5-氨基乙酰丙酸對蘋果花期凍害的緩解效應

摘 要 為了研究5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）對蘋果花凍害的緩解作用。以‘富士’蘋果花枝為試材，研究不同溫度脅迫下（0℃、-2℃、-4℃和-6℃）不同5-ALA處理濃度（25 mg·L^-1、50 mg·L^-1、75 mg·L^-1和100 mg·L^-1）對蘋果花柱和子房凍害的緩解機制，噴清水為對照，測定了相對電導率、抗氧化酶活性等相關生理指標和相關抗性基因表達。結果表明，噴施25～75 mg·L^-1的5-ALA可降低-4℃～0℃的低溫脅迫下蘋果花柱和子房受凍害程度， 與對照相比，噴施5-ALA明顯緩減低溫脅迫下子房凍害褐變程度，而噴施 25～100 mg·L^-1的5-ALA還不能緩解-6℃對蘋果花的凍害，花器官完全褐變死亡。-2℃脅迫時 50 mg·L^-1的5-ALA處理過的蘋果花器官MDA含量可降低32.16%，而SOD、CAT和POD活性增加了將近1倍；處理過的花朵相對電導率比對照降低8.7%，半致死溫度也降低0℃～1.65℃。此外，與對照相比，5-ALA處理的蘋果花器官中 MdADF5、MdTLP1、MdMDL2、MdDREB3、MdGSTU17和 MdEXPA1的表達量更高；而 MdCRPK1的表達量更低。GO富集分析結果表明，大部分GO條目與代謝過程、催化活性和細胞壁有關；KEGG通路注釋最多的DEGs分布在植物激素信號轉導、MAPK信號通路、淀粉和蔗糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉化、苯丙烷類代謝和植物與病原體的相互作用等途徑，提高了對蘋果花期的低溫脅迫抵抗能力。綜上認為，在黃土高原地區花開放前噴施5-ALA對離體蘋果花器官在-4℃～0℃凍害有一定緩解效果，效果顯著的是25 mg·L^-1和50 mg·L^-1，推薦結合其他花期防凍減災措施推廣使用。

關鍵詞 ５-氨基乙酰丙酸；蘋果花器官；低溫脅迫

低溫凍害對植物生長發育的影響是一個復雜的過程，它不僅包括明顯的外部變化，如植物生長緩慢、組織受凍褐變，還包括各種內部變化，如膜脂過氧化、膜通透性增加和相關基因的表達。面對低溫植物也進化出保護酶系統，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）是植物的重要保護酶，可以去除活性氧的積累對植物造成的有害影響，穩定植物膜系統，減輕膜脂過氧化產生的丙二醛（MDA）。除此之外，植物通過調節相關基因的表達從而保護其免受傷害。

5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是一種植物生長調節劑，通過調節植物的光合、抗氧化機制、養分吸收過程、CO₂固定和N₂同化來加速植物發育和增加產量^［1-2］、緩解植物非生物脅迫的傷害^［3］，是顯著提高植物抗逆性的植物生長調節劑之一^［4-5］。試驗表明，5-ALA降低了低溫脅迫下草莓的呼吸速率、H₂O₂和MDA含量^［6］；5-ALA增加了在低溫脅迫下黃瓜的葉綠素含量、光合速率、氣孔導度和抗氧化酶活性^［7］；5-ALA增強大豆植株CAT活性，激活酶防御系統，減少電解質滲漏^［8-9］。番茄在低溫脅迫下，通過5-ALA增強抗氧化系統和清除ROS來提高植物生長和光合作用活性^［10］。此外，在低溫脅迫下，對甜櫻桃施用5-ALA可提高谷胱甘肽（GSH）和AsA濃度、SOD、CAT、APX和GR活性^［11］。表明在低溫脅迫下，施用一定濃度的5-ALA可以提高植物的抗寒性。

中國是世界上蘋果栽培面積和產量第一的國家，但在國內黃土高原蘋果主產區花期易受寒流侵襲，遭受低溫凍害，給生產帶來巨大損失^［12］，輕者果實發育不良果銹嚴重，重者甚至損害子房柱頭影響坐果造成當年產量絕收或大幅度減產。目前，防止蘋果花期低溫凍害的主要方法有推遲花期、施放煙霧、花期噴水和噴防凍劑等，一些方法耗費時間和大量人工，且收效不大。因此，篩選能夠有效抵抗預防蘋果花期低溫脅迫的藥劑，對于解決蘋果生產實際應用中的花期凍害的問題和后期的坐果問題，以及以后研究抗低溫脅迫機理也具有重要意義^［13-14］。據前人研究，5-ALA對植物在低溫脅迫下的緩解作用有著眾多作用，但 5-ALA在蘋果花器官上的應用還未有進展，5-ALA對蘋果花期抗寒防凍在生理機制和分子機制是否有所效應也未探究。本研究將以‘富士’系蘋果花枝為研究試材，對經過5-ALA處理的蘋果花枝進行梯度降溫，比較其在相對電導率、MDA、抗氧化酶活性、低溫應答基因表達等生理和分子指標上的差異，為后續5-ALA在蘋果上的抗寒機理的解釋和示范推廣提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與方法

在2021年預備試驗基礎上，2022年蘋果花期進行試驗，試驗材料為寶雞千陽蘋果試驗站的8 a生矮化中間砧長富2號（中間砧M26，基砧新疆野蘋果），株行距：4 m×1.2 m。試驗區組隨機設計，每個處理3株樹，選取不少于50個花序，每個處理設置3次重復，每個處理之間有一株防護樹，共45棵樹，均勻噴灑花朵達到剛好滴落狀態即可。噴施48 h后，每個處理于花蕾期近樹冠中部的東、西、南、北 4個方位選取長勢一致的蘋果花期的枝條混合放入蒸餾水中，迅速帶入試驗室進行低溫處理。降溫過程如表1所示，室溫（25℃）降至0℃的降溫過程花費6 h，0℃脅迫溫度過程：室溫降溫過程6 h（降至0℃）+0℃（維持2 h）；-2℃脅迫溫度過程在0℃降溫基礎上，先用1 h降溫至-2℃并維持2 h；-4℃脅迫溫度過程是在-2℃降溫基礎上，降溫1 h至 -4℃并維持2 h；-6℃脅迫溫度過程是在 -4℃降溫基礎上，先降溫1 h至-6℃并維持 2 h。試驗處理分別為CK（清水）、T1（25 mg·L^-1的5-ALA）、T2（50 mg·L^-1的 5-ALA）、T3（75 mg·L^-1的5-ALA）、T4（100 mg·L^-1的5-ALA）。5-ALA購自Sigma公司，人工模擬霜凍的儀器是以PID方式控溫的BPHS-250B型高低溫試驗箱（上海一恒科技有限公司生產）。將所有處理蘋果花枝隨機置于試驗箱。由常溫開始，先在6 h內降到0℃，試驗處理溫度為0℃、-2℃、-4℃和-6℃，此時降溫速度為2℃/h。降溫過程中在達到每個處理溫度并持續2 h之后取出一批樣品，每批每個濃度蘋果花采取樣品5～8朵，為了減少取樣對降溫過程的影響，每次取樣時間嚴格控制在10 s之內。低溫處理的每一批樣品要及時用液氮處理保存其生理活性狀態并放置-80℃冰箱保存，用于測定各項生理指標和基因表達。另外，降至每個處理溫度后將采樣剩余材料在室內靜置10 h，進行形態指標觀察和各處理相對電導率的測定^［15］。

1.2 形態外觀分析

在蘋果花器官經過程序降溫并到達指定溫度后維持2 h后，回至室溫后進行形態外觀的對比。將蘋果花朵用手術刀對半切開，再經由SONYSELP1650相機進行實體拍照拍照和Photoshop進行排列比較子房柱頭褐變程度。

1.3 生理指標測定

相對電導率測定，用以下公式求得相對電導率：相對電導率=煮沸前電導值/煮沸后電導值×100%，對相對電導率配以Logistic方程求得半致死溫度LT₅₀，對相對電導率配以Logistic方程 y=k/（1+ae^-bx）求得半致死溫度LT₅₀，式中，y表示電導率，x表示處理溫度，k、a、b為常數，e為自然對數。以LT₅₀作為蘋果花器官實際抗寒性的評定依據^［16］。

MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色法測定^［17］。POD、SOD、CAT活性使用植物過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶試劑盒（Solarbio）測定，結果表示為U·g^-1·min^-1。

1.4 轉錄組測序和RT-qPCR分析

為深入闡明5-ALA對緩解蘋果花霜凍的分子機理，對效果較為顯著的經25 mg·L^-1的 5-ALA處理后和未經5-ALA處理的蘋果花器官在-4℃的差異表達基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）進行了分析。根據FPKM值計算基因表達水平，通過FDR≤0.01的閾值和絕對對數來識別和過濾DEGs（折倍變化）值≥ 1。共有5 056個DEGs被確定為5-ALA處理的和對照低溫處理下花器官組織之間的DEGs。其中 2 687個下調基因，2 369個上調基因。皮爾遜相關系數r大于0.9，共獲得35.38 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達到5.72 Gb，Q30堿基百分比在91.72%及以上，在本項目中，Fold Change≥2且FDRlt;0.01 作為差異基因篩選標準，這些結果表明，獲得的數據是可靠的，并且有資格進行后續分析。

為驗證轉錄組數據的可靠性和準確性，在轉錄組隨機選擇7個與抗性相關的DEGs進行實時熒光定量（RT-qPCR）驗證，引物如表2所示。RT-qPCR采用天根RNA simple總RNA提取試劑盒提取總RNA，通過在2%瓊脂糖凝膠上運行樣品來驗證總RNA的完整性。使用Prime Script^TM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa Bio，Shiga，Japan）合成cDNA。利用Primer 5.0設計RT-qPCR引物，利用ABI step one plus定量儀進行RT-qPCR檢測，目標基因檢測按照SuperReal熒光定量預混試劑盒（天根）說明書進行，MdActin作為內參基因，采用2^-ΔΔCT法計算各基因的表達水平。

1.5 數據分析

采用Excel 2020和Origin 2022進行數據分析和繪圖，對數據進行統計分析，并進行圖像繪制。采用單因素方差分析和Tukey test 檢驗（IBM SPSS Statistics 24），不同的小寫字母表示Plt;0.05的差異顯著。試驗結果表示為“平均 值±標準誤”。

2 結果與分析

2.1 5-ALA對蘋果花器官低溫脅迫下形態的 影響

在經過不同濃度的5-ALA溶液處理之后，蘋果花器官在不同溫度下的褐變程度明顯降低，以0 mg·L^-1清水處理的花器官為對照（CK），由圖1-A可以明顯看出，經過低溫脅迫后恢復到常溫的蘋果花朵，在-4℃～0℃低溫下25 mg·L^-1、50 mg·L^-1的處理緩解效果更好，顏色更為鮮嫩。-4℃時，未經處理的蘋果花朵從內到外皆已褐變，而25 mg·L^-1處理下的花枝，為該組處理效果較為顯著，褐變程度最輕；與對照相比，其他濃度的處理也更有效果。說明在 -4℃～0℃的低溫脅迫下，噴施25～75 mg·L^-1的5-ALA對蘋果花器官的低溫脅迫有一定的緩解作用，其中以25 mg·L^-1和50 mg·L^-1的5-ALA效果較為顯著，如圖1-B所示，-6℃時，所有處理的花器官均已褐變，且褐變程度超過了花器官的50%，已全部死亡，故后續的測定指標排除-6℃的處理。

2.2 5-ALA對低溫脅迫下蘋果花器官電導率的影響

由圖2-A可見，與對照相比，25～75 mg·L^-1的5-ALA溶液能夠明顯降低各個溫度下的相對電導率，而100 mg·L^-1僅在0℃時起到降低相對電導率的作用。0℃時，由于溫度較低且低溫持續時間短（圖2-B），在相對電導率上差了 2.58%～3.98%，而-4℃～-2℃時處理與對照的相對電導率分別相差了1.55%～ 6.30%、0.46%～8.7%，說明5-ALA對蘋果花器官 -4℃～0℃的低溫脅迫下的相對電導率有一定緩解作用。

如表3的半致死溫度所示，在-4℃～0℃低溫脅迫情況下，噴施一定濃度的5-ALA可以緩解蘋果花器官在低溫凍害情況下受損程度，提高蘋果花器官的抗寒能力和半致死溫度，半致死溫度（LT₅₀）從低到高排列為25 mg·L^-1gt;50 mg·L^-1gt;75 mg·L^-1gt;0 mg·L^-1（對照）gt;100 mg·L^-1。如表3所示，噴施25 mg·L^-1 5-ALA溶液的抗寒效果較為顯著，50 mg·L^-1的抗寒效果次之，可以將對照-3.99℃的半致死溫度降低1.65℃和1.20℃；而75 mg·L^-1的 5-ALA溶液收效甚微，與對照相比區別很小，僅降低了0.25℃。最后噴施100 mg·L^-1的溶液基本無緩解效果，而且從表3相對電導率比較也能看出100 mg·L^-1溶液并不能降低電解質外滲情況，說明該濃度對蘋果花低溫脅迫無緩解作用。在-6℃脅迫下，相對電導率雖然在5-ALA處理下有所降低，但褐變程度超過了花器官的50%，已全部死亡，故不做討論。所以在5-ALA對 -4℃～0℃的低溫脅迫下降低蘋果花器官的相對電導率和半致死溫度效果較為顯著的濃度是 25 mg·L^-1。

2.3 5-ALA對低溫脅迫下蘋果花器官MDA含量的影響

如圖3所示，5-ALA通過降低MDA的含量來清除有害代謝物質，緩解低溫脅迫對蘋果花朵造成的傷害。隨著溫度的降低，對照 0 mg·L^-1的MDA含量隨著溫度的下降而上升，而噴施一定濃度的5-ALA溶液可以降低MDA的含量，5-ALA濃度有效果的是25～75 mg·L^-1。0℃低溫下，5-ALA處理的花朵MDA含量比對照降低了10.39%～18.32%；-2℃低溫下，5-ALA處理的花朵MDA含量比對照降低了18.25%～32.16%；-4℃低溫下，5-ALA處理的花朵MDA含量比對照降低了6.92%～27.56%，25 mg·L^-1和50 mg·L^-1處理可以和對照形成顯著性差異。說明在5-ALA處理下，低溫脅迫對蘋果花朵MDA含量的增加得到抑制，蘋果花的抗寒性得到了增強。

2.4 5-ALA對低溫脅迫下蘋果花器官抗氧化酶活性的影響

低溫下，蘋果花朵隨著溫度降低過氧化物酶酶活性升高，說明植物內部調節酶活性抵抗低溫凍害。而與對照相比，低溫脅迫下經過5-ALA處理的蘋果花朵的POD活性均得到提高。對照的POD活性隨著溫度的降低而升高，在-4℃時升至最大（圖4），結合形態指標，此時蘋果花受到極大的凍害，外部幾乎都已褐變，花朵的完整性和功能性都受到破壞。25 mg·L^-1的5-ALA提升POD活性效果較為顯著，在-4℃時較對照提高了1.76倍，在-2℃時較對照提高了1.62倍，在0℃時較對照提高了1.50倍。0℃時由于溫度偏高且維持時間較短，5-ALA處理的花朵雖然POD活性得到增強，但此時蘋果花朵受到的脅迫凍害程度低些，故而POD活性也總體較低，25～75 mg·L^-1的5-ALA較對照形成顯著性差異。結果表明，各個濃度的5-ALA處理過的蘋果花朵的過氧化物酶明顯高于對照，噴施25 mg·L^-1的5-ALA在-4℃～0℃低溫脅迫下對蘋果花器官的抗寒性提高效果較為顯著。

由圖5可知，在50 mg·L^-1的5-ALA處理下，-2℃和-4℃時蘋果花器官CAT活性與對照相比均呈現顯著差異。對照CAT的含量隨著溫度的下降呈現先上升后下降的趨勢。0℃時，與對照相比CAT含量增加2%～37%；-2℃時，與對照相比CAT含量增加12%～37%； -4℃時，50 mg·L^-1處理的CAT活性是對照的2.47倍。不同溫度處理均在50 mg·L^-1時達到最大，其中-4℃時的CAT活性最大，說明噴施50 mg·L^-1的5-ALA對-4℃～0℃低溫脅迫下提高CAT活性的效果較為顯著。

由圖6可知，對照的SOD活性隨著溫度的下降和霜凍時間的延長而增強。低溫脅迫下，噴施一定濃度的5-ALA可以使蘋果花的SOD活性增加，不同的5-ALA處理均與對照形成顯著差異（P＜0.05）。0℃時，SOD活性為50 mg·L^-1＞100 mg·L^-1＞25 mg·L^-1＞75 mg·L^-1＞0 mg·L^-1。效果較為顯著的是50 mg·L^-1，比對照高51.5%。-2℃時，SOD活性為75 mg·L^-1＞25 mg·L^-1＞100 mg·L^-1＞0 mg·L^-1＞50 mg·L^-1，效果較為顯著的是75 mg·L^-1，比對照高31.7%。-4℃時，SOD活性為75 mg·L^-1＞25 mg·L^-1＞0 mg·L^-1＞50 mg·L^-1＞100 mg·L^-1，效果較為顯著的是75 mg·L^-1，比對照高30.6%。結果表明，各個溫度脅迫下噴施一定濃度的5-ALA能提高蘋果花朵的SOD活性，對蘋果花器官的抗寒性有所提高。

2.5 5-ALA對低溫下蘋果花基因表達的影響

為深入闡明5-ALA對緩解蘋果花霜凍的分子機理，對處理效果較為顯著的25 mg·L^-1的5-ALA處理組和未經5-ALA處理的對照組蘋果花器官在-4℃脅迫下的差異表達基因進行了分析。表明轉錄組分析篩選出5 056個DEGs（圖7-A），其中2 369個DEGs表達上調，2 687個DEGs表達下調。韋恩圖（圖7-B）顯示1 476個基因為處理組獨有，1 621個基因為對照組獨有，兩組共有的基因有25 729個。

為驗證轉錄組數據的可靠性和準確性，選擇了7個與抗性相關的DEGs進行RT-qPCR驗證（圖8）。低溫霜凍條件下，與對照相比，5-ALA處理后的蘋果花中基因 MdADF5、MdDREB3、MdEXPA1、MdGSTU17、MdMDL2和 MdTLP1上調，而 MdCRPK1下調，轉錄組分析和RT-qPCR結果趨勢基本一致，表明轉錄組測序數據結果可靠。

2.6 GO富集分析

如圖9所示，通過GO富集分析單獨處理5-ALA與對照組相比產生的DEGs。根據其功能，DEGs可分為3大類，包括生物過程（19個亞類），細胞成分（17個亞類）和分子功能（13個亞類）。在細胞組分中，膜的2個亞類和細胞器官存在最多的DEGs。分子功能的顯著富集和與抗性相關的是催化活性亞類、轉運蛋白活性、分子功能調節和抗氧化活性幾個富集。生物過程中與抗性相關的顯著富集主要是代謝過程，單一生物過程，生物調節，對刺激的反應和細胞組分組織或生物過程中的生物發生。這些基因富集多與植物脅迫相關。說明在-4℃低溫脅迫下，25 mg·L^-1的5-ALA處理對蘋果花器官的富集有所影響（圖9）。

2.7 KEGG富集分析

采用KEGG途徑富集分析，探究了低溫下經由5-ALA處理對蘋果花器官代謝途徑的影響。分析結果表明，DEGs富集包含在131個代謝通路中（圖10）。在KEGG富集前20個通路中，選取q值最小，基因數目最多的前6個通路，分別是：植物激素信號轉導、MAPK信號通路、淀粉和蔗糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉化、苯丙烷類代謝和植物與病原體的相互作用，這些通路都和植物抗逆和免疫系統相關。說明在-4℃低溫脅迫下，25 mg·L^-1的5-ALA處理對蘋果花器官的通路有所影響（圖10）。

3 討 論

一般從植物花朵的褐變可以看出受凍害程度，將柱頭褐變看作花朵開始受凍，而子房的褐變則看成是花朵受凍致死。植物在低溫下會產生活性氧ROS，破壞細胞膜的結構，從而導致原本位于質體和其他細胞器中的多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）接觸位于液泡中的酚基質形成棕色聚合物，形成褐變^［18］。田治國等^［19］就曾用杏花器官的褐變程度試驗抗凍劑對杏樹花器官的抗寒能力的提升效果。本研究中，在-4℃～ 0℃的低溫脅迫下，25 mg·L^-1的5-ALA處理時，對蘋果的花朵和子房具有一定的緩解能力，與對照相比，褐變的程度明顯更低。這與在櫻桃和草莓上的低溫脅迫試驗效果較為顯著的50 mg·L^-1和20 mg·L^-1的5-ALA試驗濃度區間相似^{［11，20］}。

細胞膜在應對低溫脅迫中起著至關重要的作用^［21］，低溫下細胞膜和細胞壁受到損傷，植物體內的活性氧代謝失衡導致細胞膜系統損傷，產生大量的MDA^［22］，植物體通過調節細胞保護酶活性來降低有害物質產生的傷害，SOD、POD和CAT是植物脅迫情況下防御系統的重要保護酶，通過清除細胞內因脅迫產生的活性氧減輕植物在逆境下所受到的傷害。因此植物在逆境下，為了應對細胞的損害，抗氧化酶會升高，相互協作清除活性氧。所以抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性可以體現植物抗寒性的強弱。田永強等^［11］對櫻桃花器官噴施不同濃度的5-ALA試驗結果表明，櫻桃花器官在-2℃的脅迫下，5-ALA可以增加櫻桃花器官抗氧化酶活性，減少活性氧含量，降低膜脂過氧化程度。越來越多的研究表明，外源5-ALA可以通過積極影響光合系統和葉綠素合成，減少活性氧產生和電解質泄漏，減非生物脅迫對植物造成的損害^［23-24］。本研究中，5-ALA處理后的蘋果花器官，在低溫脅迫下MDA含量隨著溫度的下降而上升，隨著濃度的上升而上升；同一個濃度處理下蘋果花器官相對電導率、SOD、CAT、POD的酶活性隨著溫度的下降而上升，在同一個溫度處理下相對電導率、SOD、CAT、POD的酶活性隨著濃度的上升而下降。證實了噴施一定量的外源5-ALA可以顯著降低蘋果花朵的電解質外滲率，抑制MDA的積累，提高抗氧化酶活性保護細胞膜的完整性，提高蘋果花器官對低溫凍害的抵抗性。

差異基因GO功能富集顯示，代謝過程和對刺激的反應、催化活性和轉運蛋白活性、細胞器和膜等富集，明顯與低溫下蘋果花的細胞膜透性和代謝等過程相關，GO富集說明DEGs中與蘋果低溫脅迫相關的基因很多。KEGG通路注釋是對轉錄組產物參與的代謝通路和功能的分析。在白玉蘭和油菜的研究中表明代謝通路、光合作用、植物激素信號轉導、植物-病原相互作用通路是響應低溫脅迫的主要信號通路^［25-26］。Li等^［27］對低溫下衣藻的轉錄組研究表明差異表達基因與蛋白質合成、細胞周期、蛋白激酶磷酸化相關。研究表明草莓通過MAPK信號轉導、淀粉和蔗糖代謝等多種途徑響應低溫脅迫^［28］。董妍玲等^［29］研究表明植物次生代謝物的合成是植物對環境適應的結果，是長期進化的選擇，次生代謝物生物合成能增強抵抗逆境環境的能力。本研究中KEGG注釋結果表明，植物激素信號轉導、MAPK信號通路、淀粉和蔗糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉化、苯丙烷類代謝和植物病原相互作用是前6個DEGs最多表達的信號通路，在蘋果花低溫處理下發揮功效。轉錄組分析說明，在-4℃的環境下，5-ALA處理和對照的相關抗性和免疫基因有所應答。誘導 EXPA1的表達水平，可提高植物細胞壁的結構穩定性，增強蘋果的防御能力^［30］。DREBs，一種植物特異性TF家族，在抗逆性中起著關鍵作用，TaDREB3-AI的過表達提高了轉基因擬南芥對干旱、鹽和冷熱脅迫的耐受性^［31］。MdCPK1a在煙草中的過表達可以通過減少ROS積累和調節應激相關基因的表達來提高抗寒性。研究表明，質膜定位蛋白激酶 CRPK1（冷反應蛋白激酶1）通過經典CBF途徑在調節擬南芥過度的冷反應中起負作用^［32-33］。而 ADF5是低溫負調控基因，ADF5在冷應激條件下被誘導了20倍^［34］。GSTU17基因響應非生物脅迫具有多種調控機制^［35］。MDL蛋白在調節發育和免疫相關過程中具有較多功能和復雜的相互作用^［36］。TLP1的穩定表達增加了對抗病性^［37］。這些結果與本研究的RT-qPCR驗證（圖8）結果相一致表明，說明使用5-ALA處理下的蘋果花器官，面對-4℃的低溫凍害時，調控相關防御和抗性基因的表達，運行相關蛋白通路，提高抗寒性。

目前為止，5-ALA作為一種植物生長調節劑在植物的很多抗逆方面都起到作用，但是在花朵上的應用較少。蘋果開花授粉的時節容易遇上倒春寒，不僅會影響后面的蘋果授粉受精還會傷害致死蘋果花朵從而影響蘋果園一整年的產量和品質。由研究結果可得，在模擬夜間降溫曲線（圖2）的過程中，-6℃的處理和對照完全褐變凍死；而經由25～50 mg·L^-1的5-ALA處理的蘋果花朵顯示出一定的抗寒性，5-ALA對于蘋果花在-4℃以上的低溫脅迫有一定的緩解作用。但對于緩解效果下子房柱頭的功能性未做探究，低溫凍害緩釋后，蘋果花朵是否還有繼續坐果的能力，因為果園沒有合適的試驗環境，還需要繼續研究。未來也需要繼續探索噴施ALA與抗寒劑或其他激素配合后能否具有更好的抗寒效果，為預防蘋果花期嚴重凍害促進蘋果產業發展提供技術支撐。但對于緩解效果下子房柱頭的功能性未做探究；低溫凍害緩釋后，蘋果花朵是否還有繼續坐果的能力，因為果園沒有合適的試驗環境，還需要繼續研究。另外作為植物抗凍劑，提前噴施5-ALA的天數和次數對植物抗寒性的提高也有不同的影響，在蘋果花開放的具體時期噴施效果也各有不同。孫陽等^［38］在5-ALA處理玉米幼苗24 h后進行48 h的低溫脅迫，田永強等^［11］處理櫻桃花前涂抹直至盛花期進行低溫試驗，王鵬飛等^［39］將5-ALA處理盛花期梨花器官24 h后進行-2℃低溫脅迫。今后還需要進一步試驗獲得最低最適濃度或添加其他抗凍劑后的配合效果，從而增強對極端低溫的抗寒性；并探究噴施5-ALA能提高蘋果花抗凍性的最佳時期，為預防蘋果花期嚴重凍害促進蘋果產業發展提供技術支撐。

4 結 論

5-ALA對低溫脅迫下蘋果花器官的預防緩解作用，噴施一定量的5-ALA可以提高蘋果花朵的抗寒性，減少了低溫凍害造成的褐變，降低了低溫下的蘋果花朵的相對電導率和丙二醛含量，提高了超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性。-4℃低溫脅迫下，5-ALA能誘導蘋果花器官相關抗性基因的表達。在0℃～-4℃低溫脅迫下，以噴施25 mg·L^-1和50 mg·L^-1的5-ALA效果較為顯著，0～100 mg·L^-1的5-ALA不能緩解-6℃的低溫。本研究的結果，可為預防蘋果花期凍害促進蘋果產業發展提供技術支撐，為深入研究花期抗寒性機理提供基礎資料。

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Alleviating Effect of 5-aminolevulinic Acid on Freezing Injury of Apple Flower Organs

LIU Yu¹， ZHAO Ziyan¹， ZHAO Xianfei¹， YU Guokang¹， ZHANG Xinyu¹， LIANG Jie¹， XIE Hongwei²， LI Xuewei¹ and ZHANG Linsen¹

（1.College of Horticulture， Northwest Aamp;F University，Yangling Shaanxi 712100， China;2.Qianyang Fruit Industry Development Center， Qianyang Shaanxi 721100，China）

Abstract This study aims to study the alleviating effect of 5-aminolevulinic acid （5-ALA） on freezing injury in apple blossoms. Fuji apple flower branches were used as experimental materials to investigate the alleviating mechanism of different concentrations of 5-ALA treatments （25 mg·L^-1， 50 mg·L^-1， 75 mg·L^-1 and 100 mg·L^-1） under different temperature stresses （0℃， -2℃， -4℃ and -6℃） on freezing damage to apple styles and ovaries.Water praying was used as a control， and physiological indicators such as relative conductivity，antioxidant enzyme activity， and expression of related resistance genes were measured. The results showed that spraying 25-100 mg · L^-1 of 5-ALA did not alleviate the freezing injury of apple blossoms at -6℃.However，spraying 25 mg · L^-1 to 75 mg · L^-1 of 5-ALA reduced freezing damage to apple styles and ovaries under low temperature stress ranging from -4℃ to 0℃. Compared with the control， spraying 5-ALA significantly alleviated frost damage and browning in flower column houses under low temperature stress.The malondialdehyde （MDA） content in apple flower organs treated with 5-ALA was reduced by 32.16% at -2℃， while the activities of superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， and peroxidase （POD） nearly doubled.The relative conductivity of flowers treated with 5-ALA decreased by 8.7% compared to the control， and the semi lethal temperature decreased by 0℃-1.65℃. In addition， compared to the control， the expression levels of MdADF5， MdTLP1， MdMDL2， MdDREB3， MdGSTU17， and MdEXPA1 in apple flower organs treated with 5-ALA were higher，while expression level of MdCRPK1 was lower.The Gene Ontology （GO） enrichment analysis indicated that the most of the enriched GO terms were related to metabolic processes， catalytic activity， and membranes; the most annotated expressed genes （DEGs） in the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway were distributed in plant hormone signal transduction， MAPK signaling pathway， starch and sucrose metabolism， pentose and glucuronic acid ester conversion， phenylpropanoid metabolism， and plant pathogen interaction， which improved the resistance to low temperature stress during apple flowering. Therefore， spraying 5-ALA before flowering in the Loess Plateau region can effectively alleviate freezing injury in apple flower organs from -4℃ to 0℃， with the optimal concentrations ranging from 25 mg · L^-1 to 50 mg · L^-1.

Key words 5-ALA; Apple flower organs; Freezing tolerance

Received 2023-10-06

Returned 2024-01-05

Foundation item Ministry of Finance and Ministry of Agriculture and Rural Affairs：Modern Agriculture Industry Technology System（No.CARS-27）;Science and Technology Coordination and Innovation Project of Shaanxi Province （No.2015KJZDN Y02-03-02）.

First author LIU Yu， female，master student. Research area：apple physiology and ecology. E-mail：lluyyu0829@163.com

Corresponding author ZHANG Linsen， male，professor，master supervisor.Research area：water and nutrient uptake，physiological ecology of dryland fruit trees. E-mail：linsenzhang@163.com

（責任編輯：潘學燕 Responsible editor：PAN Xueyan）