同步靶向馬鈴薯StRTP5a和StRTP5b基因RNA干擾載體的構建及遺傳轉化

摘 要 植物免疫調控基因 RTP5（Resistance to Phytophthora 5）編碼一個含WD40結構域的蛋白，該基因負調控植物對疫霉的抗性。為獲得沉默馬鈴薯中 RTP5同源基因 StRTP5a和 StRTP5b的遺傳材料，以便進一步探究 StRTP5a和 StRTP5b基因的生物學功能。以四倍體馬鈴薯品種‘Désirée’的cDNA為模板，擴增到靶向 StRTP5a和 StRTP5b基因的DNA片段，通過Gateway技術將目的片段重組至植物表達載體pHellsgate12，構建同步靶向 StRTP5a和 StRTP5b基因的目的表達載體pHells12-StRTP5a/b i，然后利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化方法將目的表達載體轉化至‘Désirée’中。經PCR和qPCR分析后，獲得8株2個目的基因同時沉默的馬鈴薯株系，轉化株系中 StRTP5a和 StRTP5b基因表達量同時降幅最高達70%以上。

關鍵詞 馬鈴薯；RNA干擾；遺傳轉化；WD40蛋白

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）糧菜兼用、營養全面、適應性廣，是僅次于小麥、水稻和玉米的世界第四大糧食作物^［1］。栽培馬鈴薯主要依靠塊莖進行無性繁殖，經常遭受各種生物與非生物逆境脅迫，并且隨著馬鈴薯加工業的迅速發展和消費者對糧食品質的更高要求，培育抗病耐逆、高產優質和專用的馬鈴薯新品種已成為馬鈴薯產業發展的迫切需求^［1］。然而，馬鈴薯主栽品種為基因組高度雜合的同源四倍體，利用常規雜交技術很難在短時間內培育出優良新品種，科研人員不斷探索將現代分子生物學和基因工程技術應用于馬鈴薯功能基因組學和品種遺傳改良中。但穩定、高效的馬鈴薯遺傳轉化和再生體系是進行馬鈴薯功能基因組學和品種遺傳改良的前提條件，目前少數四倍體和二倍體馬鈴薯基因型的遺傳轉化和再生體系已被建立^［2-6］，并用于馬鈴薯基因功能鑒定和種質材料的創制。例如，借助農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化方法將馬鈴薯 StCYP83B1基因在馬鈴薯栽培品種Atlantic中進行過表達，獲得穩定表達 StCYP83B1基因的馬鈴薯植株^［7］，或者同時將3個晚疫病抗性基因Rpi-sto1、Rpi-vnt1.1和Rpi-blb3表達在四倍體馬鈴薯栽培品種‘Désirée’中，從而獲得晚疫病抗性增強的馬鈴薯材料^［8］。利用RNA干擾（RNA interference，RNAi）載體靶向編碼病毒外殼蛋白的基因（CP）獲得兼抗4種病毒的四倍體馬鈴薯種質^［9］。將馬鈴薯絲源活化蛋白激酶基因 StMKK1在‘Désirée’中穩定過表達或RNAi沉默后分析發現，StMKK1對不同生活史類型的病原菌發揮不同的抗性作用^［10-11］。通過聚乙二醇（PEG）方法將靶向馬鈴薯液泡轉化酶基因StVlnv的TALEN編輯載體轉化馬鈴薯原生質體，獲得了StVlnv敲除的再生四倍體馬鈴薯植株^［12］。此外，通過農桿菌介導的CRISPR/Cas9基因編輯體系對自交不親和的二倍體馬鈴薯S-RNase基因進行編輯，成功獲得S-RNase基因突變且自交親和的二倍體馬鈴薯突變材料^［13］。類似的，CRISPR/Cas9技術編輯二倍體馬鈴薯薯塊身份基因 IT1，其突變體 it1匍匐莖頂端無法正常膨大形成薯塊^［14］。盡管RNAi和CRISPR/Cas9基因編輯等技術目前都可以用于操控馬鈴薯內源基因的表達，但對基因組高度雜合且無性繁殖的四倍體馬鈴薯很難利用基因編輯技術獲得4個等位基因同時突變的株系，RNAi技術仍是目前主要用于抑制四倍體馬鈴薯基因表達或創制種質材料的主要工具。

RNAi是真核生物中由雙鏈RNA（dsRNA）引發同源mRNA特異性降解，為轉錄后水平沉默靶基因的現象^［15］。自20世紀90年代RNAi現象發現以來，多種植物基因沉默技術被相繼建立，包括反義RNA（antisense RNA），發卡RNA（hairpin RNA，hpRNA）和人工小分子RNA（artificial microRNA，amiRNA）等。反義RNA技術是通過構建反義RNA序列來抑制目標基因的表達，而amiRNA技術是利用內源性microRNA前體產生21 bp miRNA引起目標基因的沉默。研究表明，轉錄后能形成互補hpRNA結構的植物表達載體通常具有高效抑制目標基因表達的能力，即在構建植物表達載體時，通過啟動子驅動一個“正向靶基因片段—環—互補靶基因片段”的轉錄單元進行轉錄，轉錄出的單鏈RNA可以形成分子內的hpRNA，hpRNA被Dicer酶加工成小干擾RNA（siRNA），siRNA的一條鏈被組裝至RNA誘導的沉默復合體（RISC）中，另一條鏈則保留并引導RISC切割與之序列互補的mRNA，降解RNA分子，從而沉默目標基因^［16］。因此，hpRNA技術常被用于獲得穩定遺傳的RNAi植物材料，以備基因功能分析。

WD40蛋白是一類含有4～16個WD40（Trp-Asp，色氨酸-天冬氨酸）結構域的蛋白^［17］。WD40蛋白家族成員在真核生物中廣泛分布且高度保守，通常作為支架蛋白為蛋白質與蛋白質或蛋白質-DNA復合物的形成提供互作平臺^［17］。研究證實，WD40蛋白在植物生長發育和逆境脅迫應答等生理過程中發揮重要的調控作用。例如，玉米KRN2 （Kernel row number2）及其水稻中的直系同源基因 OsKRN2編碼細胞質定位的WD40蛋白，能與功能未知蛋白DUF1644互作，通過一條保守的信號途徑分別負調控玉米穗行數與水稻穗粒數^［18］。而受脫落酸（ABA）誘導的AIW1 （ABA-induced WD40-repeat 1）和AIW2以功能冗余的形式負調控擬南芥對ABA和鹽脅迫的耐受性^［19］。小麥WD40蛋白TaHOS15 （Triticum aestivum high expression of osmotically responsive gene 15）結合組蛋白去乙?；窽aHDA6組成轉錄抑制復合體調節防御基因的表達而調控小麥白粉病抗性^［20］，其擬南芥中的同源蛋白HOS15則招募組蛋白去乙酰化酶HDA9通過組蛋白去乙酰化抑制胞內免疫受體基因（如 SNC1）的表達而負調控植物免疫^［21］。擬南芥 RTP5（Resistance to Phytophthora 5）編碼一個含WD40結構域的蛋白。研究顯示，RTP5的突變體展現為增強的疫霉抗性，而過表達 RTP5促進疫霉對植物的侵染，且本氏煙草（Nicotiana benthamiana）中 RTP5同源基因NbRTP5的沉默能增強本氏煙草對寄生疫霉和致病疫霉的抗性，表明 RTP5及其同源基因NbRTP5為進化上功能高度保守的植物免疫調控基因^［22］，但 RTP5同源基因在馬鈴薯中的作用尚不清楚。本研究通過PCR克隆馬鈴薯中 RTP5同源基因 StRTP5a和 StRTP5b的特異性DNA片段，采用Gateway技術構建同步靶向 StRTP5a和 StRTP5a基因的RNAi載體，然后利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化方法將目的載體導入馬鈴薯品種‘Désirée’中，并獲得同時沉默 StRTP5a和 StRTP5b基因的馬鈴薯株系，為進一步研究 StRTP5a和 StRTP5b基因在馬鈴薯中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的四倍體馬鈴薯品種‘Désirée’來自西北農林科技大學農學院，組培苗置于光照培養箱培養，所用培養基為MS30固體培養基，培養條件為23℃，16 h光照/8 h黑暗，光照度3 000 lx。

所用大腸桿菌（Escherchia coli）菌株Mach T1（購自Thermo Fisher Scientific公司），根癌農桿菌（Agrobactererium tumefaciens）菌株GV3101（pMP90）、Gateway入門載體pDONR201和植物RNAi載體pHELLSGATE 12均來自西北農林科技大學農學院。

試驗所用生化試劑：DNA聚合酶Super Pfx Master Mix、Es Taq MasterMix、Super DNA marker和SYBR Green Ⅰ 均購自康為世紀，植物總RNA提取試劑盒（貨號：DP419）購自天根生化科技有限公司，Gateway^TM BP Clonase^TM Ⅱ Enzyme mix和Gateway^TM LR Clonase^TM Ⅱ Enzyme mix 購自Thermo Fisher Scientific，反轉錄試劑PrimeScript^TM RT reagent kit（貨號：RR037A）購自Takara，嗎啉乙磺酸（MES）購自Sigma，MS培養基、瓊脂、萘乙酸（NAA）、6-芐基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、赤霉素（GA3）均購自PhytoTech Labs，卡那霉素（kanamycin，Kan）、壯觀霉素（spectinomycin，Spec）、慶大霉素（gentamicin，Genta）、利福平（rifampicin，Rif）、頭孢霉素（cefotaxime，Cef）均購自索萊寶公司。

MS30固體培養基：4.43 g/L MS +30 g/L蔗糖+ 8 g/L瓊脂，pH=5.8;

MS液體培養基：4.43 g/L MS + 16 g/L葡萄糖+ 0.5 g/L MES，pH=5.8；

愈傷誘導培養基（CIM）：4.43 g/L MS +16 g/L 葡萄糖+ 0.5 g/L MES+ 8 g/L 瓊脂，pH=5.8，含5 mg/L NAA+ 0.1 mg/L 6-BA；

芽誘導培養基（RIM）：4.43 g/L MS + 16 g/L 葡萄糖 + 0.5 g/L MES+ 8 g/L 瓊脂，pH=5.8，含0.02 mg/L NAA+ 2 mg/L ZT+ 0.1 mg/L GA3。

上述培養基均需121℃高壓滅菌20 min。

1.2 RNA干擾載體的構建

以擬南芥 RTP5 （At5G43930）序列作為“query”，在馬鈴薯數據庫Spud DB （http：//spuddb.uga.edu/）中進行比對分析，鑒定到 RTP5在馬鈴薯中的同源基因序列Soltu.DM.05G023120.2和Soltu.DM.09G027740.1，并分別命名為 StRTP5a和 StRTP5b。然后利用茄科植物基因組網站（https：//solgenomics.net/）的VIGS tool分別選取 StRTP5a和 StRTP5b基因的特異區段約175 bp，采用在線工具Primer3Plus（http：//www.primer3plus.com/）設計目標DNA序列的特異性引物，引物序列見表1。以馬鈴薯‘Désirée’的cDNA為模板，分別以引物StRTP5a-F和StRTP5a-R，StRTP5b-F和StRTP5b-R擴增目標序列的DNA片段，并以兩個目標序列的PCR擴增產物作為模板，利用引物StRTP5b-F和StRTP5a-R進行融合PCR反應，將兩個DNA片段連接并獲得目標DNA片段，然后將目標DNA片段與入門載體pDONR201進行Gateway的BP重組反應，重組產物轉化至大腸桿菌Mach T1感受態，篩選的重組質粒經西安擎科生物DNA測序驗證后，再將正確的質粒pDONR201-StRTP5a/b與目的載體pHELLSGATE12進行Gateway的LR重組反應，重組質粒經DNA測序驗證后獲得同步靶向 StRTP5a和 StRTP5b基因的RNAi載體pHells12-StRTP5/b i，并通過電轉的方法將目的載體pHells12-StRTP5/b i轉化至根癌農桿菌菌株GV3101。

1.3 根癌農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化

農桿菌菌液的制備：將-80℃冰箱凍存的含有目的表達載體的農桿菌甘油菌在含有100 μg/mL Spec +25 μg/mL Rif +25 μg/mL Genta的LB平板上劃線培養，挑取單菌落到10 mL液體LB（含100 μg/mL Spec +25 μg/mL Rif +25 μg/mL Genta），置于轉速200 r/min，溫度28℃的搖床中培養至菌液OD₆₀₀≈0.8。室溫下4 000 r/min離心菌液5 min，收集菌體，然后用MS液體培養基重懸菌體至OD₆₀₀=0.6，備用。

農桿菌介導的馬鈴薯葉片轉化方法參照An等^［23］報道的方法，并稍做修改。將組培手術刀切成約0.5 cm²大小的葉片放入含有10 mL MS液體培養基和80 μL （OD₆₀₀=0.6）農桿菌菌液的 d=90 mm培養皿，然后置于23℃暗培養。共培養2 d后，將葉片轉移至無菌濾紙，吸干葉片表面的液體，再將葉片轉移至含250 mg/L Cef+50 mg/L Kan的CIM培養基誘導愈傷組織的形成。10 d后將葉片轉至含250 mg/L Cef和50 mg/L Kan的SIM培養基，之后每7～10 d更換新的CIM培養基，直至愈傷組織分化出不定芽，將長出的2～3 cm不定芽切下轉移至含50 mg/L Kan的MS30固體培養基中進行生根培養，直至獲得獨立的再生株系用于篩選鑒定。

1.4 轉化株系的PCR檢測

馬鈴薯基因組DNA的提取采用改良CTAB法^［24］。取1 μL DNA（～50 ng/μL）作為模板進行PCR檢測。PCR反應體系為（20 μL）：1 μL DNA，10 μL 2×Es Taq MasterMix，0.5 μL 正向引物（10 μmol/L），0.5 μL 反向引物（10 μmol/L），8 μL ddH₂O。PCR反應程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，32個循環。擴增產物使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.5 轉化株系的RT-qPCR檢測

馬鈴薯葉片總RNA的提取采用植物總RNA提取試劑盒，cDNA的合成采用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒，RNA提取過程及cDNA合成方法具體參照相應試劑盒的說明書。利用Primer3Plus（http：//www.primer3plus.com/）分別為 StRTP5a和 StRTP5b設計實時熒光定量分析的引物，引物DNA序列見表1。以合成的cDNA為模板，StEF1α作為內參基因，進行RT-qPCR反應。使用SYBR Green Ⅰ（康為世紀，貨號CW0957H）和LightCycler480實時熒光定量PCR儀（LightCycler480，Roche公司）進行RT-qPCR分析。PCR反應程序為：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，40個循環?；蛳鄬Ρ磉_量的計算采用2^-ΔΔCt法^［25］。每個試驗做3次重復。

2 結果與分析

2.1 目的RNAi載體的構建

在馬鈴薯中鑒定到 RTP5的同源基因 StRTP5a和 StRTP5b，其分別編碼含759和776個氨基酸殘基的蛋白，且StRTP5a和StRTP5b分別與RTP5蛋白序列的一致性為52.59%和52.01%（圖1）。然后以馬鈴薯‘Désirée’的cDNA為模板，利用PCR分別擴增特異性靶向 StRTP5a和 StRTP5b基因的DNA片段，分別獲得約175 bp的特異性DNA片段（圖2-A），將兩個DNA片段利用融合PCR進行連接并獲得約350 bp的目的DNA片段StRTP5a/b（圖2-A）。將目的DNA片段StRTP5a/b與入門載體DONR201進行Gateway的BP重組反應，獲得的重組質粒pDONR201-StRTP5a/b經DNA測序驗證后，pDONR201-StRTP5a/b與目的載體pHELLSGATE12進行Gateway的LR重組反應，重組產物轉入大腸桿菌Mach T1，陽性克隆經測序驗證后獲得目的RNAi載體pHells12-StRTP5/b i。將目的載體pHells12-StRTP5/b i轉入根癌農桿菌菌株GV3101，選取長出的克隆搖菌并進行菌液PCR檢測，檢測引物為pHells12-F和pHells12-R（引物相對位置見圖3）。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，PCR擴增的DNA產物為1 900 bp左右的條帶，與預期DNA序列大小結果一致（圖2-B），表明獲得攜帶目的RNAi載體的陽性農桿菌克隆。目的RNAi載體pHells12-StRTP5/b i的T-DNA區示意圖如圖3所示。

2.2 馬鈴薯遺傳轉化與植株再生

以馬鈴薯品種‘Désirée’的葉片作為外植體，與攜帶目的RNAi載體的根癌農桿菌共培養2 d（圖4-A），侵染后葉片被轉移至無菌濾紙，吸干葉片表面水分，再將葉片轉移至愈傷誘導培養基中培養以誘導愈傷組織（圖4-B），10 d后將有愈傷組織形成的葉片轉移至芽誘導培養基中培養，每7～10 d更換新的芽誘導培養基，直至愈傷組織分化出芽（圖4-C），將芽切下后轉移至MS30固體培養基中進行生根培養（圖4-D；圖4-E），直至獲得馬鈴薯轉化植株（圖4-F）。

2.3 同步靶向StRTP5a和StRTP5b基因轉化植株的鑒定

2.3.1 轉化植株插入DNA的PCR檢測 任意選取8個馬鈴薯轉化株系（StRTPa/b i-1、2、3、4、5、6、7、8），提取轉化植株的基因組DNA。利用引物StEF1α-F和StEF1α-R進行PCR，用以檢測提取基因組DNA的質量，采用Kan-F和Kan-R引物PCR擴增T-DNA區Kan^r基因的DNA片段（引物序列見表1），以質粒pHells12-StRTP5a/b i作為陽性對照。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，與PCR陽性對照一致，8株轉基因植株均攜帶來自Kan^r基因200 bp左右的DNA片段，以H₂O作為模板則沒有擴增出目的片段（圖5）。PCR 檢測結果初步證明同步靶向 StRTP5a和 StRTP5b的目的片段已整合到馬鈴薯基因 組中。

2.3.2 轉基因株系中StRTP5a和StRTP5b的表達量檢測 將PCR鑒定為陽性的馬鈴薯株系分別提取總RNA，反轉錄后合成cDNA并作為模板，以StEF1α作為內參基因，利用RT-qPCR技術檢測轉基因馬鈴薯株系中 StRTP5a和 StRTP5b的表達量。分析結果顯示，與馬鈴薯野生型‘Désirée’相比，8株轉基因株系中 StRTP5a和 StRTP5b基因的表達量均顯著下調，轉基因馬鈴薯株系中 StRTP5a和 StRTP5b基因表達量降幅為30%～70%，其中，StRTP5a/b i-2和StRTP5a/b i-7株系中 StRTP5a和 StRTP5b基因表達量同時下調且下調最多，說明轉基因株系中 StRTP5a和 StRTP5b基因的表達都受到顯著抑制（圖6），并且StRTP5a/b i-2和StRTP5a/b i-7株系中 StRTP5a和 StRTP5b基因同時下調最明顯，可被選取用于下一步試驗分析。

3 討 論

本研究利用Gateway技術構建了同步靶向馬鈴薯 StRTP5a和 StRTP5b基因的RNAi表達載體，并以四倍體馬鈴薯品種‘Désirée’作為受體材料，采用農桿菌介導的遺傳轉化法獲得了同步沉默 StRTP5a和 StRTP5b基因的轉基因馬鈴薯株系（圖1-6）。RNAi是一種在轉錄后水平通過細胞內的dsRNA誘發同源mRNA高效特異性降解，能有效阻斷目的基因表達，從而獲得功能缺失突變體^{［15，27］}。RNAi技術作為反向遺傳學研究的重要工具之一，已被廣泛應用于植物功能提取葉片總RNA并反轉錄合成cDNA，以馬鈴薯管家基因StEF1α作為內參基因，利用RT-qPCR分析轉基因株系中 StRTP5a和 StRTP5b基因的表達量。將馬鈴薯野生型‘Désirée’中 StRTP5a和 StRTP5b基因的表達量設為1。

基因組學和分子育種新材料的創制^［28］。而構建高效的RNAi植物表達載體是實現目標基因有效沉默的關鍵。研究表明，不同類型的RNAi載體結構和所選目標基因的靶向片段位置以及長度都會影響最終目標基因的沉默效果^{［16，29］}。例如，雙鏈RNA尤其是含內含子發卡結構的RNA（intron-containing hairpRNA，ihpRNA）對目標基因的沉默效果顯著高于正義或反義RNA結構。所選目標基因的靶向片段位置靠近起始密碼子，且靶向DNA片段的GC含量為40%～60%。雖然所選片段的長度為100～1 200 bp可以抑制目標基因的表達，但所選片段太短不利于載體構建，片段太長則不利于所形成dsRNA的穩定性，通常所選最適片段長度為200～600 bp。能夠符合上述幾個前提條件，細胞內形成的dsRNA可最大限度誘導目標基因的沉默^{［16，29］}。因此，本研究基于上述條件構建同步靶向 StRTP5a和 StRTP5b的RNAi載體（圖2和圖3），能夠獲得同時有效抑制 StRTP5a和 StRTP5b基因表達的馬鈴薯材料（圖4-6）。

到目前為止，關于馬鈴薯遺傳轉化方法的報道較多^［6］。例如，PEG或電轉染馬鈴薯原生質體，以及農桿菌（根癌農桿菌或發根農桿菌）和基因槍法介導的馬鈴薯遺傳轉化方法等。這些方法用于馬鈴薯遺傳轉化都各有優劣，但農桿菌，特別是根癌農桿菌介導的遺傳轉化依然是目前最常用的馬鈴薯遺傳轉化方法。農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化方法的外植體通常包括馬鈴薯的莖段、葉片和塊莖或試管薯薄片等^［2-6］。在農桿菌介導的遺傳轉化方法中，莖段和葉片作為外植體進行了首個利用根癌農桿菌進行馬鈴薯遺傳轉化體系的建立，并且發現在該轉化體系中葉片作為外植體得到了更好的遺傳轉化效果^［23］。隨后以葉片作為外植體進行馬鈴薯遺傳轉化被廣泛使用^［3］。而以塊莖或試管薯薄片作為外植體進行農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化體系也在不同的實驗室相繼建立^［2，30］。本研究參照An等^［23］建立的方法，以‘Désirée’的葉片作為外植體，不經歷外植體的預培養過程，在愈傷誘導培養基上2周左右可產生抗性芽，5～6周左右可獲得完整的轉化植株（圖5），并且所檢測的轉化株系都攜帶T-DNA的片段，陽性率達到了100%（圖6）。因此，本研究所用的馬鈴薯遺傳轉化體系的效率是較高的。

本研究利用Gateway技術構建同步靶向 StRTP5a和 StRTP5a基因的RNA干擾載體，并以四倍體馬鈴薯品種‘Désirée’的葉片作為外植，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得了同時沉默 StRTP5a和 StRTP5b基因的轉基因馬鈴薯植株，為后續進一步研究馬鈴薯 StRTP5a和 StRTP5b基因的生物學功能奠定基礎。

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Construction of an RNAi Vector Targeting both StRTP5a and StRTP5b Genes in Potato and Generation of Transgenic Potato Lines with Silenced StRTP5a and StRTP5b

ZHANG Jiaxin， MA Wenzhong， DANG Yaru， JIAO Wenjing， LI Ao， MAI Xueni， QIAN Guanyu， SHAN Weixing and SONG Yin

（State key Laboratory for Crop Stress Resistance and High-Efficiency Production， College of Agronomy， Northwest Aamp;F University， Yangling Shaanxi 712100， China）

Abstract The WD40 protein-encoding gene RTP5 （Resistance to Phytophthora 5） acts as a novel regulator of plant immunity， negatively regulating plant resistance to Phytophthora pathogens.This study aimed to obtain transgenic potato lines with concurrent silencing of both StRTP5a and StRTP5b genes for further functional analysis.A DNA fragment targeting both StRTP5a and StRTP5b genes was amplified from the cDNA of the tetraploid potato cultivar ‘Désirée’ and inserted into the plant expression vector pHellsgate12 using the gateway recombination cloning technology.The resultant destination vector， pHells12-StRTPa/b.targeting both StRTP5a and StRTP5b genes， was successfully generated.Subsequently， it was introduced into potato cultivar ‘Désirée’ via Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation.Eight transgenic potato lines with simultaneous silencing of both target genes were obtained after thorough PCR and qPCR analysis.Expression levels of both StRTP5a and StRTP5b genes were reduced by up to 70% or more in transgenic lines compared to the wild-type potato cultivar ‘Désirée’.

Key words Potato; RNAi; Genetic transformation; WD40 domain-containing protein

Received 2024-04-03

Returned 2024-05-05

Foundation item National Key Ramp;D Program of China（No.2022YFF1002700）.

First author ZHANG Jiaxin， female，master’s student.Research area：molecular breeding for late blight resistance in potato.E-mail：992073723@qq.com

Corresponding author SONG Yin， male， associate professor.Research area：genetic and molecular basis of plant disease resistance.E-mail：yin.song@nwafu.edu.cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）