‘新露’核桃內(nèi)果皮發(fā)育相關(guān)基因JrMYB44和JrMYB13的克隆及表達(dá)分析

摘 要 木質(zhì)素合成是核桃內(nèi)果皮硬化的必要條件，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。克隆核桃木質(zhì)素合成相關(guān)基因 JrMYB44和 JrMYB13的CDS全長(zhǎng)，檢測(cè)這兩個(gè)基因在核桃不同組織器官以及內(nèi)果皮不同發(fā)育時(shí)期硬化與非硬化部位的表達(dá)水平，調(diào)查這兩個(gè)蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明： JrMYB44和 JrMYB13分別編碼319和317個(gè)氨基酸，兩者同源性為39.5%；系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，JrMYB44與Juglans regia×Juglans major雜交核桃和山核桃同源蛋白的親緣關(guān)系較近，而JrMYB13與Juglans regia×Juglans major雜交核桃同源蛋白的親緣關(guān)系較近。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，JrMYB44和JrMYB13均在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。基因表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JrMYB44基因主要在核桃內(nèi)果皮的非硬化區(qū)富集表達(dá)，且在內(nèi)果皮不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平與木質(zhì)素含量呈負(fù)相關(guān)，推測(cè) JrMYB44基因?qū)δ举|(zhì)素合成起負(fù)調(diào)控作用； JrMYB13基因主要在核桃內(nèi)果皮硬化區(qū)富集表達(dá)，且表達(dá)水平隨木質(zhì)素含量增加而上升，推測(cè) JrMYB13基因?qū)δ举|(zhì)素合成起正調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞 核桃；MYB；基因克隆；表達(dá)分析；果皮發(fā)育；木質(zhì)素

核桃（Juglans regia L.）為世界主栽的食用及藥用、木本油料樹種之一^［1］。中國(guó)核桃資源豐富且栽培歷史悠久^［2］，其中新疆得天獨(dú)厚的自然生態(tài)條件使其成為中國(guó)核桃重要產(chǎn)區(qū)之一^［3］。伴隨核桃種植面積的不斷擴(kuò)大及消費(fèi)者對(duì)綜合品質(zhì)要求的提升，培育出仁率高、易機(jī)械脫皮等適于現(xiàn)代深加工的核桃品種已成為當(dāng)前核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要目標(biāo)。然而，目前生產(chǎn)上存在核桃內(nèi)果皮發(fā)育不完整導(dǎo)致露仁的現(xiàn)象^［4］，其外觀品質(zhì)差、清洗過程中污染率和貯藏蟲果率高，嚴(yán)重影響核桃的品質(zhì)和加工利用^［5-6］。木質(zhì)素與核桃內(nèi)果皮發(fā)育緊密相關(guān)。研究表明，核桃內(nèi)果皮的主要成分為木質(zhì)素（Lignin），其含量與內(nèi)果皮的厚度、縫合線緊密度及機(jī)械強(qiáng)度間均顯著正相關(guān)^［7-10］。木質(zhì)素的合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑極其復(fù)雜，有多種酶協(xié)同參與^［11］。近年來，大量研究報(bào)道調(diào)控木質(zhì)素生物合成相關(guān)酶類基因的表達(dá)影響著木質(zhì)素的代謝過程^［12-14］。

目前，NAC、WRKY和MYB等類型的轉(zhuǎn)錄因子已被證實(shí)參與了木質(zhì)素生物合成的調(diào)控^［15］。MYB類轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控植物細(xì)胞次生壁發(fā)育的二級(jí)開關(guān)^［16］，對(duì)植物次生壁的沉積也起到一定的調(diào)控作用。在各類植物中發(fā)現(xiàn)多種MYB轉(zhuǎn)錄因子可以在一定程度上促進(jìn)或抑制次生壁的木質(zhì)素合成，例如，王丹丹等^［17］推測(cè)紅花 CtMYB-TF1通過PKC介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控花青素合成。陸地棉莖稈中 GhMYB4基因參與次生壁木質(zhì)素的合成^［18］。火炬松的PtMYB1和PtMYB4^［19］、擬南芥的AtMYB58和AtMYB63^［20］，以及桉樹的EgMYB2^［21］可以正向調(diào)控木質(zhì)素、半纖維素和纖維素的合成，進(jìn)一步影響植物次生細(xì)胞壁的形成。部分MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物中木質(zhì)素的生物合成起抑制作用，例如，毛果楊的 MYB189基因過表達(dá)時(shí)，楊樹中參與木質(zhì)素、纖維素和木聚糖生物合成的大部分結(jié)構(gòu)基因均顯著下調(diào)；MYB189轉(zhuǎn)錄因子可通過結(jié)合次生壁生物合成基因的啟動(dòng)子抑制其表達(dá)^［22］。在煙草中過表達(dá)金魚草 AmMYB308和 AmMYB330基因，顯著降低了轉(zhuǎn)基因植物中酚酸和木質(zhì)素的含量^［23］；小麥 TaMYB4^［24］以及玉米 ZmMYB46和 ZmMYB31等^［25］基因均在次生壁發(fā)育過程中調(diào)控木質(zhì)素的合成。同一物種的不同MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)木質(zhì)素合成的影響不同。如菊花 CmMYB8過表達(dá)時(shí)，部分編碼木質(zhì)素合成的基因下調(diào)，植物木質(zhì)素含量下降，其木質(zhì)素S/G比值降低，說明CmMYB8蛋白參與木質(zhì)素合成的負(fù)調(diào)控^［26］。菊花 CmMYB15與木質(zhì)素生物合成基因的啟動(dòng)子通過AC元件結(jié)合后，對(duì) CmMYB15過表達(dá)發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素的含量和木質(zhì)素生物合成基因的相對(duì)表達(dá)量增加，說明 CmMYB15對(duì)木質(zhì)素生物合成及木質(zhì)素合成基因表達(dá)起正向調(diào)節(jié)^［27］。綜上所述，不同植物或不同MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)木質(zhì)素合成的調(diào)控作用不同，其調(diào)控機(jī)制有待深入 研究。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析獲得木質(zhì)素相關(guān)合成的MYB差異基因^［28］，本試驗(yàn)以新疆露仁核桃‘新露’為研究對(duì)象，通過克隆核桃內(nèi)果皮中參與木質(zhì)素代謝的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因 JrMYB44和 JrMYB13，分析兩個(gè)基因的序列特點(diǎn)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及在內(nèi)果皮硬化過程的表達(dá)情況，對(duì)核桃內(nèi)果皮硬化過程中木質(zhì)素代謝機(jī)理進(jìn)行初步探索，為進(jìn)一步解析新疆核桃露仁機(jī)制鋪墊研究基礎(chǔ)，為新疆核桃產(chǎn)業(yè)的遺傳改良和提質(zhì)增效提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為新疆露仁品種‘新露’核桃^［29］，采自新疆溫宿縣核桃木本糧油林場(chǎng)，在果實(shí)膨大期后期（6月20日，約花后64 d）至硬核期（7月18日，約花后92 d）采樣，采樣覆蓋整個(gè)核桃內(nèi)果皮硬化期。將內(nèi)果皮剝離（圖1），分為硬化區(qū)（Hardening，H）與非硬化區(qū)（Non-hardening，N）。對(duì)‘新露’核桃結(jié)果枝、花、葉、內(nèi)果皮（硬化與非硬化區(qū)）、外果皮、內(nèi)中（核桃內(nèi)果皮與種仁間白色組織）等不同組織器官進(jìn)行采樣，采樣后將樣品于 -80℃超低溫冰箱中冷凍保存。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的RNA提取試劑盒（RC411-01）提取核桃內(nèi)果皮以及不同組織中總RNA。用賽默飛超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)核酸濃度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）Kit（Takara公司）合成 cDNA。

1.3 JrMYB44和JrMYB13基因克隆

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得差異基因^［28］和NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)篩選出CDS序列，并設(shè)計(jì)引物（表1）。

以‘新露’內(nèi)果皮cDNA為模板，使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司高保真酶（P520-01）與eppendorf AG梯度PCR儀擴(kuò)增目的基因，PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃退火90 s，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min；4℃保存。將目的條帶回收并連接到GFP載體，進(jìn)一步篩選陽性克隆，送至武漢擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 JrMYB44和JrMYB13表達(dá)模式分析

根據(jù)已克隆的核桃內(nèi)果皮MYB基因序列，利用Primer 5.0 軟件在 JrMYB44和 JrMYB13的非保守區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（表2）。使用賽默飛Applied Biosystems QuantStudio 7 進(jìn)行三步法Real-Time PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件： 50℃ 2 min，95℃ 2 min（預(yù)變性）；95℃ 10 s（變性），60℃ 30 s（退火），60℃ 30 s（延伸），40個(gè)循環(huán)。熔解曲線生成步驟：95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后利用2^-△△Ct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 JrMYB44和JrMYB13超表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

采用杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司質(zhì)粒DNA小量試劑盒對(duì)陽性菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，對(duì) JrMYB44和 JrMYB13的連接載體通過反向PCR獲得線性化載體。用南京諾唯贊生物科技股份有限公司同源重組試劑盒（C112-02）進(jìn)行重組反應(yīng)。將10 μL重組產(chǎn)物加入至100 μL的感受態(tài)大腸桿菌中，抽打混勻，冰上靜置30 min后42℃熱激45 s，冰上冷卻2 min。加入1 mL的無抗性LB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫?fù)u菌床220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。在含有100 mg/L 卡那的LB固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)12 h并篩選陽性菌斑，菌液PCR驗(yàn)證后測(cè)序。菌液PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min;95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸 5 min;16℃保溫。將帶有載體的菌液轉(zhuǎn)入本氏煙草培養(yǎng)3 d，用尼康A(chǔ)1RHD25amp;N-SIM激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘新露’核桃JrMYB44和JrMYB13的生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果表明，JrMYB44長(zhǎng)度為957 bp，編碼319個(gè)氨基酸（圖2-a），JrMYB13長(zhǎng)度951 bp，編碼317個(gè)氨基酸（圖2-d）。經(jīng)Expasy ProtParam預(yù)測(cè)，JrMYB44分子質(zhì)量為3 4670.86 ku、理論等電點(diǎn)（PI）為9.04，分子式為C₁₄₉₉H₂₃₉₆N₄₄₄O₄₈₀S₁₁，原子總數(shù)為4 830，帶正電荷殘基數(shù)為35、帶負(fù)電荷殘基數(shù)為30，脂肪系數(shù)為69.12，蛋白質(zhì)半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為51.32，該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。JrMYB13分子質(zhì)量為35 532.69 ku、理論等電點(diǎn)（PI）為5.30，分子式為C₁₅₅₃H₂₃₈₇N₄₃₇O₄₈₈S₁₇，原子總數(shù)為4 882，帶正電荷殘基數(shù)為26、帶負(fù)電荷殘基數(shù)為38，脂肪系數(shù)為67.67，蛋白質(zhì)半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為61.28，該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。

利用ExPasy預(yù)測(cè)JrMYB44、JrMYB13的親疏水性（圖2-b、圖2-e），JrMYB44在第81個(gè)氨基酸處疏水性最強(qiáng)；在203、204個(gè)氨基酸處親水性最強(qiáng)；蛋白總平均親水性（GRAVY）為-0.584，該蛋白為親水性蛋白。JrMYB13在第272個(gè)氨基酸處，正值為1.744，疏水性最強(qiáng)；在第32個(gè)氨基酸處，親水性最強(qiáng)，負(fù)值為-2.222，蛋白總平均親水性（GRAVY）為-0.576，該蛋白為親水性蛋白。利用TMHMM ServerV.2.0在線預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示兩轉(zhuǎn)錄因子均無跨膜結(jié)構(gòu)。

通過PSIPRED在線軟件預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示JrMYB44蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由34.17%的α螺旋、0.63%延伸鏈以及65.20%無規(guī)則卷曲組成。JrMYB13蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由34.70%的α螺旋、0.95%延伸鏈以及64.35%無規(guī)則卷曲組成。利用SWISS-MODEL對(duì)JrMYB44和JrMYB13蛋白進(jìn)行三維建模（圖2-c、圖2-f），結(jié)果顯示，兩種蛋白結(jié)構(gòu)均以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)原件。

2.2 ‘新露’核桃JrMYB44和JrMYB13蛋白進(jìn)化 分析

將JrMYB44、JrMYB13蛋白與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行序列同源性比對(duì)，核苷酸序列相似性顯示JrMYB44與雜交核桃（ XP_040996771.1 ）、美國(guó)山核桃（XP_042963113.1）同源性較高，相似性分別為98.43%，93.79%；JrMYB13與雜交核桃（XP_040986679.1）同源性較高，相似性為 98.11%。

經(jīng)過Basic Local Alignment Search Tool Protein比對(duì)，發(fā)現(xiàn)JrMYB44蛋白與其他植物的MYB44蛋白具有較高的同源性，選取蛋白序列高度相似的植物構(gòu)建MYB基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3-a），通過MEGA 7.0進(jìn)行序列比對(duì)，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，JrMYB44與雜交核桃、美國(guó)山核桃聚為一類；JrMYB13與其他植物蛋白同源性較高，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3-b），JrMYB13與雜交核桃聚為一類，表明核桃屬間同源蛋白存在較近的親緣關(guān)系。

2.3 ‘新露’核桃JrMYB44和JrMYB13 亞細(xì)胞定位

首先在Plant-mPLoc網(wǎng)站對(duì)JrMYB44和JrMYB13進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因均定位在細(xì)胞核內(nèi)（圖4-a、圖4-b）。通過亞細(xì)胞定位，根據(jù)熒光形態(tài)明場(chǎng)位置判斷，紅色熒光與綠色熒光重疊，JrMYB44和JrMYB13蛋白的熒光信號(hào)定位在細(xì)胞核內(nèi)，表明JrMYB44和JrMYB13能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。

2.4 ‘新露’核桃 JrMYB44和 JrMYB13組織特異性表達(dá)及不同時(shí)期核桃內(nèi)果皮表達(dá)分析

不同組織中，JrMYB44相對(duì)表達(dá)量在核桃內(nèi)果皮非硬化區(qū)中顯著高于其他組織（圖5-a）。不同時(shí)期 JrMYB44在核桃內(nèi)果皮非硬化部位相對(duì)表達(dá)量顯著高于硬化部位（圖5-b），花后64～ 92 d為核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素合成關(guān)鍵時(shí)期，花后 64 d‘新露’核桃內(nèi)果皮出現(xiàn)硬化區(qū)與非硬化區(qū)，JrMYB44在硬化區(qū)相對(duì)表達(dá)量為1.021，非硬化區(qū)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到0.467，花后64 d木質(zhì)素逐漸積累，非硬化區(qū) JrMYB44相對(duì)表達(dá)量顯著高于硬化區(qū)，花后71～ 92 d‘新露’核桃內(nèi)果皮硬化區(qū)與非硬化區(qū)的分區(qū)明顯并在非硬化區(qū)高表達(dá)，非硬化區(qū)相對(duì)表達(dá)量在花后78 d最高為2.324，并和71d-N、71d-H、92d-H差異極顯著。結(jié)果分析推測(cè) JrMYB44在核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素合成代謝途徑中起負(fù)調(diào)控作用。

核桃內(nèi)果皮硬化區(qū) JrMYB13相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織，為33.3（圖5-c）。在不同時(shí)期核桃內(nèi)果皮硬化與非硬化部位 JrMYB13相對(duì)表達(dá)量均高于非硬化區(qū)并且差異極顯著（圖5-d），硬化區(qū) JrMYB13相對(duì)表達(dá)量顯著高于非硬化區(qū)，“新露”核桃內(nèi)果皮出現(xiàn)硬化狀態(tài)，JrMYB13在非硬化區(qū)相對(duì)表達(dá)量較低為0.370，硬化區(qū)相對(duì)表達(dá)量顯著高于非硬化區(qū)為15.316。花后 71～92 d‘新露’核桃內(nèi)果皮硬化區(qū)與非硬化區(qū)分區(qū)明顯并在硬化區(qū)高表達(dá)，在花后71 d、78 d、92 d的硬化區(qū)相對(duì)表達(dá)量分別為59.167、39.312、16.916。由此推測(cè) JrMYB13在核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素合成代謝途徑中起正調(diào)控作用。

2.5 內(nèi)果皮不同發(fā)育時(shí)期的木質(zhì)素含量及其與JrMYB44、JrMYB13基因的相關(guān)性分析

如圖6所示，隨著核桃內(nèi)果皮不斷分化，核桃內(nèi)果皮硬化區(qū)木質(zhì)素含量總體呈上升狀態(tài)，說明核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中木質(zhì)素不斷累積。除71d-H與78d-N之間無差異外，其余時(shí)期硬化區(qū)與非硬化區(qū)均有極顯著差異。在花后64 d、71 d的非硬化區(qū)，隨著 JrMYB44相對(duì)表達(dá)量不斷增加、JrMYB13相對(duì)表達(dá)量忽略不計(jì)，非硬化區(qū)木質(zhì)素含量逐漸降低；在花后64 d、71 d的硬化區(qū)，隨著 JrMYB44表達(dá)量降低、JrMYB13表達(dá)量升高并在花后71 d表達(dá)量達(dá)到最高值，非硬化區(qū)木質(zhì)素含量在逐漸上升；花后78 d時(shí) JrMYB44表達(dá)量在兩部分均升高且非硬化區(qū)高于硬化區(qū)，JrMYB13在非硬化區(qū)升高、在非硬化區(qū)下降，木質(zhì)素含量在非硬化區(qū)高于硬化區(qū)；花后92 d時(shí)，非硬化區(qū)木質(zhì)素含量達(dá)到最低值，JrMYB44表達(dá)量在硬化區(qū)急劇下降、表達(dá)量低于 JrMYB13表達(dá)量，且木質(zhì)素含量在硬化區(qū)達(dá)到整個(gè)時(shí)期最高值。對(duì)內(nèi)果皮不同發(fā)育時(shí)期的木質(zhì)素含量與 JrMYB44、JrMYB13基因的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（表3），JrMYB44基因在非硬化區(qū)與木質(zhì)素呈正相關(guān)，在非硬化區(qū)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè) JrMYB44基因負(fù)調(diào)控木質(zhì)素合成；而 JrMYB13與之相反，在硬化區(qū)與木質(zhì)素呈正相關(guān)，推測(cè) JrMYB13正向調(diào)控木質(zhì)素合成。

3 討論與結(jié)論

該研究利用得到的‘新露’核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫序列信息，關(guān)注在植物研究中數(shù)量最大、功能最多、積極參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝調(diào)控、生物和非生物脅迫應(yīng)答的 R2R3-MYB基因^［30］。選取差異表達(dá)基因 JrMYB44、JrMYB13，通過克隆獲得了新疆核桃露仁品種‘新露’的 JrMYB44、JrMYB13 CDS全長(zhǎng)序列，利用生物信息學(xué)對(duì) JrMYB44、JrMYB13兩轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)、親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。構(gòu)建JrMYB44、JrMYB13系統(tǒng)發(fā)育樹、超表達(dá)載體，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位，分析 JrMYB44、JrMYB13基因的進(jìn)化關(guān)系及其在核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中在不同組織器官特異表達(dá)與不同發(fā)育時(shí)期硬化與非硬化區(qū)的相對(duì)表達(dá)特性與木質(zhì)素含量。結(jié)果表明，JrMYB44與雜交核桃和美國(guó)山核桃的同源性較高，JrMYB13與雜交核桃同源性較近，且兩蛋白均定位在細(xì)胞核內(nèi)。核桃內(nèi)果皮非硬化區(qū)木質(zhì)素含量隨著 JrMYB44的相對(duì)表達(dá)量的上升而增加，硬化區(qū)木質(zhì)素含量與 JrMYB44的相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；而 JrMYB13相對(duì)表達(dá)量與木質(zhì)素含量相關(guān)性與 JrMYB44相反。

在煙草中對(duì)甘薯轉(zhuǎn)錄因子 IbMYb44瞬時(shí)表達(dá)后發(fā)現(xiàn) IbMYb44可減少花青素累積，并與 IbMYB340、IbNAC56a、IbNAC56b相互作用，成為甘薯中花青素的阻遏物^［31］。馬鈴薯StMYB44s通過高溫脅迫負(fù)調(diào)控花青素生物合成并上調(diào)了了苯丙烷、木質(zhì)素途徑^［32］。對(duì)不結(jié)球大白菜BcMYB44亞細(xì)胞定位顯示是一種核蛋白^［33］，這與該研究的JrMYB44定位結(jié)果一致。BcMYB44對(duì)花青素合成的調(diào)控發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄因子抑制木質(zhì)素合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因 F3H的表達(dá)，并發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用^［30］。煙草內(nèi)超表達(dá)野菊CiMYB44后其木質(zhì)素含量與纖維素含量均下降^［34］。定量分析顯示 JrMYB44基因在不同組織與不同時(shí)期核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中硬化與非硬化組織中均有表達(dá)，且具有顯著差異，并在幼嫩組織與非硬化區(qū)高表達(dá)，木質(zhì)素含量在非硬化區(qū)整體呈下降趨勢(shì)，JrMYB44基因?qū)δ举|(zhì)素的積累有負(fù)調(diào)控作用，與 BcMYB44研究結(jié)果相一致。MYB13受脫水、外源 ABA 的調(diào)控，可在發(fā)育花的莖尖和基部檢測(cè)到^［35-36］，表明它在芽形態(tài)發(fā)生中的潛在作用。在這項(xiàng)研究中，MYB13在樹皮和處理莖中上調(diào)。在擬南芥AtMYB13中通過Northern印跡分析證實(shí)了其表達(dá)模式^［37］，本研究JrMYB13與該研究AtMYB13結(jié)果相一致。在苦蕎中對(duì)FtMYB13進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)FtMYB13不是轉(zhuǎn)錄活性的激活劑，而是位于細(xì)胞核中，這與 JrMYB13定位在細(xì)胞核中的結(jié)果相一致。定量結(jié)果顯示 JrMYB13基因在不同組織中、不同時(shí)期核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中硬化區(qū)與非硬化區(qū)中均表達(dá)，且差異顯著，并在硬化區(qū)高表達(dá)，木質(zhì)素含量在硬化區(qū)整體呈上升趨勢(shì)，JrMYB13基因?qū)δ举|(zhì)素的積累有正調(diào)控作用。

該研究結(jié)果有助于進(jìn)一步探究 JrMYB44、JrMYB13在‘新露’核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中所起作用，為揭示新疆核桃露仁的分子機(jī)理鋪墊理論基礎(chǔ)。為進(jìn)一步探索兩轉(zhuǎn)錄因子在核桃內(nèi)果皮發(fā)育中的作用，后續(xù)可進(jìn)行異源或本體植物遺傳轉(zhuǎn)化，以及相關(guān)基因、蛋白互作機(jī)制的探索研究。綜上，對(duì)新疆露仁核桃內(nèi)果皮發(fā)育的研究非常重要，尤其是內(nèi)果皮中木質(zhì)素合成相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制已成為核桃育種基礎(chǔ)研究中亟待解決的問題。通過克隆和調(diào)控木質(zhì)素合成的 JrMYB44、JrMYB13因子，改變核桃內(nèi)果皮中木質(zhì)素的含量和組成，為核桃內(nèi)果皮中木質(zhì)素的合成與代謝提供理論依據(jù)，為今后核桃內(nèi)果皮中轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)克隆、功能驗(yàn)證等分子育種工作奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis of JrMYB44 and JrMYB13 Genes in Endocarp of ‘Xinlu’ Walnut

FU Jiazhi ¹，GUO Zhongzhong²，YU Shangqi² ，WU Pengyu ¹，HU Haifang³ and ZHANG Rui¹

（1.Tarim University， Key Laboratory of Tarim Basin Biological Resources Protection and Utilization Corps of Xinjiang Production and ConstructionCorps， National and Local Joint Engineering Laboratory of Fruit Tree Production in Southern Xinjiang， Alar Xinjiang 843300，China; 2.Tarim University， Key Laboratory of Tarim Basin Biological Resources Protection and Utilization of Xinjiang Production and Construction Corps， National and Local Joint Engineering Laboratory for Production of Characteristic Fruit Trees in Southern Xinjiang，Alar Xinjiang 843300，China; 3. Xinjiang Academy of Forestry， Xinjiang Jiamu Fruit Science National Long-term Research Base， Urumqi 830000，China）

Abstract Lignin synthesis is indispensible for endocarp sclerosis in walnut;however，its regulatory mechanism remains elusive. In this study， we successfully cloned the coding sequences （CDS） of two lignin synthesis-related genes， JrMYB44 and JrMYB13， which were closely associated with lignin synthesis in walnut. We conducted comprehensive analysis to determin the expression levels of these genes in different tissues and organs of walnut， as well as in both sclerotized and non-sclerotized parts of the endocarp during different developmental stages， and we also investigated the subcellular localization of these two proteins.The results showed that： JrMYB44 and JrMYB13 encoded 319 and 317 amino acids，respectively， and the two proteins showed a homologous of 39.5%. Phylogenetic tree analysis revealed that JrMYB44 was close to the homologous proteins of Juglans regia×Juglans major hybrid walnut and pecan， while JrMYB13 was only close to the homologous proteins of Juglans regia×Juglans major hybrid walnut. Subcellular localization result showed that both JrMYB44 and JrMYB13 were expressed in the nucleus. Gene expression investigation revealed that the JrMYB44 gene was mainly expressed in the non-sclerotized zone of walnut endocarp， and its expression level at different developmental stages of endocarp was negatively correlated with the lignin content. Therefore， the JrMYB44 gene would play a negative role in lignin synthesis. By contrast， the JrMYB13 gene was mainly expressed in the sclerotized zone of walnut endocarp and its expression level increased along with the increase of lignin content，indicating that the JrMYB13 gene might play a positive role in lignin synthesis.

Key words Walnut; MYB; Gene cloning; Expression analysis;Fruit development; Lignin

Received 2022-10-07

Returned 2022-12-27

Foundation item The National Natural Science Foundation of China （No.32160698）; Construction for Scientific Research Conditions of South Xinjiang Horticultural Research Center （No.TDZKKY202204）; Research and Innovation Project of Graduate Students in Tarim University （No.TDGRI201916）.

First author FU Jiazhi，female，master student.Research area：high-quality and high-efficiency cultivation and molecular plant breeding in walnut. E-mail：2943729512@qq.com

Corresponding author ZHANG Rui， female， professor. Research area：high-quality and high-efficiency cultivation and molecular plant breeding in walnut. E-mail：zhrgsh@163.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）