基于SSR標記的126份甜瓜種質遺傳多樣性分析
2025-01-25 00:00:00周雨晴戴文婧楊羽清姚森洋周圓程智慧潘玉朋
西北農業學報 2025年1期
摘 要 以126份甜瓜種質為試材，對其苗期子葉大小性狀進行測定，并依據此對甜瓜種質資源進行聚類分析，利用50個SSR分子標記對126份甜瓜種質進行評價，分析其遺傳多樣性，旨在為該126份甜瓜種質的有效利用提供參考。結果表明：不同甜瓜種質的子葉長和子葉寬均存在明顯差異，且子葉長與子葉寬間呈正相關關系；基于各甜瓜種質的子葉長與子葉寬數據，可將91份種質聚類為三類，即大子葉甜瓜種質、小子葉甜瓜種質和子葉大小中等的甜瓜種質；50個多態性SSR分子標記在126份種質中平均檢測出2.1個有效等位位點，變幅為1.18～4.11，Shannon-Weaver指數平均為0.80，變幅為0.33～1.50；基于50個SSR分子標記的基因型鑒定結果，126份甜瓜種質可聚類為四類，表明分子標記相較形態指標在種質資源評價中具有更高的精確性；由子葉大小和50個SSR分子標記的評價結果可見，本研究中126份甜瓜種質的遺傳多樣性較為豐富。
關鍵詞 甜瓜; 子葉大小; 分子標記; 聚類分析; 遺傳多樣性
甜瓜（Cucumis melo L.）是葫蘆科甜瓜屬，一年生蔓性植物，其營養物質豐富，深受消費者喜愛［1］。甜瓜的種質資源分布范圍廣，其品種類型較多，不同品種或種質間的表型差異顯著，具有十分豐富的遺傳多樣性［2］。遺傳多樣性是生物多樣性的主要構成部分，通常指種內不同種群之間或種群內不同個體之間的遺傳變異總和［3］。種質資源是研究物種起源和進化以及培育新品種的重要材料基礎［4］。分析和評價甜瓜種質資源的遺傳多樣性，可為甜瓜種質的有效利用提供重要依據，對甜瓜優異基因的發掘、新種質的創制、新品種的培育等也有重要的實踐意義。
SSR（Simple sequence repeat，SSR）分子標記，也稱微衛星標記，因其數量多、共顯性遺傳和多態性高等優點而被廣泛用于諸多園藝作物種質資源的遺傳多樣性分析［5-9］。基于SSR分子標記技術，Szamosi等［10］對來自匈牙利和土耳其的58份甜瓜種質進行遺傳多樣性分析、主成分分析和聚類分析，結果表明58份甜瓜種質在各表型性狀上表現出豐富的多樣性；Chikh-Rouhou等［11］對24份突尼斯甜瓜種質進行遺傳多樣性分析和聚類分析，將其劃分為5個類群；徐小軍等［12］對包括厚皮、薄皮和野生甜瓜的191份種質進行了遺傳多樣性分析，發現厚皮與薄皮甜瓜種質間的遺傳差異較大，野生種質與薄皮或厚皮甜瓜種質間的遺傳差異則相對較小；王建玉等［13］對72份甜瓜種質資源進行了聚類和遺傳多樣性分析，將72份甜瓜種質資源分為7個類群，其中類群I有 64份材料，基本包括了試驗選用的所有新疆厚皮甜瓜種質，表明其收集的新疆厚皮甜瓜種質間的遺傳背景較狹窄。
近年來，西北農林科技大學甜瓜種質資源利用與遺傳育種實驗室先后收集了來自中國、印度、西班牙、埃及和美國等23個國家的126份甜瓜種質。然而，這126份甜瓜種質材料間的遺傳關系尚不明確，制約了其在甜瓜遺傳改良、新種質創制和新品種選育中的應用進程。因此，本研究利用苗期子葉長和寬的表型數據以及50個多態性SSR分子標記，分別對126份甜瓜種質進行遺傳多樣性分析，研究結果對較全面了解這126份甜瓜種質的遺傳關系和其在甜瓜新種質創制和新品種選育過程中的有效利用均具有重要參考意義。
1 材料與方法
1.1 供試材料
供試甜瓜材料共計126份，收集自中國、印度、西班牙、埃及和美國等23個國家，各份甜瓜種質材料的具體名稱及來源信息詳見表1。
1.2 試驗方法
1.2.1 甜瓜種質苗期子葉長和寬的測定 分別取126份甜瓜種質的種子，經溫湯浸種后于28℃的恒溫培養箱進行催芽，待種子露白后播種于裝有育苗基質的72孔穴盤中，放置于西北農林科技大學科研溫室內。甜瓜種質出苗后，依據《甜瓜種質資源描述規范和數據標準》［14］，在第一片真葉展平期對各甜瓜種質的子葉長和寬進行測量記錄。
1.2.2 基因組DNA提取 待126份甜瓜種質出苗至子葉展平時，取1片子葉的1/2于2.0 mL的離心管中，置于冰盒中，帶回實驗室，保存在 -20℃的冰箱中，備用。參照宋芃垚［15］的方法，采用CTAB法提取各份甜瓜種質的基因組DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測所提DNA的質量，用Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度計進行DNA濃度測定。依據各種質基因組DNA原液的濃度，用ddH2O稀釋至 50～100 ng/μL的濃度，作為后續PCR擴增時的DNA模板。稀釋好的DNA模板于4℃冰箱中保存，備用。
1.2.3 SSR分子標記篩選 結合已發表相關文獻資料［15-17］及甜瓜的參考基因組（DHL92V3.6.1，http：//cucurbitgenomics.org/organism/18），篩選均勻分布于甜瓜所有染色體上且多態性較好的SSR分子標記59個，依據各引物的堿基序列信息（表2），送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司，進行引物合成，用于后續PCR擴增。
1.2.4 PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染 PCR擴增體系10 μL包括： 2 μL DNA 模板（50～100 ng/μL），0.5 μL 上游引物（10 μmol/μL），0.5 μL 下游引物（10 μmol/μL），5 μL Taq Master Mix，2 μL ddH2O。PCR擴增程序為95℃預變性3 min； 94℃變性20 s，68℃退火20 s，72℃延伸20 s，循環6次，每循環退火溫度降低2℃； 94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，循環8次，每循環退火溫度降低 1℃；94℃變性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸20 s，循環20次；72℃延伸5 min，4℃恒溫結束。
聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染：取0.5～1.0 μL PCR產物上樣至8% PAGE膠上，進行電泳檢測，180 V恒壓電泳60 min左右。電泳結束后將PAGE膠從玻璃板上剝離，置于蒸餾水中漂洗10 s，然后放入0.13%的硝酸銀溶液中銀染10 min，銀染結束后用蒸餾水漂洗PAGE膠10 s，再置于顯影液（15 g氫氧化鈉+3 mL甲醛+1 L蒸餾水）中，搖床晃動顯影至條帶清晰可見，顯影后與蒸餾水中再次漂洗3 min左右，取出PAGE膠并用保鮮膜封好，于膠片燈上用數碼相機拍照記錄結果。
1.3 數據處理
針對各引物在126份甜瓜種質中的擴增電泳條帶進行統計，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。利用R軟件（https：//www.r-project.org/）進行聚類分析并構建系統聚類圖。根據引物擴增結果，利用POPGENE 1.32軟件（https：//sites.ualberta.ca/～fyeh/popgene_info.html）計算有效等位基因數和Shannon-Weaver指數等，從而在DNA水平對126份甜瓜種質進行遺傳多樣性評價。
2 結果與分析
2.1 基于苗期子葉長與寬的甜瓜種質多樣性分析
2.1.1 甜瓜種質苗期子葉長與寬的差異及其相關性分析 各甜瓜種質出苗至第一片真葉展平時，對126份種質中的91份進行了子葉長和子葉寬的測量；其中，子葉長為0.93～4.02 cm，均值為2.20 cm，種質M118的子葉最長，其次為M085（4.00 cm），而種質M098的子葉最短，其次為M150（1.06 cm）；子葉寬為0.69～2.24 cm，均值為1.32 cm，種質M112的子葉寬最寬，其次為M118（2.22 cm），種質M150子葉寬最窄，其次為M098（0.70 cm）。針對91甜瓜種質的子葉長和寬分別進行頻次分布作圖，由圖1可見，不同甜瓜種質子葉長和子葉寬均存在明顯差異，且均呈連續分布；其中，子葉長位于 1.50～ 1.80 cm間的甜瓜種質最多，有19份，而子葉寬在1.10～1.30 cm間的甜瓜種質最多，有22份。此外，對 91份甜瓜種質子葉長和子葉寬的相關性分析（圖2）表明兩者間具有正相關關系（y= 0.454 4x+ 0.318 0，R2=0.879 0）。
2.1.2 基于苗期子葉長與寬的甜瓜種質聚類分析 依據子葉長和子葉寬的表型數據，對91份甜瓜種質進行了聚類分析。由圖3可見，91份甜瓜種質按其子葉長與子葉寬進行聚類時，可劃分為3個類別。其中，第一類包括31份種質，其子葉長和子葉寬分別為2.60～4.20 cm和 1.44～ 2.24 cm，該類別屬于子葉較大的甜瓜種質；第二類含有29份種質，其子葉長范圍為1.70～2.51 cm，子葉寬范圍為1.05～1.62 cm，該類別甜瓜種質具有中等大小的子葉；第三類有31份種質，其子葉長介于1.06～1.75 cm，子葉寬則介于 0.69～1.20 cm，該類別為子葉較小的甜瓜種質。
2.2 基于SSR分子標記的甜瓜種質遺傳多樣性分析
2.2.1 SSR分子標記多態性分析 在本研究選用的59個SSR分子標記中，有50個SSR標記（占84.75%）的PCR擴增條帶清晰可辨，故將這50個標記用于126份甜瓜種質的遺傳多樣性分析。由表2可知，50個SSR標記在126份甜瓜種質中共檢測出163個等位位點，每個標記平均檢測到3.3個位點，標記CM07和CmSSR06184檢測到的位點最多（均為5個），其他標記檢測到的位點分別為3或4個；有效等位基因數Ne的變異范圍為1.18～4.11，平均為 2.10，其中標記CmSSR06184最大，標記CM43最小；觀測雜合度Ho的變幅為0.24～0.85，平均為0.50，標記CM43和CmSSR06184的Ho分別為0.85和 0.24；期望雜合度He的變幅為0.15～0.76，平均為0.50；Shannon-Weaver指數I的變幅為0.33～1.50，平均為0.80，標記CM43的I最小，而標記CmSSR06184的I最大。由Ho、He和I等可見，本研究中基于50個SSR分子標記評價的126份甜瓜種質的遺傳多樣性較豐富。
2.2.2 基于SSR分子標記的甜瓜種質資源聚類分析 基于50個SSR分子標記的PCR擴增條帶帶型數據，對126份甜瓜種質進行了聚類分析。由圖4可見，126份甜瓜種質可劃分為4個類別。第一類包括15份種質，40%的種質材料來源于歐洲西部（M043、M059、M080、M087、M089、M112），20%來源于亞洲西南部（M067、M093、M091），個別來源于中國西部（M102、M105）、非洲北部（M071）、印度（M124、M135）以及美國（M109）；第二類包括51份種質，其中約67%的種質材料來源于印度（M002、M009、M011、M012、M013、M015、M016、M018、M023、M024、M025、M026、M032、M033、M034、M046、M057、M072、M073、M074、M075、M077、M081、M092、M100、M101、M106、M107、M110、M120、M129、M131、M137和M138），約18%來源于日本（M045、M047、M050、M052、M070、M096、M097和M098），少部分來源于北美洲南部（M017、M149、M150、M151和M152），個別來源于中國（M004）和土耳其（M066）；第三類包括29份種質，其中79%的種質來源于印度（M001、M005、M007、M008、M010、M027、M030、M031、M036、M038、M039、M040、M041 、M063、M069、M078、M079、M099、M108、M128、M133、M139和M140），個別來源于亞洲西南部（M044、M049、M065）、非洲中南部（M003）、美國（M114）以及法國（M118）；第四類包括31份種質，其中45%的種質資源來源于亞洲西南部和非洲的埃及（M006、M055、M068、M094、M111、M132、M136、M141、M142、M143、M144、M146、M147 和M148），約42%來自歐洲西部地區以及印度（M064、M082、M085、M113、M115、M116、M117、M119、M125、M126、M127、M130和M134），個別來自中國（M104）、俄羅斯（M048）和美國（M056、M145）。
3 討論與結論
作物的苗期是其植株生長發育的重要階段，通過苗期性狀可以對作物進行早期選擇。鑒于許多蔬菜作物的幼苗可進行集約化、標準化的工廠化育苗，對其苗期性狀進行評價，具有周期短、效率高、評價便捷且準確等優點，利用苗期性狀（如子葉大小等）可對甜瓜種質資源的遺傳多樣性進行快速的初步評價。高玉紅等［18］對20份甜瓜種質資源的10個主要苗期性狀進行了統計分析，發現20份甜瓜種質資源苗期主要性狀間均有一定差異，表明20份甜瓜種質間存在較豐富的遺傳多樣性。周亞峰等［19］以30份甜瓜品種為材料，對甜瓜16個苗期進行統計分析，結果表明30份甜瓜品種的苗期性狀變異較大，且子葉長、子葉寬和真葉形狀這3個苗期性狀差異明顯，變異系數均大于60%。蘇艷等［20］研究發現，甜瓜苗期的子葉寬度與甜瓜果重呈顯著正相關，相關系數達 0.62，該苗期性狀可作為甜瓜單果鮮重的早期評價指標，可在苗期對甜瓜產量性狀進行初步預測。本研究對91份甜瓜種質的子葉長和子葉寬等子葉大小性狀進行了測定，發現不同甜瓜種質的子葉長和子葉寬均差異明顯，且子葉長和子葉寬之間存在極顯著正相關關系；依據各甜瓜種質的子葉長與子葉寬數據，對91份甜瓜種質進行聚類分析，可將91份甜瓜種質分為3個類別。
相較于基于形態指標的種質資源的遺傳多樣性評價，分子標記具有適用性廣、穩定性高、準確性強和可重復等優勢［5］。SSR分子標記有數量多、多態性高且呈共顯性遺傳等諸多優點，故其在許多植物中被廣泛用于遺傳多樣性評估、遺傳圖譜構建和遺傳系譜/關系評價等［21-24］。本研究從已發表的相關文獻中篩選了59個多態性較好的SSR分子標記對甜瓜種質資源的遺傳多樣性評價，其中50個SSR標記擴增良好并用于126份甜瓜種質的鑒定，結果表明126份甜瓜種質在50個SSR位點上共檢測出163個等位變異，各SSR標記檢測出的等位變異為3～5個，平均為3.26個；基于50個SSR分子標記的鑒定結果，對126份甜瓜種質材料進行聚類分析，可將其分為4個類別。該結果表明分子標記相較形態指標在種質資源評價中具有更高的精確性。總言之，不論是基于苗期子葉長和子葉寬的聚類分析，還是基于SSR分子標記的聚類分析，均表明本研究中的126份甜瓜種質具有較豐富的遺傳多樣性，該結果為這126份甜瓜種質的有效利用提供了重要參考，對甜瓜優異基因發掘、種質創新、遺傳改良、新品種培育等研究工作的開展提供了重要的前期材料基礎。
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Genetic Diversity Analysis of 126 Melon Germplasms Based on SSR Markers
ZHOU Yuqing1，DAI Wenjing2，YANG Yuqing1，YAO Senyang1，ZHOU Yuan1，CHENG Zhihui1 and PAN Yupeng1
（1.College of Horticulture，Northwest Aamp;F University，Yangling Shaanxi 712100，China；2.Horticultural Technology Workstation of Shaanxi Province，Xi’an 710003，China）
Abstract To enhance the effective utilization of melon germplasm resources，this study evaluated the genetic diversity of 126 melon germplasms using cotyledon size （length and width） measurements at the seedling stage and genotypic analysis with 50 polymorphic SSR markers. The results indicated significant difference in cotyledon length and width among various melon germplasms， with a positive correlation observed between these two traits. Based on the cotyledon size data，91 melon inbred lines used for cotyledon size measurements were clustered into three categories：large，small，and medium cotyledon size groups. An average of 2.1 effective alleles was detected per SSR marker across 126 melon germplasms，with a range of 1.18 to 4.11. The Shannon-Weaver index averaged 0.80，with a range of 0.33 to 1.50. Based on the genotypic data of 50 SSR markers，all the 126 melon germplasms were clustered into four categories，suggesting that molecular markers are more accurate than morphological indicators in the evaluation of melon germplasms. Overall，the findings demonstrate that the 126 melon germplasms possess a relatively high genetic diversity.
Key words Melon; Cotyledon size; Molecular markers; Cluster analysis; Genetic diversity
Received 2023-09-04
Returned 2023-12-20
Foundation item the Fundamental Research Fund for the Central Universities（No.2452019017）; China’s Modern Agriculture Industry Technology System（No.CARS-23-G22）.
First author ZHOU Yuqing，female，master student.Research area：cucumber germplasms utilization and molecular breeding. Email：zhouyuqing@nwafu.edu.cn
Corresponding author PAN Yupeng，male，Ph.D，associate professor.Research area：cucumber and melon germplasms utilization and genetic breeding. E-mail：yupeng.pan@nwafu.edu.cn
（責任編輯：成 敏 Responsible editor：CHENG Min）
