合作豬NTF3基因克隆、生物信息學分析及組織表達譜構建

摘 要 克隆合作豬神經營養因子3基因（Neurotrophin3，NTF3）的編碼區序列（Coding region sequence，CDS），預測分析其結構與功能，并檢測基因在不同組織中的表達量，構建組織表達譜。通過PCR擴增、Sanger測序等方法獲得合作豬NTF3基因CDS區序列，使用生物信息學方法分析其結構，并使用RT-qPCR技術檢測其在不同組織中的表達水平。結果顯示，合作豬NTF3基因CDS區長774 bp，編碼257個氨基酸；等電點（pI）為9.46，屬于堿性蛋白；合作豬與豬、牛親緣關系較近；二級結構主要為α-螺旋和無規則卷曲，三級結構主要由β-折疊、α-螺旋等組成；整條鏈中親水性氨基酸殘基數量多于疏水性氨基酸殘基數量，是親水性蛋白；無跨膜區域，是非跨膜蛋白；在37～58位氨基酸殘基有一個線圈結構域、64～79位有一個低復雜度結構域和144～249位有一個神經生長因子結構域；存在信號肽，推測是分泌蛋白；NTF3基因在合作豬脾臟的表達量最高，回腸表達量最低。

關鍵詞 合作豬；NTF3基因；克隆；生物信息學分析

繁殖是養豬生產的關鍵環節之一，對養豬業高質量內涵式發展起重要作用^［1］。豬繁殖性能是豬場選種選配的重要指標之一，在豬繁殖過程中，種公豬占據著舉足輕重的地位，其繁殖力影響母豬受胎率和后代生產性能，也影響育種效率和養殖效益，提高種公豬繁殖力是加快育種效率及獲得良好經濟效益的重要手段之一^［2-5］。合作豬（又稱山豬、蕨麻豬）是中國特有的小型高原型豬種，適應極端惡劣氣候環境，具有耐粗飼、適應性好、抗病力強等優良種質特性，使得該品種在甘肅自然條件差、交通閉塞、經濟相對落后的農牧藏區廣泛飼養（如卓尼縣、碌曲縣、迭部縣），為打贏脫貧攻堅戰貢獻了力量，鄉村振興背景下，合作豬理應繼續發揮重要作用，幫助牧民實現鄉村振興致富路，但合作豬繁殖力低，成為制約數量增加的因素之一^［6-8］。

神經營養因子3（Neurotrophin 3，NTF3）由瑞典卡羅林斯卡學院學者Ernfors于1990年發現，是一種靶細胞合成分泌并在胞體中發揮功能的小分子蛋白質，在動物神經細胞存活、生長及分化過程中起重要作用，也在動物睪丸生長發育、生精過程等方面具有重要功能^［9-11］。Cupp等^［12］發現，在雄性動物性別分化過程中，NTF3基因編碼蛋白能誘導前體支持細胞從中腎遷移至睪丸，這種細胞遷移是睪丸索形成的關鍵，還發現NTF3基因在動物睪丸生精過程中起重要作用；Ding等^［13］使用HE染色和RNA-Seq技術對20日齡、75日齡和270日齡杜洛克公豬和梅山公豬睪丸組織進行了形態學觀察和轉錄組測序，發現75日齡梅山豬睪丸生精小管有游離精子，而75日齡杜洛克豬卻沒有，還發現不同品種公豬及不同日齡相同品種公豬間的NTF3基因表達量差異顯著，表明NTF3基因參與梅山豬性成熟生物學過程；Clement等^［14］發現，在雄性動物性腺分化過程中轉錄因子SRY（Sex determining region Y）會結合到NTF3基因啟動子序列上，促進其轉錄，參與睪丸生長發育，表明NTF3基因是SRY執行睪丸生長發育功能的重要靶基因。由此說明，NTF3基因與豬繁殖密切相關，但未見合作豬NTF3基因的相關研究。

因此，本試驗對合作豬NTF3基因進行克隆、生物信息學分析和表達量檢測，為深入研究NTF3基因在合作豬性成熟過程中的生物學功能提供參考，也為合作豬繁殖性能的遺傳改良提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 選擇3頭3月齡合作公豬（甘南州合作市農戶飼養），屠宰后采集睪丸、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、空腸和回腸組織，液氮速凍后于-80℃保存。

1.1.2 主要試劑 TRIzol（全式金，北京）；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒和pMD19-T載體（寶生物，大連）；2×Taq Master Mix、DH5α感受態細胞、凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒（天根，上海）；其他試劑（索萊寶，北京）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 用Trizol法分別提取睪丸、心臟等組織總RNA，Qubit測定總RNA濃度和純度。以各組織總RNA為模板，根據說明書用反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.2.2 引物設計與合成 根據GenBank數據庫中豬NTF3基因mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1），引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增 以合作豬睪丸組織cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系20 μL：上、下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），2×Taq Master Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，RNase-Free H₂O 7 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s， 58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環； 72℃終延伸10 min。用1 %瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，按照凝膠回收試劑盒的操作說明回收純化目的片段。

1.2.4 克隆與測序 將純化片段與pMD19-T載體連接，轉化到DH5α細胞，在不含AMP^＋的液體培養基中震蕩培養45 min，涂板于LB固體培養基中，37℃恒溫培養箱中培養12 h，選取單菌落進行藍白斑篩選及PCR鑒定，選取陽性菌液進行Sanger測序。

1.2.5 生物信息學分析 使用軟件Vector NTI 15.5-Alignx比對測序序列及參考序列；軟件MEGA 7.0用于構建進化樹；采用軟件ProtParam（https：//www.expasy.org/resources/protparam）分析蛋白質理化性質；SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）軟件用于預測蛋白質三級結構；使用軟件SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測蛋白質二級結構；ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）軟件用于蛋白質親疏水性分析；采用軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白質跨膜結構；軟件SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）用于蛋白質信號肽分析；使用SMART軟件（http：//smart.embl.de/）分析蛋白結構域；NetNGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）軟件用于預測蛋白糖基化修飾位點；使用軟件PSORT（https：//psort.hgc.jp/form2.html）分析蛋白亞細胞定位；蛋白相互作用使用軟件STRING（https：//cn.string-db.org/） 分析。

1.2.6 表達量檢測 以cDNA為模板，使用熒光定量試劑盒檢測NTF3基因在睪丸、心臟等組織中的表達量。反應體系20 μL，其中SYBRPremix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上、下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），cDNA 2 μL，RNase Free H₂O 6.4 μL。反應條件：95℃預變性3 min； 95℃變性15 s，58℃ 退火15 s，72℃延伸20 s，40個循環。每個樣品重復3次，以β-actin為內參基因。

1.2.7 數據處理 用2^－△△Ct法^［15］計算相對表達量，結果用“平均值±標準差”表示，使用SPSS 20.0軟件的鄧肯氏（Duncan）法進行單因素顯著性檢驗，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 合作豬總RNA質量檢測

提取合作豬各組織總RNA，Qubit檢測結果顯示5S、18S和28S出現單峰，說明RNA樣品純度和完整性很好，可用于后續反轉錄試驗（圖1）。

2.2 合作豬NTF3基因比對

以合作豬睪丸組織cDNA為模板，PCR擴增NTF3基因CDS區，擴增產物測序后發現CDS區長774 bp，編碼257個氨基酸，將合作豬與豬NTF3基因（NM_00123152.1）的CDS區苷酸序列進行比對，合作豬在90位發生G到C的堿基突變（圖2-A），對應的30位氨基酸仍為絲氨酸，為同義突變（圖2-B）。

2.3 合作豬NTF3基因進化樹構建

下載豬（XM_021090891.1）、綿羊（XM_004006944.5）、黃牛（XM_024991870.1）、貓（NM_001009367.1）、狗（XM_038437918.1）、馬（XM_023643012.1）、獼猴（XM_015150881.2）、黑猩猩（XM_016922826.2）、人（NM_001102654.2）、兔子（XM_008259713.3）、家鼠（NM_001164035.2）、雞（NM_001109762.2）、和斑馬魚（NM_001327813.1）NTF3基因CDS編碼的氨基酸序列，使用MEGA 7.0軟件構建NTF3基因氨基酸序列分子進化樹，發現親緣關系中合作豬與豬的關系最近，其次為綿羊和黃牛，與斑馬魚的親緣關系最遠（圖3）。

2.4 合作豬NTF3蛋白理化性質分析

運用ProtParam軟件分析合作豬NTF3蛋白理化性質，了解其氨基酸組成。結果顯示，合作豬NTF3蛋白分子質量29.61 ku，含有257個氨基酸，分子式為C₁₃₀₅H₂₀₇₁N₃₈₃O₃₈₅S₁₀，消光系數（γ=280 nm）為45 755，理論等電點（pI）為9.46，不穩定系數為54.06，親水性平均值為 -0.68；氨基酸殘基中帶負電荷的天冬氨酸殘基和谷氨酸殘基28個，帶正電荷的精氨酸殘基和賴氨酸殘基40個，氨基酸殘基中精氨酸（8.9%）和絲氨酸（8.9%）比例較高（表2）。

2.5 合作豬NTF3蛋白二級結構和三級結構 預測

運用在線軟件SOPMA預測合作豬NTF3蛋白二級結構，發現二級結構由23.35%的α-螺旋、15.56%的延伸鏈、4.28%的β-轉角和 56.81%的無規則卷曲構成（圖4-A）。采用在線軟件SWISS-MODEL對合作豬NTF3蛋白進行同源建模，預測其三級結構，發現該蛋白的三級結構主要由α-螺旋、延伸鏈、無規則卷曲構成（圖4-B），與二級結構預測結果基本一致。

2.6 合作豬NTF3蛋白親疏水性分析

運用ExPASy在線軟件中Protscale分析合作豬NTF3蛋白的親疏水性，結果顯示氨基酸序列中第139位出現最小疏水值（-3.056），第7位出現最大疏水值（2.733），整條鏈中親水性氨基酸殘基多于疏水性氨基酸殘基，預測NTF3蛋白為親水性蛋白（圖5）。

2.7 合作豬NTF3蛋白跨膜區及蛋白信號肽 預測

運用TMHMM軟件預測合作豬NTF3蛋白跨膜區，預測期望值為0，說明該蛋白屬于非跨膜蛋白（圖6-A）。運用SignalP軟件預測合作豬NTF3編碼蛋白是否存在信號肽，發現合作豬NTF3蛋白具有信號肽，說明該蛋白為分泌型蛋白（圖6-B）。

2.8 合作豬NTF3蛋白的亞細胞定位分析

采用PSORT Ⅱ軟件對合作豬NTF3蛋白進

行亞細胞定位分析，發現分布在細胞核（52.3%）、細胞質（13.0%）、細胞骨架（13.0%）、線粒體（13.0%）和胞外（8.7%），說明NTF3蛋白主要分布于細胞內（圖7）。

2.9 合作豬NTF3蛋白結構域預測

使用SMART軟件預測合作豬NTF3蛋白結構域的位置和種類，發現在37～58位氨基酸殘基之間有一個線圈結構域、64～79位有一個低復雜度結構域和144～249位有一個神經生長因子結構域（圖8）。

2.10 合作豬NTF3蛋白糖基化修飾位點

通過NetNGlyc 1.0軟件預測合作豬NTF3蛋白糖基化修飾位點，發現在第126位及131位氨基酸處各存在1個N-糖基修飾位點（圖9）。

2.11 合作豬NTF3蛋白相互作用分析

通過STRING 11.5軟件分析發現，NTF3蛋白可能與成纖維細胞因子2（FGF2）、腦源性神經營養因子（BDNF）等蛋白有相互作用（圖10）。

2.12 NTF3基因在合作豬各組織中的表達量

使用RT-qPCR檢測NTF3基因在合作豬不同組織中的表達水平，統計學分析發現所有組織均表達，脾臟表達量最高，且極顯著高于心臟、睪丸等組織（Plt;0.01），睪丸表達量較高，極顯著高于腎臟、肺臟、肝臟等組織（Plt;0.01）（圖11）。

3 討 論

中國人食用豬肉的歷史非常悠久，可追溯到 7 000年前，豬肉是人們日常的動物蛋白來源之一^［16-17］。目前，中國生豬養殖主要是歐美商品豬種（如杜洛克豬、長白豬、大白豬等），其生長性能較好，但肉質欠佳^［18-21］。當前，消費者愈發重視豬肉品質，要求豬肉營養豐富、風味好、安全優質。合作豬是一個品質優良的地方小型豬品種，骨細皮酥、肉質細嫩、口感鮮香、綠色健康，深受消費者喜愛^［7，22］。但合作豬繁殖性能較低，限制了其大量飼養，從遺傳上篩選豬繁殖性狀候選基因并解析其具體作用機制，進而提高豬種繁殖力是主要途徑之一。NTF3基因在動物性腺中表達，通過自分泌和旁分泌途徑合成不同激素，參與卵泡發生及排卵、精子生成等過程，影響動物繁殖力^{［7，14，23］}。夏文^［24］使用PCR-RFLP技術分析杜洛克豬、長白豬、大白豬 NTF3基因啟動子序列多態性，發現不同基因型與公豬繁殖性狀密切相關；Ding等^［13］采用Western-blot技術檢測杜洛克和梅山公豬睪丸中的NTF3蛋白表達量，發現表達量差異顯著， NTF3基因參與梅山公豬睪丸成熟過程。以上研究表明， NTF3基因參與動物睪丸生長發育過程，可作為提高豬繁殖力的標記基因。目前，尚未見合作豬 NTF3基因的相關報道。因此，本研究克隆合作豬 NTF3基因并檢測其在不同組織中的表達量。

合作豬 NTF3基因CDS區序列長774 bp，編碼257個氨基酸，分子質量29.61 ku，理論等電點9.46，這與陳志鵬等^［25］對牙鲆 NTF3基因的研究結果不一致，牙鲆 NTF3基因CDS區序列894 bp，編碼297個氨基酸，分子質量33.73 ku，理論等電點9.56，表明 NTF3基因有種屬差異性。合作豬NTF3蛋白富含精氨酸，屬于堿性蛋白，其二級結構及三級結構均以α-螺旋為主，推測α-螺旋在蛋白結構中扮演支撐和穩定的角色；合作豬NTF3蛋白不穩定系數為54.06，推測具有高頻的結構重排和不穩定性，屬于不穩定性蛋白，可能與其發揮的功能有關；系統進化樹結果發現，合作豬與黃牛、羊親緣關系較近，與斑馬魚遺傳距離最遠，說明該基因具有種屬特異性，在哺乳動物的進化過程中較為保守；合作豬NTF3蛋白無跨膜區，存在信號肽序列，說明不是跨膜蛋白，是分泌型蛋白，能在細胞外起作用，與亞細胞定位預測結果一致。

蛋白質結構域是指在分子質量較大的蛋白質分子中，多肽鏈上相鄰的二級結構彼此緊密聯系，形成了多個在空間上能明顯區別的區域，每個結構域由氨基酸殘基組成，各有獨特的空間結構，承擔不同的生物學功能^［26-27］。本研究發現合作豬NTF3蛋白包含線圈結構域、低復雜度結構域和神經生長因子結構域，提示這三個結構域是NTF3蛋白執行生物學功能的重要結構基礎。合作豬NTF3蛋白互作網絡圖顯示，有密切關系的蛋白有FGF2、NGFR等。已證實FGF2蛋白^［28-29］在牦牛和水牛睪丸及卵巢生長發育過程中起關鍵作用，NGFR蛋白^［30-31］則在卵泡顆粒細胞增殖、精子生成、類固醇激素分泌等過程中發揮重要功能，提示NTF3蛋白很可能通過FGF2、NGFR等蛋白調控合作豬繁殖生物學過程。為了探究合作豬不同組織中的 NTF3基因表達豐度，采用RT-qPCR檢測了 NTF3基因表達量，結果發現睪丸表達量較高，表明 NTF3基因在合作豬睪丸發育和精子生成過程中發揮著重要功能。

綜上，本試驗結果可為深入研究 NTF3基因在合作豬睪丸發育的具體作用提供依據，為其遺傳改良和品種選育提供參考，助推合作豬產業做大做強，助力鄉村振興。

4 結 論

合作豬 NTF3基因CDS區長774 bp，編碼257個氨基酸；合作豬與黃牛、綿羊親緣關系較近；二級結構以α-螺旋和無規卷曲為主；NTF3蛋白是非跨膜蛋白，存在信號肽，是分泌蛋白。

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Cloning，Bioinformatics Analysis and Tissue Expression Profile Construction of NTF3 Gene in Hezuo Pig

YAN Zunqiang¹，LU Yawei¹，GUN Shuangbao^{1 ，2}and WANG Pengfei¹

（1.College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China; 2.Gansu Research Center for Swine Production Engineering and Technology，Lanzhou 730070，China）

Abstract The coding region sequence （CDS） of NTF3 gene in Hezuo pig was cloned to predict and analyze its structure and function，and expression levels in different tissues of Hezuo pig was detected to construct a tissue expression profile.The CDS region sequence of NTF3 gene in Hezuo pig was obtained by PCR amplification and Sanger sequencing，and analyzed by bioinformatics.The results showed that the CDS of NTF3 gene was 774 bp，encoding 257 amino acids.The isoelectric point （pI） was determined to be 9.46，belonging to alkaline protein.Hezuo pig had a close relationship with both pig and cattle.The secondary structure consisted of α-helix and random coil; while the tertiary structure was mainly composed of β-sheet and α-helix.The number of hydrophilic amino acid residues in the whole chain was more than that of hydrophobic amino acid residues，indicating a predicted hydrophilic protein.There was no transmembrane region，non-transmembrane protein; there was a coiled coil region domain between amino acid residues 37-58，a low complexity region domain at 64-79，and a nerve growth factor domain at 144-249，respectively.The NTF3 gene had the highest expression in the spleen and the lowest expression in the ileum of Hezuo pig.

Key words Hezuo pig; NTF3 gene; Clone; Bioinformatics analysis

Received 2023-07-18

Returned 2023-10-29

Foundation item Technology Innovation Team Project of Animal Husbandry Pig Industry in Gansu Agricultural University （No.GAU-XKTD-2022-25）; Modern Silk Road Cold and Drought Agricultural Science and Technology Support Project in 2022 （No.GSLK-2022-10）; Lu-Gan Technology Collaboration Project （No.YDZX2021113）; Gansu Provincial Education and Science and Technology Innovation Project （No.GSSYLXM-02）.

First author YAN Zunqiang，male，lecturer.Research area：pig genetic breeding and reproduction. E-mail：yanzunqiang@163.com

Corresponding author GUN Shuangbao，male，professor.Research area：teaching，scientific research and extension of pig genetics，breeding and reproduction.E-mail：gunsb056@126.com

WANG Pengfei，male，lecturer.Research area：pig reproductive physiology.E-mail：wangpf815@163.com

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）