甘藍型油菜亞麻酸含量性狀QTL定位與候選基因分析

摘 要 為探究甘藍型油菜亞麻酸含量性狀相關的QTL，以KN群體為試驗材料，通過連續7 a的油菜種子亞麻酸含量表型數據，并結合KN高密度遺傳連鎖圖譜采用復合區間作圖法對油菜亞麻酸含量QTL進行定位研究。結果表明，共鑒定到72個亞麻酸含量QTL，主要分布在10條染色體上，其中A08染色體上的亞麻酸含量QTL最多有18個，A10和C03染色體上QTL數量次之，均有11個QTL，單個QTL可解釋的表型變異范圍為2.67%～17.26%。在A08染色體上鑒定到3個亞麻酸含量主效QTL，包括 cqC18：3-A8-1、cqC18：3-A8-3和 cqC18：3-A8-4。通過對區間內的基因進行基因注釋和分析共得到11個亞麻酸含量相關的候選基因。

關鍵詞 甘藍型油菜；雙單倍體株系；亞麻酸含量；QTL分析；候選基因鑒定

油菜是世界上廣泛種植的油料作物之一，在食用油供給上起著重要的作用，是國產植物油最大油源^［1］。菜籽油是中國的主要食用油之一，菜籽油的油酸含量高，飽和脂肪酸含量低，亞油酸和亞麻酸的含量合理，同時還富含甾醇、多酚、維生素E等微量營養功能物質，是國際上推薦的健康食用植物油之一^［2-4］。隨著人們物質生活水平的提升，不僅對食用油的數量需求日漸增加，對食用油的品質也有了更高的要求，尤其是食用油的保健功能。越來越多的研究表明攝入過多飽和脂肪酸是導致心血管疾病的主要原因之一，而食用富含高不飽和脂肪酸的植物油有利于健康，廣受青睞，因此通過油菜品質的改良來提高食用油品質也備受關注。雙低菜籽油是一種脂肪酸構成比較合理的食用油，其脂肪酸中飽和脂肪酸僅占7%左右，而單不飽和脂肪酸可達到63%左右，多不飽和脂肪酸亞油酸和亞麻酸分別占大約20%和9%^［5］。隨著油菜育種工作研究的發展，通過優化菜籽油脂肪酸組分來改善油脂品質成為當前油菜育種的一個重要工作。

α-亞麻酸是一種人體必需的且不能自身合成需從日常飲食中獲取的不飽和脂肪酸，對人體健康起著非常重要的作用。α-亞麻酸不僅是人體各組織生物膜的結構材料，也是ω-3的前體，在人體吸收、代謝后先產生前列腺素PG，通過前列腺素PG在人體內再產生EPA（20：5）、DHA（22：6）、DPA（22：5）等ω-3系列不飽和脂肪酸^［6］。研究表明EPA具有抗炎、抗血栓形成、抗心律失常、降血脂和舒張血管的功效，DHA是人體大腦脂質的重要組成部分，對智力和視網膜的發育起著決定性的作用^［7］。天然的EPA、DHA主要在硅藻、紅藻、褐藻等藻類生物中合成，通過食物鏈進入魚類、甲殼類海產動物中。作為天然的EPA、DHA資源庫，海產動物資源有限、打撈和提煉過程復雜，不僅難以大規模生產還容易造成環境污染。經研究發現部分植物油，如亞麻籽油、紫蘇籽油和菜籽油等植物油也含有α-亞麻酸，其中菜籽油脂肪酸組分結構合理，亞麻酸含量豐富，且種植范圍廣、產量高，因油菜在農業種植上的優勢，使通過菜籽油來實現大規模生產α-亞麻酸成為可能。李殿榮于2016年提出高亞麻酸育種的概念，將亞麻酸含量提高至15%以上作為高亞麻酸育種的目標^［3］，經過育種工作者多年的努力目前，已報導的高亞麻酸品種有貴州省農科院選育的高亞麻酸蘿卜質雜交油菜新品種‘油研712’，亞麻酸含量 16.2%，陜西省雜交油菜研究中心育成的‘華春油1號’亞麻酸含量高達14.7%，高亞麻酸油菜育種已初見成效。

目前，在甘藍型油菜中對C18：3含量性狀的研究主要集中在創制高亞麻酸含量的種質和培育高亞麻酸含量的新品種，而在亞麻酸含量相關的分子機制方面的研究鮮有報道。本研究通過小孢子培養技術構建了甘藍型油菜348份雙單倍體系定位群體，通過分子測序和標記檢測構建了遺傳連鎖圖譜。通過對連續7 a的C18：3含量表型進行分析，結合遺傳圖譜，利用復合區間作圖進行QTL定位分析，同時進行候選基因篩選，為培育高C18：3含量的新品種奠定分子基礎。后續可根據QTL定位和候選基因開發C18：3含量相關的分子標記，根據分子標記輔助育種改良甘藍型油菜的品質，選育出高C18：3含量的油菜新品種，滿足廣大人民群眾對優質健康食用油的需求。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以甘藍型油菜KN Double Haploid（DH）群體作為試驗材料。KN DH群體是以‘N53-2’為母本，‘KenC-8’為父本進行雜交，在F₁代通過小孢子培養構建，群體中包括了348份DH純系。

1.2 田間試驗

將KN群體及其親本在陜西大荔（2012DL-2013DL）和楊凌連續7 a（2014YL-2018YL）種植。田間試驗采用完全隨機區組設計排列，KN DH群體在陜西大荔和楊凌各3個重復，每株系播種2行，行距0.4 m。于每年6月初，待油菜籽粒完全成熟時，每個DH株系收取混合種子，自然晾干，備用。

1.3 油菜亞麻酸（C18：3）含量性狀測定

油菜籽粒中亞麻酸（C18：3，%）含量利用近紅外反射光譜儀（NIRS）測定，參照Wang等^［8］的描述方法，該方法同時還可以測定的蛋白質（%）、油酸（C18：1，%）、亞油酸（C18：2，%）、芥酸（C22：1，%）、飽和脂肪酸（FAS，%）和硫苷（ μmol/g餅粕）的含量。

1.4 QTL定位

利用KN高密度遺傳連鎖圖譜和KN群體連續7 a C18：3表型數據，通過WinQTLcart 2.5軟件中的復合區間作圖法（CIM）進行QTL定位分析^［9］。以P=0.05分別對每個環境的表型進行 1 000次排布測驗方法（permutation test）確定LOD閾值，當LOD值大于閾值時，此時檢測到的QTL為顯著性QTL，命名為^［10］“Identified QTL”^［11］。Identified QTL命名以“q+性狀縮 寫+環境簡稱+染色體編號”^［12］。利用BioMercator 4.2軟件對不同環境中Identified QTL進行整合處理獲得consensus QTL。將在兩個種植環境表型變異≥10%或者一個種植環境表型變異≥20%的consensus QTL認定為主效QTL^［13］。

1.5 QTL置信區間和候選基因分析

在BnIR（https：//yanglab.hzau.edu.cn/BnIR）數據庫和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中與甘藍型油菜Darmor-bzh參考基因進行共線性比對并參考擬南芥數據庫的同源基因功能注釋，對超過兩年檢測到的QTL置信區間內的所有基因進行KEGG聚類分析，篩選確定與C18：3含量相關的候選基因。

1.6 候選基因表達定量分析

在油菜成熟期取新鮮的角果剝離出油菜種子，于-80℃冰箱中保存。使用總RNA提取試劑盒（Invitrogen，美國）提取總RNA，參照逆轉錄試劑盒ReverTra AceR qRT-PCR Kit （Toyobo，上海）說明書將DNase I處理后的RNA樣品反轉錄為cDNA。以BnActin為內參基因，每個反應包括3個平行復孔。qRT-PCR反應體系：1 μL cDNA模板，5 μLSYBR qPCR Mix（US EVERBRIGHT），10 μmol/L正、反向引物各0.4 μL，加ddH₂O補足至10 μL，用離心機混勻。qRT-PCR擴增程序：95℃30 s；95℃5 s，55℃10 s，72℃ 15 s，共40個循環。

1.7 數據整理與分析

運用 Microsoft excel 2019對試驗數據進行分析處理，圖形繪制采用 Origin2022和Adobe Illustrator CS6。

2 結果與分析

2.1 油菜KN群體亞麻酸含量表型變異分析

連續7 a檢測DH定位群體及其父本‘KenC-8’ 和母本‘N53-2’種子中C18：3的含量，對C18：3含量進行統計分析，結果如表1：兩親本間的亞麻酸含量差異顯著，父本‘Kc-8’的C18：3含量明顯高于母本‘N53-2’。從KN群體不同年份的亞麻酸含量分布圖（圖1）可以看出，亞麻酸含量分布符合正態分布或者接近正態分布，說明甘藍型油菜C18：3含量表現出了數量性狀的遺傳特點，同時，亞麻酸含量在不同的年份之間能夠穩定地遺傳和表達，在一定程度上也受生長環境的影響，圖1中能看出18 a的亞麻酸含量普遍偏高，可能與當年的氣候環境有關。

2.2 油菜DH群體亞麻酸QTL定位與分析

定位所用的圖譜包括3 207個標記，覆蓋油菜 3 072.7 cM基因組范圍，標記平均間距為 0.96 cM^［9］。利用該圖譜，結合多個年份亞麻酸含量表型值，利用WinQTLCart 2.5軟件對油菜KN群體7個種植年份C18：3表型結合KN高密度遺傳連鎖圖譜對油菜種子C18：3含量性狀進行QTL定位分析。

通過初步掃描定位，共鑒定到72個identified QTL（圖2，表2），檢出的與亞麻酸相關的QTL分別分布在A基因組的A3、A5、A6、A8、A9、A10和C基因組的C2、C3、C5、C9共10個染色體上，單個QTL可解釋的表型變異范圍為 3.04%～17.26%，解釋表現變異最大的QTL是qC18：3-09DL8-3，可解釋表型變異最小的QTL是qC18：3-16DL15-1。A基因組上有48個identified QTLs，在C基因組有24個identified QTLs，A08染色體上檢測到的QTL最多，為18個，其次是A10和C03染色體，均有11個QTL，C05和A09上檢測到的QTL也比較多，分別為10個和7個，其余5個染色體上檢測到的QTL較少。

2.3 油菜DH群體C18：3含量QTL整合

不同年份初步檢測到的QTL的置信區間會有不同程度重疊，使用BioMercator4.1軟件對初步檢測到的QTL進行整合，72個初步檢測到的identified QTL經整合后共40個consensus QTL（表2，圖3）。根據整合QTL的結果能看出，表現最穩定的QTL為 cqC18：3-A8-3和 cqC18：3-C3-1，在6個年份中都能重復檢測到，基本不受種植環境的影響，說明這兩個QTL屬于環境穩定QTL。穩定表達的QTL在選育C18：3含量高的材料選擇和分子育種QTL位點利用及性狀相關基因功能研究方面都具有重要意義。

根據主效QTL的定義，如果一個QTL在一個環境中表型變異達到20%，或者至少2個環境表型變異達到10%可認定為主效QTL，在本群體的定位結果中 cqC18：3-A8-1、cqC18：3-A8-3、cqC18：3-A8-4可被認定為甘藍型油菜亞麻酸含量性狀的主效QTL（圖4）。其中 cqC18：3-A8-1在除2015年、2016年以為的5個年份都被檢測到，可解釋的表型變異分別為12.64%、15.64%和 13.06%； cqC18：3-A8-3在除2017年外的6個年份被檢測到，該QTL12年的表型變異最大，為 13.34%，2015年的表型變異最小，為10.13%； cqC18：3-A8-4在2012年、2015年和2016年3個年份被檢測到。檢測到的3個主效QTL的加性效應均為負值，該結果表明，這3個主效QTL 的貢獻率主要來自于父本KenC-8。

2.4 油菜C18：3含量主效QTL置信區間候選基因鑒定

根據甘藍型油菜高密度遺傳連鎖圖譜與甘藍型油菜“Darmor-bzh”基因組間的共線性關系，對定位到的QTL區間內的基因進行分析，兩年以上能重復定位到的QTL對應的區間內的基因共有2 078個，其中 cqC18：3-A8-1、cqC18：3-A8-3、cqC18：3-A8-4 3個主效QTL區段內檢索到537個基因。對這些基因的功能進行KEGG聚類分析，其中參與脂肪酸鏈延長的基因有6個： BnaA10g25660D、BnaA10g25350D、BnaA10g21780D、BnaA08g11140D、BnaA08g11130D、BnaA08g08280D；與脂質合成蛋白相關的基因有7個 BnaC03g67820D、BnaA10g24190D、BnaA10g21780D、BnaA10g20970D、BnaA08g08280D、BnaA08g07100D、BnaA08g06960D，將這11個基因作為影響亞麻酸含量潛在的候選基因，并對這些基因的功能進行注釋（表3）。

同時，在油菜成熟期，取兩親本新鮮莢果中的油菜種子進行qPCR檢測，上述11個候選基因在兩親本中的表達量進行鑒定，結果見圖5，其中，BnaA08g11140D基因在兩親本之間的表達無顯著性差異，BnaA10g20970D基因在Ken-8中的表達量顯著高與其在N53-2中的表達量，而剩余的 BnaA08g06960D等9個基因在C18：3含量更低的N53-2中表達量顯著高于C18：3含量更高的Ken-8中的表達量，這些表達差異大的基因極可能參與了C18：3合成途徑的調控，是C18：3含量的候選基因。

3 討 論

用于研究油菜遺傳分析的群體主要有F2、BC1、BC2等群體，但是這些群體都存在雜合位點顯性和非上位效應，表型受環境和細胞質的影響，在研究性狀遺傳的過程中很難獲得穩定的表型^［14］。而DH群體作為永久性分離群體，株系內基因型是純合的，避免細胞質對表型的影響^［15］，可以在不同環境下對基因型進行重復鑒定，結果準確可信。本研究構建了一個包含348個株系的KN群體，研究該群體在不同生態條件下的C18：3相關QTL，以期為后續選育高亞麻酸油菜品種提供理論依據。研究發現，父本‘KenC-8’的C18：3含量顯著高于母本‘N53-2’種子中C18：3的含量，在不同的年份環境下，DH群體的C18：3含量的表型數據基本呈現正態分布的規律，同時也表現出了超親遺傳的特點，表明C18：3含量的遺傳屬于數量性狀遺傳，受到基因和環境的共同影響。

QTL定位是研究數量性狀最有效的方法之一^［16］，目前，關于甘藍型油菜重要農藝性狀的QTL定位和分析的研究已多次報道。在甘藍型油菜脂肪酸的基因定位研究主要集中在含油量、油酸、亞油酸等組分，而對亞麻酸含量性狀相關的基因定位的研究比較少。在前人的研究中曾報道過，與亞麻酸含量相關的QTL大部分位于A4和C4連鎖群上^［17-19］，楊盛強等^［18］使用F₂代分離群體定位鑒定到了3個亞麻酸QTL，位于A04和C04染色體上；欽潔等^［19］使用高油酸A254和低油酸A177為親本，構建DH作圖群體，在DH群體中共檢測到7個亞麻酸QTL，也是位于A04和C04染色體上；蒙姜宇等^［20］同時用DH群體和IF₂群體檢測到與亞麻酸相關的21個QTL，分布于A01、A02、A03、A04等11條染色體上，可解釋的表型變異范圍為2.86%～11.91%。而本研究通過對連續7 a的348個DH株系的油菜種子的亞麻酸含量進行QTL定位，共鑒定到72個亞麻酸含量相關的QTL，主要位于A08、A10、C03、C05和A09等10條染色體上，解釋的表型變異范圍在2.67%-17.26%之間，定位結果的不同可能是由于定位群體不同所導致。同時獲得了在A08染色體上 cqC18：3-A8-1、cqC18：3-A8-3、cqC18：3-A8-4三個主效QTL。目前還沒有亞麻酸主效QTL位于A08染色體上的報道，因此，該研究所獲得的 cqC18：3-A8-1、cqC18：3-A8-3、cqC18：3-A8-4可能是新的亞麻酸主效QTL。

基于本研究QTL定位的結果，對在超過兩個環境中都存在的QTL位點進行了候選基因的挖掘。通過KEGG分析基因功能、qPCR進行基因差異表達分析，篩選出11個亞麻酸含量相關的候選基因。其中 BnaA10g24190D和 BnaA10g20970D均為長鏈酰基輔酶A合成酶（LACS）基因，LACS能催化游離的脂肪酸形成酰基輔酶A硫脂，在油脂合成及降解途徑中起著重要的作用，長鏈酰基輔酶A合成酶（LACSs）催化長鏈酰基輔酶A的合成，后者是TAG合成的主要底物之一，在油菜中LACS的研究較少，Ding等^［21］通過在油菜種子發育期過表達和敲降 LACS2基因，結果表明過表達 LACS2基因C18：3的含量略有降低，而敲降 LACS2基因則會使C18：3的含量增加，在本研究中，BnaA10g24190D基因在C18：3含量更高的Ken-8中表達量要顯著低于C18：3含量較低的N53-2，而 BnaA10g20970D基因在兩親本中的表達差異不大，說明 BnaA10g24190D基因極有可能與亞麻酸的形成有關，其表達量可能與亞麻酸含量呈負相關。KCS基因家族是一個龐大的基因家族，FAE1也是KCS家族的一員，武玉花^［22］克隆并分析了17個KCS基因序列，發現KCS家族基因對油菜的芥酸合成有重要作用，在脂肪酸合成中也有一定功能，可將脂肪酸的鏈長從C18延伸到C20和C22，但未見其對油菜C18：3含量的影響的研究，本研究中得到的候選基因有四個屬于KCS家族，分別是 BnaA08g11130D、BnaA08g11140D、BnaA10g25350D和 BnaA10g25660D，而且從qPCR的結果能看出這4個基因的表達趨勢一致，在KenC-8的表達量要明顯低于N53-2，因此，這4個KCS家族的候選基因極有可能與亞麻酸的形成有關。BnaA08g06960D在擬南芥中的同源基因為 AT1G32200，又稱 ATS1，有研究表明通過基因編輯創建擬南芥 ATS1基因功能缺失型突變體，發現功能喪失型突變體葉片中的脂肪酸組分均發生大幅變化，C18：3的含量顯著提高，但并未對種子脂肪酸組分的變化進行研究^［23］，本研究中，C18：3含量更高的Kcen-8的 BnaA08g06960D表達量更低，因此該基因極有可能與C18：3的含量相關，可作為甘藍型油菜C18：3的候選基因，在后續的研究中應該對該基因對種子中的C18：3含量的影響做進一步研究。BnaA08g08280D基因在母本N53-2中的表達量遠高于父本Kcen-8在擬南芥中的同源基因為 AT4G17483，Guan等^［24］的研究表明，BnaA08g08280D可作為油酸含量性狀相關的候選基因，該基因在高油酸和低油酸油菜材料中存在序列差異，但并未對該基因與 C18：3性狀的關系進行深入研究，或許該基因不僅在脂肪酸代謝過程中有重要的作用，更是調節油菜種子C18：3的關鍵基因。BnaC03g67820D（FAD6）基因在基因注釋中的功能為ω-6脂肪酸去飽和酶活性的功能，在油菜種子發育過程中可能通過調節C18：1和C18：2去飽和來合成 C18：3，因此 BnaC03g67820D可作為候選基因。

油菜育種逐步多元化，亞麻酸育種已成為一個新的育種方向。由于亞麻酸對氧化敏感，在遇空氣、高溫、光照等條件極易氧化形成有臭味的氧化物，降低菜籽油的穩定性，使之易于氧化腐敗，不利于油脂儲存和運輸，在傳統的油菜育種中一直在降低亞麻酸的含量。早期研究還發現不飽和脂肪酸的雙鏈斷裂后容易形成自由基，從而損傷細胞與細胞膜的結構與功能^［25］。在甘藍型油菜育種過程中曾一直把亞麻酸降到3%以下作為育種目標，并通過甘芥雜交、EMS誘變、基因編輯等手段獲得了一些低亞麻酸材料，不論是國外還是國內在后續的育種過程中都成功降低了亞麻酸的含量^［26］。然而，隨著時代的發展，市場對品種的需求也會有所變化。由于中國菜籽油消費量大，食用植物油存儲時間短，周轉周期短，亞麻酸對油品的影響可以忽略，適度提高亞麻酸含量，增加中國居民通過食用菜籽油增加亞麻酸的攝入量應該放在更重要的位置。同時，亞麻酸因其具有保健功能而備受青睞，α-亞麻酸具有多種功能，可以通過抑制動脈粥樣硬化的形成來降低中風和冠心病的發病率^［27］，還可以有效提高神經認知能力，對肥胖和非酒精性脂肪肝也有很好的療效^［28］，有研究證明α-亞麻酸還可通過抑制脂肪酸合成酶的表達來抑制骨肉瘤細胞的增殖和轉移^［29］。作為人體必須的多不飽和脂肪酸，在體內并不能合成，需要從食物中獲取，中國甘藍型油菜種植面積廣、產量大，可以作為很好的亞麻酸來源。基于亞麻酸的保健功能，李殿榮關于油菜的亞麻酸育種^［3］提出要把適度提高亞麻酸的含量作為一個新的育種目標。因此，在后續的研究中應該更加關注亞麻酸合成的途徑和調控機理，對本研究獲得的與C18：3性狀關聯的主效QTL以及篩選到的候選基因進行更深入的研究，明晰其對C18：3含量的影響機理，進而為更好地選育高C18：3功能型油菜新品種奠定理論基礎。

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QTL Mapping and Candidate Gene Identification for C18：3 Content in Brassica napus L

SHANG Liping，LIANG Peixuan，CAO Xiaodong，ZHANG Lili， GUAN Zhoubo，LI Dianrong， LI Baojun and WANG Hao

（Rapeseed Hybrid Center of Shaanxi Province，Yangling Shaanxi 712100，China）

Abstract To investigate the quantitative trait loci （QTLs） associated with linolenic acid （C18：3） content in Brassica napus， we utilized the KN population was used as experimental material.A localization study was conducted using phenotypic data on linolenic acid content from rapeseed seeds collected over seven consecutive years， combined with composite interval mapping and the KN high-density genetic linkage map. The analysis identified 72 QTLs influencing linolenic acid content， distributed across 10 chromosomes. The highest concentration was on chromosome A08 with 18 QTLs， followed by 11 QTLs each on chromosomes A10 and C03. The phenotypic variation explained by individual QTLs ranged from 2.67% to 17.26%. Three major QTLs for linolenic acid content were located on chromosome A08， including cqC18：3-A8-1， cqC18：3-A8-3， and cqC18：3-A8-4. Through gene annotation and interval analysis， 11 candidate genes potentially linked to linolenic acid content were identified.

Key words Brassica napus; Double haploid population; C18：3 content; QTL analysis; Candidate gene identification

Received 2023-10-20

Returned 2024-03-01

Foundation item Key Ramp;D Plan of Shaanxi Province （No.2022NY-159）;Xizang Ali Science and Technology Plan（No.QYXTZX-AL2023-03）;Key Special Project for ‘Two Chain’ Integrated Crop Breeding in Shaanxi Province （No.2021LLRH-07-03-01）.

First author SHANG Liping， female，assistant research fellow. Research area：genetic breeding of rapeseed. E-mail：shang_liping@163.com

Corresponding author WANG Hao， male， research fellow. Research area：genetic breeding of rapeseed. E-mail：Wangzy846@sohu.com

（責任編輯：成 敏 Responsible editor：CHENG Min）