新疆主要釀酒葡萄種質資源的SSR標記分析及數字指紋構建

摘 要 新疆釀酒葡萄種質資源豐富，存在遺傳背景復雜及品種混雜等問題，為有效區分和合理利用新疆主栽釀酒葡萄種質資源，匯集新疆110份種質為試材，利用篩選出多態性好的SSR引物進行PCR擴增，對多態性、遺傳多樣性和遺傳距離進行分析，并構建種質數字指紋。結果表明：從76對SSR引物中篩選出30對多態性豐富的引物，共擴增出等位基因位點391個，多態率高達97.164%，其中引物VVIV67條帶數最多，為22條。各位點平均觀測雜合度（Ho）為0.671，期望雜合度（He）為0.790，Shannon多樣性指數（I）在1.142～ 2.627，PIC平均值為0.766。遺傳距離變化主要在0.500～1.000，占整體的92.399%。聚類樹將供試材料分為6組，其中第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組多來源于由法國、蘇聯、美國、意大利等國家引進的釀酒葡萄品種，第Ⅳ、Ⅴ組多來源于中國山葡萄品種種間和種內雜交種；第Ⅵ組基本為中國自主選育的山葡萄品種。數字指紋能夠將各種質進行準確鑒定，其中‘11-22-16’和‘12-10-60’‘克里木波西’和‘赤霞珠170’‘蓋吾沙’和‘塔夫里斯’‘紫晶夢露’和‘1-5-7’可能存在同物異名。新疆主栽釀酒葡萄SSR位點豐富，可用性較強，試材具有豐富的遺傳多樣性，可為釀酒葡萄種質資源利用和品種選育提供參考依據。

關鍵詞 釀酒葡萄；SSR標記；遺傳多樣性；種質資源；數字指紋

葡萄是葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vinis L.）中的重要果樹，種類繁多，具有悠久的栽培歷史，可用作鮮食、釀酒、制汁和制干等，具有較高的營養和經濟價值^［1］。新疆晝夜溫差大，日照時間長，所栽植的釀酒葡萄具有含糖度高、酸度適中、色澤飽滿等特點^［2］。釀酒葡萄隨著選育和審定的品種數量逐年增多，存在親緣關系不明確的現象，并且中國現栽植的釀酒葡萄品種中多數是由歐洲一些國家引進，其群體結構和遺傳背景復雜。不同種間及種內雜交的品種在表型性狀、生理機制和遺傳機理等方面存在較大差異，而利用傳統的形態學鑒定方法確定種類、親緣關系存在較大局限性^［3］。在苗木生產、知識產權保護和葡萄酒鑒偽等方面，進行種質鑒定也是葡萄酒產業規范發展和質量監控的關鍵。因此，研究葡萄種質資源遺傳多樣性及數字指紋構建，對葡萄育種、種質資源管理及其保護等方面意義重大。

隨著現代生物技術的快速發展，以分子標記對物種進行遺傳多樣性分析相較于傳統的形態學標記更為直接和精確。SSR分子標記是一種基于SSR序列設計、PCR擴增和電泳分離的DNA標記方法，具有高多態性、共顯性遺傳、高重復性、數量多等優點，目前，在葡萄品種鑒別、遺傳多樣性研究、群體結構分析、關聯定位和遺傳圖譜構建等領域已經得到廣泛應用^［4］。Zhong等^［5］隨機選擇44對SSR引物通過PCR進行驗證，區分出了不同Munake品種基因型。Rodrigues^［6］采用18個SSR標記，找出了赤霞珠的親本為Danugue noir（Vitis vinifera L.）。Mihaljevic等^［7］利用SSR標記分析了克羅地亞葡萄的遺傳多樣性，發現存在大量混雜品種和同物異名。

不同產區在相互引進過程中或對大量葡萄品種進行管理時，易發生同物異名、同名異物等品種混淆問題。通過分子標記技術構建釀酒葡萄種質資源的數字指紋，能夠改善釀酒葡萄品種混雜，避免重復性收集和保存，有利于釀酒葡萄育種和種質管理^［8］。Dong等^［9］利用多態性葡萄的有序編碼轉換構建分子身份證，結果發現利用SSR標記進行釀酒葡萄種質資源鑒定和保護是可行的。杜晶晶^［10］利用9對引物構建分子身份證，對80份葡萄種質進行有效區分。Augusto等^［11］利用6個SSR和52個SNP位點擴增產生的遺傳圖譜，鑒定了280個樣本。利用數字指紋對釀酒葡萄品種進行溯源，能夠保障釀酒葡萄良種的選擇和純正性，有利于保護知識產權和為新品種選育提供資源。綜上所述，SSR標記與數字指紋構建已在葡萄種質資源遺傳多樣性、種質鑒定等領域起到了重要作用。新疆釀酒資源豐富，但未對其進行遺傳多樣性分析和品種鑒定。為了對新疆主要種質資源進行精準鑒定和評價，本研究在篩選出適用于釀酒葡萄的SSR引物基礎上，對110份釀酒葡萄種質資源進行遺傳多樣性水平分析，明確種質間的遺傳距離和群體結構，并建立數字指紋進行品種鑒別，為葡萄種質資源的鑒別、管理和分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的110份釀酒葡萄種質的試驗材料采自新疆中信國安葡萄酒業有限公司、昌吉州昌吉市三工鎮、烏魯木齊市頭屯河區三坪農場新疆農業大學實習基地和新疆林科院佳木果樹學長期科研基地，供試種質由中國農科院特產研究所、新疆中信國安葡萄酒業有限公司和課題組雜交所得中間型（表1）。2023年6月底采集各葡萄種質的新梢幼嫩葉片，每品種取10～15片葉，擦拭葉面灰塵，按品種分別裝入預先編號的錫紙中，放入液氮速凍并保存于-80℃超低溫冰箱中，備測。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及SSR引物的選擇 參照王軍等^［12］改良CTAB法，進行葉片基因組DNA提取，采用Nanodrop ND-2000核酸蛋白儀（Thermo，美國）檢測提取的DNA溶液濃度與純度，根據檢測結果將DNA溶液終濃度稀釋至30 ng/μL，置于-20℃冰箱保存，備用。試驗參照葡萄公共遺傳圖譜NCBI及文獻［10，13-16］中的76對SSR引物進行篩選分析，最終確定30對引物應用于本研究，引物序列信息見表2，所用引物均由武漢天一華煜基因科技有限公司合成。

1.2.2 PCR擴增及電泳 PCR擴增反應在Veriti384 PCR儀（Applied Biosystem）上進行。PCR擴增體系總體積為10.0 μL，其中包括2×Taq PCR Master Mix（Gene Tech） 5.0 μL、基因組DNA（～20 ng） 1.0 μL、上游引物（濃度10 pmol/μL） 0.5 μL、下游引物（濃度10 pmol/μL） 0.5 μL、ddH₂O 3.0 μL；擴增程序設置為95℃預變性5 min、95℃變性30 s，62℃～52℃梯度退火30 s，72℃延伸30 s，運行10個循環；95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，運行25個循環；72℃延伸20 min，最后4℃保存。PCR反應結束后，擴增產物經熒光毛細管電泳檢測。為確保熒光PCR擴增的特異性和上機檢測樣本的濃度均一性，熒光PCR擴增完成后，在電泳槽 DYY-6C 型（北京六一）上進行PCR產物檢測，取2 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（1%濃度），通過PCR產物的帶型來判斷各SSR引物擴增的特異性，通過PCR產物條帶的亮度來判斷各SSR引物的擴增效率，按照樣本上機檢測濃度要求，對各熒光PCR產物進行稀釋，得到濃度均一的熒光PCR產物，安排上測序儀（ABI3730XL，Applied Biosystem）進行檢測。

熒光毛細管電泳檢測：將稀釋至統一濃度的熒光PCR產物加至上機板中，并按以下體系分別加入上機檢測試劑：熒光PCR產物 1.0 μL、GeneScan^TM500 LIZ（Applied Biosystem） 0.5 μL、Hi-Di^TM Formamide（Applied Biosystem） 8.5 μL；將加好樣本和試劑的待檢測板離心后放到PCR儀上運行變性程序（95℃，3 min），變性完成后立即冷卻；參照ABI3730XL上機操作流程，選擇待與檢測板名稱對應的檢測文件，運行SSR樣本分析檢測程序。

1.3 數據統計與分析

從ABI3730XL儀器上獲取原始數據，按檢測位點進行分類歸檔后，分別導入到GeneMarker 2.6.3分析軟件中，進行基因型數據的讀取。利用Microsoft Excel 2016進行數據統計，數據編碼采用0/1系統，即將有帶記為1，無帶記為0。用Popgene 1.32軟件^［17］計算有效等位基因（Ne）、Shannon多樣性信息指數（I）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態性信息含量（PIC）。利用Powermaker 3.25軟件^［18］計算110份葡萄個體間的Nei’s遺傳距離后，用MEGA 7.0軟件^［19］基于Nei’s遺傳距離構建110份葡萄種質資源的NJ聚類樹（Neighbor-joining Tree），使用iTOL在線工具（https： //itol.embl.de/）進行系統發生樹的編輯和美化。

根據每對引物在不同品種上擴增的等位基因數進行賦值，賦值方法參考Dong等^［9］的方法：將每個引物擴增出的條帶從小到大排序，每個條帶分別對應阿拉伯數字0～9，代表該條帶在該引物所有條帶中的次序；當條帶大于9時，使用字母 A～Z進行賦值；若某引物在某一品種上無擴增條帶，則賦值為0；若某引物在一個品種上擴增出多個條帶，則選取其中最小的條帶次序為該品種的數字編碼。

2 結果與分析

2.1 多態性分析

從76對引物中篩選出30對引物用于葡萄材料的SSR擴增（表3），擴增的譜帶清晰，且多態性豐富（圖1）。在30對引物中，擴增條帶數最少的引物為SCU11VV，擴增出的條帶為4條；擴增條帶最多的引物為VVIV67，為22條。擴增產物長度在119～407 bp之間，主要集中于154～268 bp。30對SSR引物在110份葡萄資源中擴增的等位基因組成中稀有、共有、常見等位基因平均分別為3.400個、8.233個和1.400個。

在30對引物中共檢測到391個等位基因，每對引物擴增條帶為4（SCU11VV）～22條（VVIV67），平均值為13.033個。其中多態性位點385個，多態率達97.164%，可以將不同的種質材料有效區分與鑒定，表明所選SSR引物遺傳多態性高，為釀酒葡萄品種鑒定作出貢獻。

2.2 110份釀酒葡萄種質的遺傳多樣性分析

如表4所示，Popgene分析結果表明，各引物的有效等位基因數（Ne）在2.473（VrZAG7）～11.581（VMC3G9），觀測雜合度（Ho）為 0.298（UDV-134）～0.843（VVMD62），平均Ho為0.671；期望雜合度（He）為0.596（VrZAG7）～0.914（VMC4H5），平均He為0.790。Shannon多樣性指數（I）為1.142（SCU11VV）～2.627（VMC4H5），平均I為1.925。其中，在30對引物中，VRZAG15、VVC62和VVMD62的Ho在0.8以上，說明這3對引物擴增出的基因型豐富，并且多態性較高。

根據Botstein等^［22］提出衡量基因變異程度高低的多態性信息含量指標，PICgt;0.5、0.25lt;PIClt;0.5、PIClt;0.25時分別為高度、中度和低度多態性。本研究中PIC變幅在0.568～0.907，平均為0.766，均為高度或中度多態性信息引物。

2.3 110份葡萄種質遺傳距離及聚類分析

對110份葡萄種質資源進行Nei’s遺傳距離分析，遺傳距離主要分布在0.500～1.000，占整體的92.399%（圖2）。其中，22.537%為 0.6～0.7，28.638%為0.7～0.8，19.737%為0.8～ 0.9。利用MEGA 7.0軟件對110份供試材料進行聚類分析，構建了NJ聚類樹（圖3）。發現110份葡萄被分為6組，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組多來源于

由法國、蘇聯、美國、意大利等國家引進的釀酒葡萄品種，第Ⅳ、Ⅴ組多來源于中國山葡萄品種種間或種內雜交種；第Ⅵ組基本為中國自主選育的山葡萄品種。

2.4 數字指紋構建

PCR擴增得到的產物經毛細管電泳分離并進行條帶分析，可得到擴增片段的大小，獲得30對SSR引物對110份釀酒葡萄種質擴增的數字指紋數據，結果見表5。根據賦值標準可知，不同采樣區的同一品種的位點長度相同，表明利用此方法能夠準確區分和鑒定不同種質資源。除‘12-6-42’品種，其余種質均有擴增出條帶，但‘11-22-16’和‘12-10-60’，‘克里木波西’和‘赤霞珠170’，‘蓋吾沙’和‘塔夫里斯’，‘紫晶夢露’和‘1-5-7’的數字指紋號碼相同，表明這些種質之間在同一個位點擴增出的等位基因長度一致，還需進一步關聯性狀進行驗證。

3 討 論

不同地理環境和生態條件是引起葡萄種群分化的直接因素，在進行種群劃分時也主要以植物個體的相似程度，包括形態結構、生理功能等作為依據。本研究供試的110份釀酒葡萄材料包含歐亞種、歐美種、山葡萄、山歐雜種等遺傳背景差異較大的材料，也包含全同胞或半同胞子代選育而成的親緣關系極為相近的材料，這些釀酒葡萄種質資源中有自主知識產權品種和國外引進的重要種質資源。因此，本研究的試材在一定程度上體現了中國釀酒葡萄種質資源的現狀，具有較好的代表性。

在物種起源、形成和遺傳變異的研究中，SSR與RAPD、RFLP、AFLP等一代分子標記技術相比，所需DNA量更少，讀帶更準確，多態性高且能夠獲得更多的信息量，因此在植物遺傳學產生重大積極影響，符合植物育種和群體遺傳計劃的要求^［23-24］。本研究從76對引物中篩選出30對能擴增出清晰穩定條帶的引物，共檢測出391個等位基因，每對引物擴增條帶4（SCU11VV）～22（VVIV67）條，平均每對引物擴增條帶為 13.033條，表明VVIV67引物鑒別能力較強，與趙旗峰等^［16］的研究結果一致；并且多態率（PPB）為 97.164%，其中稀有等位基因（lt;1%）平均 3.400個，說明供試材料基因型呈現多樣化特征。

遺傳多樣性是物種遺傳變異的總和，反映物種在特定環境中的基因豐富程度，對研究物種的起源、適應能力、基因資源基因保護、植物育種、基因改良等提供依據^［25］。等位基因數（Na）表示群體中等位基因的豐富程度及其變異程度，有效等位基因數（Ne）反應群體中的基因頻率，兩者數值越接近，說明等位基因在群體中分布越均勻^［26］。本研究中SCU14VV的Ne最少，為 2.663個；SCU11VV、UDV-033、VMC3G9和VMC4H5的Na與Ne數值較接近，表明這4對引物等位基因的基因頻率在群體中分布較均勻。觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）分別反映某一位點雜合子在樣本中所占比例的實際觀測值和期望值，雜合度越高，該位點處的基因型越多，遺傳變異越豐富^［27］。本研究中Ho為0.298～0.843，平均為0.671；He為0.596～0.914，平均為0.790，不同位點雜合度差異較大，平均Ho低于He，表示種群內存在一定的近交率，與王衍莉等^［28］對73份山葡萄及雜交后代的遺傳多樣性研究結果相似。PIC值可以直接反映種群中引物的多態性以及區分基因型的能力，能夠有效地分析樣本之間的遺傳差異。本研究中PIC變幅為0.568～0.907，平均為0.766，高于王月暉^［29］、牛早柱^［30］、Khadivi 等^［31］研究中PIC值，說明30個SSR引物在供試群體中均具有高度的多態性。

遺傳距離能夠直觀地反映群體親緣關系，親緣關系越近，遺傳距離越小。本研究基于遺傳距離進行聚類分析，將110份葡萄分為6組，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組為由法國、德國、奧地利、意大利等國家引種的歐亞種葡萄，Ⅳ、Ⅴ組為中國山葡萄種內或種間雜交種，Ⅵ組為中國自主選育的山葡萄，可明顯區分山葡萄和歐亞種，且遺傳距離較遠，與吳子龍^［13］、方連玉等^［14］的研究結果一致。同時，還發現歐亞種的‘白艮地’和‘霞多麗’‘白詩南’和‘雷司令’，‘小芒森’和‘小味兒多’，‘克里木波西’和‘赤霞珠170’‘愛費立奧’‘煙73’和‘捏布蓋’赤霞珠品系（‘赤霞珠’‘赤霞珠1’‘赤霞珠191’）和‘梅鹿輒’‘馬瑟蘭’等亞類分支與中國自主選育抗寒品種（‘北馨’‘北玫’‘北璽’‘北紅’‘2-5-8’和‘紫晶甘露’‘1-5-7’和‘紫晶夢露’）等亞類分枝遺傳距離較近，表明在實現優良性狀的育種目標時，會導致釀酒葡萄遺傳背景變窄，而在育種中不斷擴展遺傳基礎是釀酒葡萄育種的重要舉措。

數字指紋將SSR指紋圖譜進行數字化轉換，從而更加直觀、簡明地說明相關特征。指紋圖譜具有高度的個體或基因型特異性，高分辨率，可準確鑒定物種個體和群體^［32］。利用該技術在棗^［33］、杏^［34］、葡萄^［35］、核桃^［36］等經濟林上均有報道。目前數字指紋構建采用的編碼方法主要有3類：第1類^［37］是按照等位基因從大到小排列后，將有條帶的賦值為1，無條帶的賦值為0，獲得每份試材的數字編碼；第2類^［38］是先將每對引物在某一樣品上擴增出的每一種帶型從小到大排序，而后用阿拉伯數字1～9編碼，帶型數9個以上，依次用a、b、c進行編碼。不同SSR引物的擴增條帶按從小到大順序排列，分別賦值后編碼；第3類^［39］是根據擴增產物的等位標記堿基長度串聯形成一組數據。本研究利用第2類方法對釀酒葡萄種質建立數字指紋，便于使用者快速獲取用于區分供試釀酒葡萄種質的相關信息。然而，本研究尚未覆蓋所有釀酒葡萄種質資源，仍需進一步研究進行補充和完善。研究結果中，各品種能夠很好地區分，而‘11-22-16’和‘12-10-60’，‘克里木波西’和‘赤霞珠170’，‘蓋吾沙’和‘塔夫里斯’‘紫晶夢露’和‘1-5-7’的數字指紋號碼相同，可能存在同物異名現象，其原因有待與性狀進行關聯分析，另外開發理想的核心分子標記引物也是今后研究的一個方向，進而提供更準確有效的種質資源鑒定信息以提高育種效率，為釀酒葡萄種質利用與創新提供依據。

4 結 論

所篩選出的30對引物在釀酒葡萄上表現出高多態性，多態率達97.164%，其中引物VVIV67擴增條帶最多，為22條，表明在本研究中的釀酒葡萄品種中鑒別力最強。Nei’遺傳距離在0.5～1，占整體的92.399%，基于Nei’遺傳距離的聚類分析中將110份釀酒葡萄分為6組，能夠將歐亞種、山歐雜種和山葡萄進行分類。最后通過構建數字指紋，結果表明可將各品種進行精準鑒定，其中‘11-22-16’和‘12-10-60’，‘克里木波西’和‘赤霞珠170’，‘蓋吾沙’和‘塔夫里斯’，‘紫晶夢露’和‘1-5-7’可能存在同物異名，為獲得更加精準的結果，還需進一步關聯性狀研究。

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SSR Marker Analysis and Digital Fingerprinting of Major Wine Grape Germplasm Resources in Xinjiang， China

WANG Jijiao^1，2， WANG Shiwei²， LI Yalan²， YANG Tao³， LI Shude³， WANG Baoqing⁴ and PAN Yue^1，5

（1.Xinjiang Academy of Forestry， Urumqi 830063，China;2. College of Forestry and Landscape Architecture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052，China; 3. Xinjiang Niya Wine Co.，Ltd. Manas Xinjiang 832200，China; 4.Akesu National Observation and Research Station of Chinese Forest Ecosystem， Wensu Xinjiang 843100，China; 5. Xinjiang Key Laboratory of Forest Resources and Utilisation of State Forestry and Grassland Bureau of China， Urumqi 830063，China）

Abstract Xinjiang boasts a rich diversity of wine grape germplasm resources，however， issues such as such as complicated genetic backgrounds and the existence of various distinct varieties are prevalent in the region.In order to effectively differentiate and optimize the utilization of the main wine grape germplasm resources cultivated in Xinjiang， 110 germplasms were collected as experimental materials.Polymorphic SSR primers were selected for PCR amplification， followed by analysis of polymorphism， genetic diversity and genetic distance，and construction of the digital fingerprints of germplasm. The results showed that 30 pairs of polymorphism-rich primers were selected from 76 pairs of SSR primers， and 391 allelic loci were amplified， with a polymorphism rate 97.164%. Among these， the primer VVIV67 had the highest numbers of bands， with a total of 22. The average observed heterozygosity （Ho） of each locus was 0.671， the expected heterozygosity （He） was 0.790， and the Shannon’s information index （I） ranged from 1.142 to 2.627， with an average PIC value of 0.766. Genetic distance variation mainly ranged from 0.500 to 1.000， accounting for 92.399% of the total variation. The clustering analysis divided the test materials into 6 groups.Groups Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ predominantly included varieties introduced from France， the former Soviet Union， the United States， Italy， and other countries，while groups IV and V were mostly composed of the interspecific and intraspecific hybrids of China’s Vitis amurensis Rupr. varieties， group VI represented Vitis amurensis Rupr. varieties selected by China. Principal component analysis showed that the Vitis vinifera L. and Vitis amurensis Rupr. were genetically distant， and the Vitis vinifera L. varieties were genetically close. Genetic structure analysis aggregated the wine grape core into two clusters of intraspecific or interspecific hybrids with Vitis vinifera L. and Vitis amurensis Rupr. as parents. The digital fingerprints accurately identified the various germplasms， with ‘11-22-16’ and ‘12-10-60’， ‘Kelemuboxi’ and ‘Cabernet Sauvignon 170’

，‘ГeΗyca Чибил’ and ‘Taвриц’，‘Zijingmenglu’ and ‘1-5-7’ potentially sharing identical names. The SSR loci of the main wine grape varieties cultivated in Xinjiang are abundant and useful， and the experimental materials exhibit rich genetic diversity， which can provide a foundation for the utilisation of wine grape germplasm resources and varietal selection and breeding.

Key words Wine grape; SSR; Genetic diversity; Genetic resource; Digital fingerprinting

Received 2023-12-27

Returned 2024-01-13

Foundation item Key Ramp;D Program of Xinjiang Uyguer Autonomous Region（No.2022B02045-1-4，No.20232115653，No.2023B02028-1）.

First author WANG Jijiao， female， master student. Research area：forest cultivation and breeding. E-mail：2419371483@qq.com

Corresponding author PAN Yue，male，master，assistant research fellow.Research area：breeding and cultivation of cold-resistant grapes. E-mail：252372063@qq.com

（責任編輯：潘學燕 Responsible editor：PAN Xueyan）