍寬，這可能與兩種方法不同的包被抗體及檢測抗體有關(guān)，本研究建立的雙抗夾心ELISA中包被抗體為SBA鼠源單抗，檢測抗體為兔源多抗，而張海全^［16］建立的相似方法中，包被的是兔紅細胞（兔紅細胞對大豆凝集素具有良好的凝集活性），檢測抗體為SBA單克隆抗體，盡管其檢測范圍比本研究建立的夾心ELISA檢測范圍寬，但紅細胞來源不同及紅細胞制備時的純凈度并不確定，這些因素均影響所建立的類似夾心ELISA方法的穩(wěn)定性與準確度，因此采用紅細胞結(jié)合單抗建立類似夾心ELISA檢測方法的報道并不多，而采用雙抗體夾心模式的ELISA檢測方法比較常見。李振田等^［15］建立的大豆凝集素ELISA檢測方法的檢測范圍為5.2～5 728.5 ng/mL，檢測范圍也比本研究的檢測范圍寬，可能是因為其建立的是間接抑制ELISA，而本研究為雙抗夾心ELISA法；且其在研究中并沒有給出線性相關(guān)系數(shù)，而本研究中建立的雙抗夾心ELISA法檢測范圍的線性相關(guān)系數(shù)為0.985 3，線性相關(guān)性比較高。

本研究建立的檢測方法中檢出限為3.00 ng/mL，而李振田等^［15］及張海全^［16］建立的ELISA檢測方法檢出限均為10 ng/mL，是本研究檢出限的3.3倍，本研究建立的ELISA方法靈敏度更高，說明SBA的雙抗體夾心ELISA模式檢測方法比間接競爭ELISA模式檢測方法更靈敏，這可能是因為SBA屬于大分子物質(zhì)，不止一個抗原表位，因此更適合采用雙抗體夾心模式的ELISA檢測方法。

本研究建立的方法中樣品回收率為 77.96%～116.15%，而張海全^［16］建立的ELISA檢測方法添加回收率均在96%以下，這可能與ELISA包被物質(zhì)及檢測抗體的來源不同有一定的關(guān)系。

用本研究建立夾心ELISA方法對大豆及大豆粕樣品檢測結(jié)果表明，大豆中SBA含量顯著高于大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕中SBA含量；而大豆粕顯著高于膨化大豆及酶解大豆粕；膨化大豆粕顯著高于酶解大豆粕。這可能是因為大豆榨油的前處理措施使SBA的抗原決定簇結(jié)構(gòu)改變，因此用建立夾心ELISA檢測時，大豆粕中SBA檢測值極低，不到大豆中SBA含量的 0.2%；而大豆粕的膨化處理又使大豆粕中剩余的SBA中的一部分抗原決定簇結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此膨化大豆粕中SBA的檢測值低于大豆粕。酶解使得大豆粕中蛋白質(zhì)分解，更容易破壞SBA的抗原決定簇結(jié)構(gòu)，因此兩個酶解大豆粕中SBA含量均不到大豆粕中SBA含量的23%，說明大豆粕酶解更利于SBA的消除。

綜上，本研究采用SBA的鼠源單克隆抗體作為俘獲抗體，兔源多克隆抗血清作為檢測抗體，通過條件優(yōu)化成功建立了SBA的雙抗體夾心ELISA檢測方法，該檢測方法靈敏度高，檢出限達到3.00 ng/mL，線性范圍為39.06～1 250 ng/mL，樣品添加回收率為77.96%～116.15%，特異性強，與大豆中其他抗營養(yǎng)因子BBI、KTI及大豆致敏蛋白Glycinin、β-conglycinin均無交叉反應。所建立的SBA雙抗體夾心ELISA檢測方法為監(jiān)測食品飼料中大豆凝集素提供了技術(shù) 支持。

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Establishment of a Sandwich ELISA for Detecting Soybean Agglutinin as an Anti-nutritional Factor

HU Xiaofei¹，YANG Jifei¹，XING Yunrui¹，PANG Xinghao¹，SUN Yaning¹ and WEI Fengxian²

（1.Key Laboratory for Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China; 2. Institute of Husbandry，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

Abstract To establish a sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） for the detection of soybean agglutinin（SBA）. Mouse-derived monoclonal antibody was used as the capturing antibody and rabbit-derived polyclonal antibody as the detecting antibody，with a sheep anti-rabbit enzymic conjugate antibody as the secondary antibody.This sandwich method for SBA detection was optimized in terms of antibody concentration and reaction time.This method was applied to detect SBA levels in differenet soybean products，including soybean，soybean meal，extruded soybean and enzyme hydrolyzed soybean meal. The results showed that the detection range of the developed sandwich ELISA was 39.06-1 250 ng/mL，the detection limit was 3.00 ng/mL，the fortified recovery was 77.96%-116.15%，the coefficient of variation was 6.11%-18.34%.There was no cross-reaction with other anti-nutritional factors such as trypsin inhibitors BBI，KTI，glycinin and β-conglycinin in soybean. The concentration of SBA in soybean was higher than that in soybean meal，extruded soybean meal and enzyme hydrolyzed soybean meal，respectively（Plt;0.05）. SBA in soybean meal was higher than in extruded soybean meal and enzyme hydrolyzed soybean meal，respectively（Plt;0.05） and in extruded soybean meal was higher than in enzyme hydrolyzed soybean meal（Plt;0.05）. These findings indicate that the established SBA sandwich ELISA detection method is both sensitive and specific and can be used for monitoring and detecting soybean agglutinin in feed.

Key words Soybean agglutinin; Anti-nutritional factor; Polyclonal antibody; Monoclonal antibody; Sandwich ELISA

Received 2023-11-22

Returned 2023-12-25

Foundation item The National Key Research and Development Program（No. 2018YFC1602903）; Modern Agriculture Industry Technology System of Henan Province（No. HARS-SS-12-S）.

First author HU Xiaofei，male，research fellow. Research area：immunological assay techniques for food and feed quality and safety.E-mail： huxf1972@126.com

Corresponding author WEI Fengxian，female，research fellow.Research area：animal nutrition，feed quality，and environmental control technology.E-mail： wei.fx@163.com

（責任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）