同步輻射μ-XRF用于金銀花中砷的吸收分布和轉(zhuǎn)運(yùn)趨勢(shì)研究

DOI：10.16255/j.cnki.ldxbz.2025.01.011

［摘" 要］" 金銀花因環(huán)境因素影響，砷超標(biāo)問(wèn)題嚴(yán)重。采用水培法，模擬有機(jī)砷與無(wú)機(jī)砷脅迫，探究金銀花的主要酶活性變化，并應(yīng)用同步輻射X射線熒光光譜（μ-XRF）技術(shù)解析砷在金銀花中的吸收、分布及轉(zhuǎn)運(yùn)趨勢(shì)。使用不同形態(tài)不同濃度的砷脅迫金銀花植株，測(cè)定葉片的生化指標(biāo)，包括過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD），生化結(jié)果顯示：在低濃度砷脅迫下，多個(gè)生化指標(biāo)能夠積極響應(yīng)，低濃度無(wú)機(jī)砷與高濃度有機(jī)砷脅迫對(duì)POD活性的影響相近，兩種形態(tài)的砷長(zhǎng)時(shí)間脅迫，都會(huì)使POD顯著上升；高濃度有機(jī)砷脅迫使CAT急劇下降，表明植物自身的保護(hù)機(jī)制受損；SOD的變化因砷形態(tài)而異，無(wú)機(jī)砷條件下呈V型波動(dòng)，有機(jī)砷條件下則持續(xù)降低，表明植物細(xì)胞調(diào)節(jié)能力受限。μ-XRF分析顯示：無(wú)機(jī)砷主要蓄積于植物的根部表皮層，根與莖共同形成攔截屏障；有機(jī)砷主要蓄積于金銀花根部維管柱。這為評(píng)估重金屬污染對(duì)藥材品質(zhì)的影響及探索減少藥用部位重金屬積累策略提供科學(xué)依據(jù)。

［關(guān)鍵詞］" 砷；金銀花；抗氧化酶；形態(tài)分布

［中圖分類號(hào)］" R 284.1;O 434.13" ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］" A" ［文章編號(hào)］" 1005-0310（2025）01-0069-09

［收稿日期］" 2024-05-06

［基金項(xiàng)目］" 國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目

“道地藥材土壤中砷的種態(tài)及其再分配機(jī)制的原位研究”（11975048）。

［作者簡(jiǎn)介］" 周俊彤（1998—），女，河南鄭州人，北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院碩士研究生，主要研究方向?yàn)樘烊恢兴幉?；張伊彤?003—），男，北京市人，北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院本科生，主要研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全；彭聰男（1999—），男，北京市人，北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院碩士研究生，主要研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)；霍清（1966—），女，北京市人，北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院教授，主要研究方向?yàn)樘烊恢兴幉姆蛛x與純化工藝。

［通訊作者］" 劉美（1978—），女，北京市人，北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院助理研究員，主要研究方向?yàn)閼?yīng)用化學(xué)。E-mail：linmei200802@163.com

Study on the Absorption Distribution and Translocation Trends of

Arsenic in Lonicera Japonica Thunb Using Synchrotron Radiation μ-XRF

ZHOU" Juntong， ZHANG" Yitong， PENG" Congnan， HUO" Qing， LIU" Mei

（College of Biochemical Engineering，" Beijing Union University， Beijing 100023， China）

Abstract："" Environmental factors significantly impact the accumulation of arsenic in Lonicera japonica Thunb. This thesis employed a hydroponic method to simulate stress from organic and inorganic arsenic and investigate the changes in key enzyme activities in Lonicera japonica Thunb. Furthermore， synchrotron radiation X-ray fluorescence spectroscopy （μ-XRF） was used to analyze the absorption， distribution， and translocation trends of arsenic within the plant. The Lonicera japonica Thunb plants were subjected to arsenic stress at different concentrations and forms， and biochemical indicators of their leaves， including peroxidase （POD）， catalase （CAT） and superoxide dismutase （SOD）， were measured. The biochemical results showed that under low-concentration arsenic stress， multiple biochemical indices could respond positively. The effects of low-concentration inorganic arsenic and high-concentration organic arsenic stress on POD activity were similar， with prolonged exposure to both forms of arsenic significantly increasing POD activity. High-concentration organic arsenic stress caused a sharp decline in CAT activity， indicating damage to the plant’s protective mechanisms. Changes in SOD activity varied depending on the form of arsenic， with a V-shaped fluctuation under inorganic arsenic conditions and a continuous decrease under organic arsenic conditions， indicating limited cellular regulatory capacity in plants. μ-XRF analysis revealed that inorganic arsenic primarily accumulates in the epidermal cortex of the roots， with the roots and stems forming an interception barrier. In contrast， organic arsenic concentrates in the root center and is mainly distributed in the outer epidermis of the stem. These findings provide scientific evidence for assessing the impact of heavy metal contamination on the quality of medicinal plants and exploring strategies to reduce heavy metal accumulation in medicinal plant parts.

Keywords： arsenic；Lonicera japonica Thunb；antioxidant enzymes；morphological distribution

0" 引言

在工業(yè)化快速發(fā)展的背景下，

中藥的重金屬污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，成為影響中藥質(zhì)量及國(guó)際認(rèn)可度的關(guān)鍵問(wèn)題［1-2］ 。砷作為一種具有顯著環(huán)境毒性的類金屬元素，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。2015版

《中國(guó)藥典》及ISO均對(duì)中藥材中砷的濃度設(shè)定了嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)［3］，但砷的毒性不僅與其濃度相關(guān)，更依賴于其化學(xué)形態(tài)。環(huán)境中的砷以無(wú)機(jī)砷

（如As2O3、As2O5）和有機(jī)砷

（如一甲基砷酸（monomethyl arsenic acid， MMA）、二甲基砷酸（dimethyl arsenic acid， DMA）、三甲基砷酸（trimethyl arsenic acid， TMA））等形態(tài)存在，無(wú)機(jī)砷的毒性通常高于有機(jī)砷，三價(jià)砷的毒性高于五價(jià)砷［4-5］。

金銀花作為我國(guó)重要的名貴中藥材，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，在亞洲和歐洲國(guó)家受到廣泛認(rèn)可。但研究顯示金銀花中砷的超標(biāo)率較高，對(duì)藥材品質(zhì)構(gòu)成威脅。砷可通過(guò)生長(zhǎng)環(huán)境、干燥、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)進(jìn)入中藥，因此對(duì)其化學(xué)形態(tài)的分析至關(guān)重要。

目前，常用的砷形態(tài)檢測(cè)方法有電感耦合等離子體-質(zhì)譜法（ICP-MS）［6］、氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法（HG-AFS）等［7］，但這些方法在檢測(cè)靈敏度、分辨率等方面存在局限。同步輻射技術(shù)（SR）作為研究金屬元素特征的理想工具，具有高亮度、高分辨率的特點(diǎn)［8］。X射線熒光光譜法（XRF）作為一種非破壞性的元素分析方法，通過(guò)熒光波長(zhǎng)或能量鑒定元素種類，適用于多種形態(tài)和類型的材料，同步輻射X射線熒光

（μ-XRF）分析能進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)元素分布的原位測(cè)定，具有高靈敏度、快速且非破壞性的特點(diǎn)，能在微米級(jí)尺度上揭示元素的空間分布［9］。

本研究探討了不同形態(tài)砷脅迫對(duì)金銀花生化指標(biāo)的影響，

利用μ-XRF技術(shù)測(cè)定金銀花中各種砷化合物的形態(tài)、微區(qū)分布及濃度變化趨勢(shì)。通過(guò)深入研究土壤中重金屬進(jìn)入藥用植物的路徑和蓄積形態(tài)，為重金屬安全性的客觀評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ)，為中藥材的質(zhì)量控制和安全保障提供科學(xué)依據(jù)。

1" 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器

磷酸氫二鈉（天津化學(xué)試劑有限公司），愈創(chuàng)木酚（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），磷酸二氫鈉（南京化學(xué)試劑股份有限公司），甲硫氨酸（天津眾聯(lián)化學(xué)試劑公司），EDTA-Na2（上海麥克林生化科技有限公司），氮藍(lán)四唑（天津希恩思生化科技有限公司），過(guò)氧化氫（鄭州龍達(dá)化工產(chǎn)品有限公司），三氧化二砷（衡陽(yáng)市國(guó)茂化工有限公司），二甲基砷（衡陽(yáng)市鳳凰化學(xué)工業(yè)廠），Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液（廣東翁江化學(xué)試劑有限公司）。

北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)2025年1月第39卷第1期周俊彤等：同步輻射μ-XRF用于金銀花中砷的吸收分布和轉(zhuǎn)運(yùn)趨勢(shì)研究

METTLER AT201分析天平（瑞士梅特勒公司），MS7恒溫磁力攪拌器（IKAC-MAG），TG16B離心機(jī)（杭州川恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），F(xiàn)D-1A-50冷凍干燥機(jī)（北京宏達(dá)恒業(yè)科技有限公司），KH-250DB超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），UV-752型紫外分光光度儀（上海元析儀器有限公司），PHSJ-3F型pH計(jì)，DHG-9143A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新一儀器有限公司）。

1.2" 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1" 金銀花的培養(yǎng)和砷脅迫實(shí)驗(yàn)

本研究采用山東臨沂產(chǎn)的2年生金銀花樹(shù)苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將金銀花植株在無(wú)污染土壤中進(jìn)行為期兩個(gè)月的預(yù)培養(yǎng)，以確保葉片生長(zhǎng)旺盛。隨后，對(duì)植株進(jìn)行凈化處理，先用0.3%的KMnO4溶液清洗，再用去離子水徹底沖洗3遍，之后將植株置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行水培培養(yǎng)。金銀花植株的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)程

需要經(jīng)過(guò)逐步的適應(yīng)性調(diào)整，首先在1/6 Hoagland溶液中培養(yǎng)一周，然后轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland溶液中再培養(yǎng)一周，最后在全Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)一周。培養(yǎng)環(huán)境模擬自然條件下的晝夜變化，并確保培養(yǎng)箱處于通氣狀態(tài)。植株在自然光照下生長(zhǎng)，每天使用0.1 mmol

·L-1 HCl和0.1 mmol·L-1 NaOH將營(yíng)養(yǎng)液的pH值維持在5～6左右。培養(yǎng)條件保持晝夜溫度為28℃/20℃，晝夜?jié)穸葹?0%/60%，每3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。

經(jīng)過(guò)3周的水培培養(yǎng)后，向營(yíng)養(yǎng)液中加入不同濃度的砷（As），誘導(dǎo)植株進(jìn)入砷脅迫狀態(tài)。

1）全Hoagland營(yíng)養(yǎng)液組成

混合試劑：硫酸鉀 607 mg

·L-1，磷酸二氫銨 115 mg·L-1，硫酸鎂 493 mg·L-1，EDTA鐵鈉鹽 20 mg·L-1，硫酸亞鐵 2.86 mg·L-1，硼砂 4.5 mg·L-1，硫酸錳2.13 mg·L-1，硫酸銅 0.05 mg·L-1，硫酸鋅 0.22 mg·L-1，硫酸銨0.02 mg·L-1。

稱取混合試劑1.26 g和硝酸鈣0.945 g，溶于1 L的去離子水中，即為植物生長(zhǎng)所需的元素。

2）脅迫實(shí)驗(yàn)方法

有機(jī)砷二甲基砷酸（DMA）水培實(shí)驗(yàn)：以全Hoagland營(yíng)養(yǎng)液作為培養(yǎng)溶液，在營(yíng)養(yǎng)液中加入二甲基砷酸（DMA）脅迫，DMA

的質(zhì)量濃度為70 mg·L-1，處理10 d后取樣分析。

無(wú)機(jī)砷亞砷酸鈉（NaAsO2，As（III））水培實(shí)驗(yàn)：以全Hoagland營(yíng)養(yǎng)液作為培養(yǎng)溶液，在營(yíng)養(yǎng)液中加入亞砷酸鈉（As（III））脅迫，亞砷酸鈉（As（III））濃度分別為20、30、50 mg·L-1，脅迫3 d和10 d后取樣進(jìn)行生化指標(biāo)分析和形態(tài)分布檢測(cè)。

對(duì)照組水培實(shí)驗(yàn)：以全Hoagland營(yíng)養(yǎng)液作為培養(yǎng)溶液，金銀花植株在培養(yǎng)液中培養(yǎng)第3 d、10 d時(shí)取樣進(jìn)行

生化指標(biāo)分析和形態(tài)分布檢測(cè)。

1.2.2" 過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定

過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定［10-11］，在過(guò)氧化物酶的催化下，H2O2將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色的醌類化合物。通過(guò)測(cè)定470 nm處的吸光度值，判斷酶活性大小。

酶液制備：酶液在低溫條件下制備，所有試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備放在冰箱冷藏室，即在4 ℃預(yù)冷。在4 ℃預(yù)冷的研缽中，加入5 mL預(yù)冷的pH 7.8磷酸緩沖液（PBS）和0.5 g金銀花，冰浴研磨至勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃、12 000" r/h離心20 min，反應(yīng)用酶液為離心后的離心管內(nèi)的上清液。

反應(yīng)混合液的制備：取200 mL PBS（0.2 mol/L，pH 6.0），加入0.076 mL液態(tài)愈創(chuàng)木酚充分?jǐn)嚢柚粱旌暇鶆颍胖潦覝睾蠹尤?.112 mL、30%的H2O2，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品的測(cè)定：在3 mL反應(yīng)液中加入30 μL酶液，以PBS溶液調(diào)零，在470 nm處測(cè)定樣品的吸光度值（每隔30 s記錄一次吸光度

值A(chǔ)470，共記錄7次）。

酶活性的計(jì)算：以每分鐘吸光度值

升高0.01為1個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算公式為

POD酶活性=ΔA470×VtW×Vs×0.01×t。

ΔA470：記錄時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化；W：樣品鮮重/g；t：反應(yīng)時(shí)間/min；

Vt：提取出的酶液總體積/mL；Vs ：測(cè)定時(shí)取用酶液的體積/mL。

1.2.3" 過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定

過(guò)氧化氫酶（CAT）是一種氧化還原酶，在240 nm處有最大紫外吸收，通過(guò)測(cè)定吸光度的變化來(lái)判斷酶活性大?。?2］。

反應(yīng)液的配制：200 mL PBS（0.15 mol/L，pH 7.0），加入0.309 2 mL、30 %的H2O2混合均勻即可。

樣品測(cè)定：在3 mL反應(yīng)液中加入0.1 mL（可根據(jù)情況調(diào)整）酶液，以PBS作為空白對(duì)照調(diào)零，在240 nm處測(cè)定紫外吸光度值（測(cè)定時(shí)間為40 s）。

酶活性的計(jì)算：以每分鐘吸光度值減小0.01為1個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算公式為

CAT酶活性=ΔA240×VtW×Vs×0.01×t。

ΔA240：記錄時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化；W：樣品鮮重/g；t：反應(yīng)時(shí)間/min；Vt：提取

出的酶液總體積/mL；Vs：測(cè)定時(shí)取用酶液的體積/mL。

1.2.4" 超氧化物歧化酶活性的測(cè)定

通過(guò)氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶的活性［13］。這種方法會(huì)產(chǎn)生一種藍(lán)色物質(zhì)，該物質(zhì)在560 nm

處具有最大的吸收峰。

反應(yīng)混合液的配制：取130 mmol/L的甲硫氨酸（Met）溶液162 mL， 750 μmol/L的NBT溶液6 mL，0.05mol/L的磷酸緩沖液（PBS）5.4 mL，100 μmol/L的EDTA-Na2溶液0.6 mL，20 μmol/L的核黃素溶液6 mL，混合后搖勻。

酶活性測(cè)定：取30 μL酶液與3 mL反應(yīng)混合液于試管內(nèi)。將試管放置在光照培養(yǎng)箱中，在4 000 LUX光照強(qiáng)度下進(jìn)行20 min光化學(xué)反應(yīng)。同時(shí)，設(shè)立兩組對(duì)照組：第一組僅包含緩沖液，并置于暗處以備后續(xù)測(cè)定時(shí)用作調(diào)零；第二組含有3 mL反應(yīng)混合液及30μL PBS（不含酶液），并進(jìn)行光照處理，該組在后續(xù)測(cè)定中作為最大光還原對(duì)照。在調(diào)零階段，利用未受光照的緩沖液進(jìn)行基準(zhǔn)調(diào)整。在避光環(huán)境下，于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度值，并記錄顏色顯現(xiàn)時(shí)的讀數(shù)。

酶活性計(jì)算：SOD的活性單位以抑制氮藍(lán)四唑NBT光化還原50%所需的酶量為1個(gè)酶活性單位（U），計(jì)算公式為

SOD酶活性=（Ack-AE）V0.5Ack×W×Vt。

以每克樣品質(zhì)量的酶單位（U/g）表示SOD的總活性；

Ack：4 000LUX光

照強(qiáng)度照射對(duì)照管的吸光度；AE：樣品的吸光度；V：樣品液總體積/mL；

Vt：酶液用量/mL；W：樣品的質(zhì)量/g。

1.2.5" 同步輻射X射線熒光（μ-XRF）實(shí)驗(yàn)

樣品冷凍切片：在金銀花樣本處理過(guò)程中，將其細(xì)分為根、莖、葉3個(gè)部位。首先，將采集的金銀花樣本置于20 mL乙二胺四乙酸二鈉 （EDTA-Na2）溶液中浸泡15 min，旨在去除樣本表面附著的砷

，再用超純水對(duì)樣本進(jìn)行充分沖洗。在-20℃條件下，采用Leica CM3050S冷凍切片機(jī)，將樣本切割成30μm的薄片，并置于Kapton膠帶上以備使用［14］。每個(gè)濃度的樣本均進(jìn)行一次檢測(cè)。

采用同步輻射X射線熒光光譜分析法研究金銀花根、莖、葉中As元素的分布。在中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所同步輻射裝置4W1B光束線站對(duì)金銀花根、莖、葉片中As的分布特征進(jìn)行了研究。聚焦模式為超環(huán)面鏡一次聚焦+毛細(xì)管半透鏡二次聚焦，BSRF電子儲(chǔ)能能量級(jí)為2.5 GeV，束流強(qiáng)度為150～250 mA。利用W/B4C雙光柵多層單色儀（DMM）對(duì)入射X射線能量進(jìn)行單色化，并通過(guò)毛細(xì)血管透鏡將能量聚焦到直徑為50 μm的光束上，將光束與透射光束之間的角度設(shè)置為45°。樣品臺(tái)可以在水平和垂直方向移動(dòng)，步移分別為：X方向

50 μm，Y方向50 μm。用Si（Li）固態(tài)探測(cè)器探測(cè)X射線熒光發(fā)射線，每個(gè)點(diǎn)的停留時(shí)間為1～3 s。利用PyMCA 5.5.0-win64進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；使用Origin 2019b軟件生成組織切片的As元素二維分布圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 砷脅迫對(duì)金銀花中過(guò)氧化物酶活性的影響

通過(guò)分析金銀花在受到不同濃度無(wú)機(jī)砷（As2O3）和有機(jī)砷（DMA）脅迫時(shí)，其過(guò)氧化物酶（POD）活性的動(dòng)態(tài)響應(yīng)，探討這種活性變化與植物抗逆性之間的內(nèi)在聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金銀花在

As2O3脅迫下，POD活性隨脅迫濃度的增加而顯著上升（見(jiàn)圖1（a））。在10 d的脅迫處理中，當(dāng)As2O3濃度從0 mg·L-1增加至30 mg·L-1時(shí)，POD活性從

1 560 U增加至2 899 U。當(dāng)As2O3濃度達(dá)到50 mg

·L-1時(shí)，植物迅速凋亡。此外，在30 mg

·L-1的As2O3脅迫下（見(jiàn)圖1（b）），POD活性隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)（從3 d至10 d）顯著增加，從2 573 U增加至2 898 U。在有機(jī)砷DMA的脅迫下，金銀花POD活性的變化趨勢(shì)與無(wú)機(jī)砷相似（見(jiàn)圖2（a）），但達(dá)到相似酶活性所需的DMA濃度遠(yuǎn)高于As

2O3。DMA濃度為70 mg·L-1時(shí)，POD活性與20 mg·L-1無(wú)機(jī)砷脅迫下的酶活性相近，表明無(wú)機(jī)砷對(duì)金銀花的毒性顯著高于有機(jī)砷。進(jìn)一步分析脅迫時(shí)間與POD活性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在30 mg·L-1的As2O3（見(jiàn)圖1

（b））和50 mg·L-1的DMA脅迫下（見(jiàn)圖2（b）），隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)（從3 d至10 d），POD活性均顯著增加。這一結(jié)果表明，金銀花在砷脅迫下需要一定的適應(yīng)時(shí)間來(lái)提升其POD活性，從而增強(qiáng)自身的抗氧化能力和抗逆性。

2.2" 砷脅迫對(duì)金銀花中過(guò)氧化氫酶活性的影響

不同濃度的As2O3和DMA脅迫對(duì)金銀花中CAT活性的影響說(shuō)明，CAT酶活性在兩種砷脅迫下的變化趨勢(shì)存在顯著差異，體現(xiàn)了其在植物逆境適應(yīng)中的重要作用及研究?jī)r(jià)值。

在無(wú)機(jī)砷脅迫下，CAT酶活性呈現(xiàn)出V字形變化趨勢(shì)（見(jiàn)圖3

（a））。當(dāng)無(wú)機(jī)砷濃度為20 mg

·L-1時(shí)，CAT酶活性降至最低（461 U），說(shuō)明在此濃度下，無(wú)機(jī)砷對(duì)金銀花細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成等關(guān)鍵過(guò)程造成了干擾，導(dǎo)致抗氧化酶活性下降。隨著脅迫濃度的上升，金銀花葉片細(xì)胞干重增加，CAT酶活性再次呈上升趨勢(shì)。但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)（從3 d至10 d），在30 mg

·L-1As2O3的脅迫下，酶活性從796 U降至716 U（見(jiàn)圖3（b）），說(shuō)明在高濃度無(wú)機(jī)砷脅迫下，金銀花的抗逆能力減弱，無(wú)法有效保護(hù)細(xì)胞免受H2O2的氧化損害。

相比之下，在有機(jī)砷DMA的脅迫下，CAT酶活性隨脅迫濃度的增加（10～50 mg

·L-1）而上升（見(jiàn)圖4（a）），表明金銀花在此濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的逆境抗性。當(dāng)DMA濃度達(dá)到70 mg

·L-1時(shí)，CAT酶活性顯著降低（降至86 U），這可能由于高濃度DMA產(chǎn)生的H2O2對(duì)植物細(xì)胞造成了嚴(yán)重破壞，抑制了CAT酶的活性或其合成過(guò)程。此外，在50 mg

·L-1 DMA脅迫下（見(jiàn)圖4（b）），隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)（從3 d至10 d），CAT酶活性顯著增加（從371 U升至856 U），說(shuō)明金銀花在較長(zhǎng)時(shí)間的適應(yīng)過(guò)程中抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。

對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，As2O3在較低濃度（20 mg

·L-1）時(shí)即可導(dǎo)致CAT酶活性下降，而有機(jī)砷DMA在較

高

濃度（70 mg·L-1）時(shí)才導(dǎo)致酶活性下降。這一差異表明，As2O3對(duì)金銀花植物的毒性顯著大于DMA的毒性。

2.3" 砷脅迫

對(duì)金銀花中超氧化物歧化酶活性的影響

在無(wú)機(jī)砷脅迫實(shí)驗(yàn)中，SOD酶活性隨脅迫濃度的增加呈現(xiàn)出V字形變化趨勢(shì)（圖5（a））。當(dāng)無(wú)機(jī)砷濃度為10 mg

·L-1時(shí)，SOD酶活性達(dá)到

438U，表明金銀花在低濃度砷脅迫下能夠通過(guò)上調(diào)SOD酶活性來(lái)抵御氧化損傷。隨著砷濃度增加至20 mg

·L

-1時(shí)，酶活性顯著下降至318 U，這可能由于產(chǎn)生的超氧陰離子（O-2）的量超過(guò)了SOD酶的清除能力，導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)受損，進(jìn)而影響了其抗氧化功能。值得注意的是，當(dāng)砷濃度進(jìn)一步提升至30 mg·L-1時(shí)，SOD酶活性又有所回升（431 U）。我們推測(cè)這一現(xiàn)象可能是在高濃度砷脅迫下，金銀花通過(guò)某種機(jī)制重新合成了更多的SOD酶以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，對(duì)30 mg

·L-1 As2O3脅迫下不同時(shí)間點(diǎn)的酶活性分析顯示（見(jiàn)圖5（b）），從脅迫3 d到10 d，SOD酶活性由418 U增至431 U，這表明金銀花在持續(xù)脅迫下逐漸增強(qiáng)了其抗氧化能力，以適應(yīng)并減輕砷帶來(lái)的氧化損傷。

在有機(jī)砷DMA脅迫下，金銀花SOD酶活性的變化趨勢(shì)更為明確

（見(jiàn)圖6（a）），即隨著脅迫濃度的增加，酶活性持續(xù)下降。在10～70 mg·L

-1濃度范圍內(nèi)，SOD酶活性從465 U降低至339 U。這一結(jié)果表明，有機(jī)砷脅迫對(duì)金銀花抗氧化系統(tǒng)的破壞更為嚴(yán)重，導(dǎo)致產(chǎn)生的SOD酶量不足以清除脅迫產(chǎn)生的超氧陰離子（O-2），進(jìn)而加劇了細(xì)胞結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的損傷。

在50 mg·L-1 DMA脅迫下，不同時(shí)間點(diǎn)的酶活性分析顯示（見(jiàn)圖6（b）），酶活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，從409 U降至367 U，進(jìn)一步證實(shí)了有機(jī)砷脅迫對(duì)金銀花抗氧化防御體系的持續(xù)破壞。

將圖5與圖6對(duì)比分析可知，無(wú)機(jī)砷與有機(jī)砷脅迫下金銀花SOD酶活性的變化差異。其抗氧化系統(tǒng)表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性和調(diào)節(jié)能力，但這一能力在不同類型和濃度的砷脅迫下存在差異。這不僅揭示了金銀花在砷脅迫下的抗氧化防御機(jī)制，還為砷污染地區(qū)的植被恢復(fù)和生態(tài)修復(fù)提供了科學(xué)依據(jù)。

2.4" 同步輻射X射線熒光（μ-XRF）研究

為了研究不同形態(tài)的As在金銀花植物中的分布情況，采用同步輻射X射線熒光，對(duì)金銀花植物的根、莖、葉進(jìn)行X射線熒光掃描，用光譜法計(jì)算As元素的積分強(qiáng)度，并將積分強(qiáng)度歸一化為康普頓散射峰的強(qiáng)度。

2.4.1" 無(wú)機(jī)砷脅迫下金銀花植物中As2O3分布

對(duì)金銀花根、莖、葉進(jìn)行X射線熒光掃描，砷元素分布空白組情況

如圖7所示；在無(wú)機(jī)砷濃度為10 mg

·L-1至30 mg·L-1時(shí)，

脅迫10 d，對(duì)其根部進(jìn)行X射線熒光掃描，砷元素分布情況

如圖8所示。對(duì)金銀花根、莖、葉在無(wú)機(jī)砷濃度為30 mg

·L-1時(shí)脅迫10 d，進(jìn)行X射線熒光掃描，砷元素分布情況如圖9所示。

圖8顯示，脅迫濃度的遞增導(dǎo)致砷的分布愈發(fā)趨近于韌皮部。在受到高濃度無(wú)機(jī)砷脅迫時(shí)，金銀花為了遏制無(wú)機(jī)砷向地上部分傳導(dǎo)，將大部分無(wú)機(jī)砷積聚在外層表皮。

圖9（a）清晰地展示了無(wú)機(jī)砷在根部的主要分布區(qū)域位于外側(cè)且靠近表皮的位置。圖9（b）顯示砷在莖部主要聚集在靠近外表皮的韌皮部。

圖9（c）顯示砷在葉片中的主要分布區(qū)域?yàn)槿~脈，同時(shí)在其他部位也呈現(xiàn)出均勻分布的特點(diǎn)。由于無(wú)機(jī)

3脅迫后X射線熒光掃描砷元素分布圖

different concentrations of As2O3

·L-1

As2O3脅迫10 d后的X射線熒光掃描砷元素分布圖

·L-1 As2O3 stress for 10 days

圖10" 金銀花不同部位在50 mg

·L-1 DMA脅迫10 d后的X射線熒光掃描砷元素分布圖

Fig.10" X-ray fluorescence scanning arsenic distribution maps of different parts of Lonicera japonica Thunb under 50 mg

·L-1 organic arsenic stress for 10 days

砷對(duì)植物具有較高的毒性，為了最大程度地減輕砷對(duì)植物生長(zhǎng)的負(fù)面影響，植物傾向于在根莖部蓄積大量的無(wú)機(jī)砷，從而降低葉片中的砷含量。

2.4.2" 有機(jī)砷脅迫下金銀花植物中DMA在根、莖、葉中的分布

對(duì)金銀花根、莖、葉在50 mg

·L-1 濃度DMA脅迫10 d

，進(jìn)行X射線熒光掃描，砷元素分布情況如圖10所示。

在DMA濃度為50 mg·L-1的脅迫組中，通過(guò)圖10

（a）可以觀察到，毒性較低的DMA主要在根部中間部位的維管柱中蓄積，并以此作為通道向植株上部遷移；圖10（b）顯示，DMA在到達(dá)莖部后主要分布在外皮；而由圖10（c）可見(jiàn)，DMA在葉片中主要集中在葉脈處，葉片的葉肉部分含量相對(duì)較低。葉脈由維管束構(gòu)成，這些維管束是葉片的支撐結(jié)構(gòu)，并不含有葉綠素。因此，這種蓄積行為可能是金銀花為應(yīng)對(duì)DMA脅迫而采取的一種自我保護(hù)機(jī)制。

3" 結(jié)論

本文探究金銀花在無(wú)機(jī)砷（As2O3）和有機(jī)砷（DMA）脅迫下，POD、CAT及SOD活性的動(dòng)態(tài)響應(yīng)機(jī)制，并借助μ-XRF技術(shù)深入分析了砷元素在金銀花植株內(nèi)的分布特征。研究結(jié)果顯示，金銀花通過(guò)靈活調(diào)節(jié)POD、CAT和SOD的活性來(lái)應(yīng)對(duì)砷脅迫，且無(wú)機(jī)砷的毒性顯著高于有機(jī)砷，具體表現(xiàn)為：在較低濃度下即可引發(fā)酶活性的顯著變化，并在高

濃度下對(duì)金銀花抗氧化防御系統(tǒng)造成更嚴(yán)重的破壞。此外，金銀花對(duì)DMA具有更強(qiáng)的運(yùn)輸能力，且砷元素在金銀花葉片中主要集中在不進(jìn)行光合作用的葉脈處，這些現(xiàn)象可能是金銀花為應(yīng)對(duì)砷脅迫而發(fā)展出的自我保護(hù)機(jī)制。本研究

深入分析了金銀花的抗氧化機(jī)制，為砷污染環(huán)境的植被恢復(fù)、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及植物修復(fù)技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供了重要的科學(xué)依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)，具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。

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（責(zé)任編輯" 柴" 智；責(zé)任校對(duì)" 白麗媛）