菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子使用偏好性分析

摘要：為探究菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）葉綠體基因組密碼子使用偏好性及其影響因素，本研究使用Codon W 1.4.2軟件和在線軟件CUSP對篩選到的52個蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行密碼子使用模式分析。結(jié)果表明：菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子總GC含量（Total GC content of codon，GCall）為37.59%，密碼子第1位堿基GC含量（GC content of the first base of codon，GC1）＞密碼子第2位堿基GC含量（GC content of the second base of codon，GC2）＞密碼子第3位堿基GC含量（GC content of the third base of codon，GC3），且均小于50%，說明密碼子第3位堿基擁有較低的GC含量且密碼子偏好使用A或U。有效密碼子數(shù)（Effective number of codon，ENC）值為35.92～55.32，密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon adaptation index，CAI）值為0.10～0.31，密碼子偏好指數(shù)（Codon bias index，CBI）值為-0.24～0.20，最優(yōu)密碼子使用頻率（Frequency of optimal codons，F(xiàn)OP）值為0.24～0.54，說明密碼子使用偏好性較弱；通過中性繪圖分析、PR2-plot分析、ENC-plot分析和對應(yīng)性分析，發(fā)現(xiàn)菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子使用偏好性受選擇壓力和突變等因素的共同影響，主要因素為自然選擇。最優(yōu)密碼子分析共篩選出14個最優(yōu)密碼子，且均以A或U結(jié)尾。以上研究可為菘藍(lán)的系統(tǒng)進(jìn)化、環(huán)境適應(yīng)性和種質(zhì)改良提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菘藍(lán)；葉綠體基因組；選擇；密碼子使用偏好性；最優(yōu)密碼子

中圖分類號：S567.23+9""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2374-12

Codon Usage Bias Analysis of the Chloroplast Genome of Isatis Indigotica

YU Zhi-wei1，2， CHEN Yuan1*， GUO Feng-xia1， DONG Peng-bin1， WANG Hong-yan1

（1. College of Agronomy， College of Life Science and Technology， Gansu Agricultural University， State Key Laboratory of Aridland

Crop Science， Lanzhou， Gansu Province 730070， China; 2. Lanzhou Agro-technical Research and Popularization Center，

Lanzhou， Gansu Province 730030， China）

Abstract：To investigate the codon usage bias and its influencing factors in the chloroplast genome of Isatis indigotica Fort.，this study analyzed the codon usage patterns of 52 protein-coding sequences using Codon W 1.4.2 software and CUSP online software. The results revealed that the total GC content of codons in the chloroplast genome of I. indigotica was 37.59%，with GC1 gt; GC2 gt; GC3，all being less than 50%. This indicated a low GC content for the third base of codons，suggesting a preference for A or U base. Furthermore，the analysis of codon usage indices such as ENC，CAI，CBI and FOP showed ranges of 35.92 to 55.32，0.10 to 0.31，-0.24 to 0.20 and 0.24 to 0.54 respectively，pointing towards a relatively weak codon usage bias. Through various techniques such as neutral plot analysis，PR2-plot analysis，ENC-plot analysis，and correspondence analysis，we identified that selection pressure and mutation influenced the codon usage bias in I. indigotica chloroplast genome. However，natural selection emerged as the main factor affecting it. Additionally，optimal codon analysis identified a total of fourteen optimal codons with a preference for ending with A or U base. In conclusion，our findings can provide a theoretical foundation for valuable insights into phylogenetic evolution，environmental adaptability，and germplasm enhancement of I. indigotica.

Key words：Isatis indigotica;Chloroplast genome;Selection;Codon usage bias;Optimal codon

葉綠體是光合生物的細(xì)胞器，主要進(jìn)行光合作用和生物合成，為其生命活動提供有機(jī)物和能量［1］。葉綠體是半自主性的細(xì)胞器［2］，具有閉合雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及獨(dú)立于核基因組的葉綠體基因組；同時其具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、序列保守和間隔區(qū)變異位點(diǎn)豐富以及分子進(jìn)化速率較慢等特點(diǎn)，這些特征使葉綠體基因組廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及遺傳多樣性研究［3-5］。伴隨高通量測序技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫也得到了極大的豐富。其在解析植物類群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中得到廣泛應(yīng)用，目前，已有超過一千多種植物完成了葉綠體基因組的測序，包括肉蓯蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）［6］、桔梗（Platycodon grandiflorus （Jacq.）A.DC.）［7］、遠(yuǎn)志（Polygala tenuifolia Willd.）［8］、單葉鐵線蓮（Clematis henryi Oliv）［9］等，這些測序結(jié)果在植物系統(tǒng)發(fā)育地位、物種鑒定和進(jìn)化分析等方面發(fā)揮著重要作用［9］。密碼子是DNA和蛋白質(zhì)連接的重要橋梁，是生命遺傳信息傳遞的基本單位，在蛋白質(zhì)翻譯過程中承擔(dān)遺傳信息的傳遞作用［10］。編碼相同氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼子［11］。在蛋白質(zhì)翻譯過程中，基因傾向于使用特定的同義密碼子，這被稱為密碼子使用偏好性（Codon usage bias，CUB）［12］，密碼子的選擇具有物種和基因的特異性［13］，這種偏好性是生物為適應(yīng)環(huán)境而表現(xiàn)出的進(jìn)化行為［14］，突變和選擇壓力是這種偏好性存在的主要原因［15］。研究表明，密碼子使用偏好性存在于自然界各種生物中，且受到諸多因素的影響［16-17］。密碼子使用偏好性研究在基因結(jié)構(gòu)和功能分析以及動植物、微生物和病毒的蛋白質(zhì)表達(dá)等方面得到了廣泛應(yīng)用［17］。深入研究植物葉綠體基因組密碼子的使用模式及其影響因素，能夠?yàn)榛蚬こ痰妮d體選擇和基因的表達(dá)提供理論依據(jù)，并且有助于判斷未知基因的表達(dá)情況或預(yù)測某些未知功能基因，對于物種進(jìn)化和遺傳研究具有重要意義［18-19］。

菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）屬十字花科菘藍(lán)屬，二年生草本植物，在我國廣泛分布且栽培歷史悠久［20］。菘藍(lán)地下部分為板藍(lán)根（Isatidis Radix），具有清熱解毒、利咽涼血等功效［21］，常用于治療感冒、流感等病毒性疾病［22］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根還具有抗炎、解熱、提高免疫力以及預(yù)防和治療SARS-CoV-2等作用［23-25］。其葉為大青葉（Isatidis Folium），具有清熱解毒，涼血消斑的功效［21］。菘藍(lán)作為我國傳統(tǒng)中藥歷史悠久，栽培歷史距今約2000余年，早在《爾雅·釋草》中就有記載，《新修本草》中記載“本經(jīng)所用乃是蓼藍(lán)實(shí)也”［26］。作為傳統(tǒng)的大宗藥材，菘藍(lán)在當(dāng)前全球疫情形勢下使用極為普遍，對防治流行性傳染疾病有十分重要的意義。目前有關(guān)菘藍(lán)的研究主要集中在其藥用部位的有效成分、治病機(jī)理等方面。然而在菘藍(lán)優(yōu)良種質(zhì)培育方面的研究則相對較少，因此如何提高其產(chǎn)量并穩(wěn)定其質(zhì)量十分重要。研究植物葉綠體基因組的密碼子使用模式，可為提高基因表達(dá)載體構(gòu)建效率、探討物種進(jìn)化關(guān)系、理解生物與環(huán)境適應(yīng)的分子機(jī)制以及作物種質(zhì)改良等方面提供數(shù)據(jù)支持。藥用植物菘藍(lán)的葉綠體基因組雖已報(bào)道［27］，但關(guān)于菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子使用偏好性的研究卻非常有限。本研究對菘藍(lán)葉綠體基因組的密碼子使用偏好性進(jìn)行了分析，并探究其密碼子使用偏好性的影響因素，篩選出最優(yōu)密碼子，以期為后續(xù)進(jìn)行菘藍(lán)葉綠體基因組相關(guān)研究提供參考，為菘藍(lán)基因功能和蛋白表達(dá)的深入研究以及菘藍(lán)種質(zhì)改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菘藍(lán)新鮮葉片采自甘肅省張掖市民樂縣六壩鎮(zhèn)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳垣教授鑒定為十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)，憑證標(biāo)本存放于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本館，憑證標(biāo)本號為GAUML-20210625。樣品經(jīng)硅膠干燥處理后，取已干燥的葉片，采用CTAB法提取菘藍(lán)的葉綠體DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的純度和完整性，Qubit DNA試劑盒測定DNA濃度。隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進(jìn)行檢測，待插入片段大小符合預(yù)期，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。質(zhì)檢后利用Illumina高通量測序平臺Nova Seq 6000對基因組進(jìn)行測序，PE讀長為150 bp，最終得到2.29 Gbp的原始數(shù)據(jù)，上述過程由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。測序得到的Clean data以菘藍(lán)（NC_028415.1）為參考序列，在Linux系統(tǒng)下運(yùn)用Get Organelle v 1.7.5.2軟件對菘藍(lán)葉綠體基因組進(jìn)行組裝，輸出序列以FASTA格式存儲。組裝結(jié)果利用CPGAVAS2在線軟件對序列進(jìn)行注釋，注釋好的序列在Geneious軟件中對存在問題的密碼子位點(diǎn)進(jìn)行手動校正。測序結(jié)果經(jīng)組裝、注釋，上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，Genbank登錄號為：0R936036.1（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/0R936036.1）。從菘藍(lán)葉綠體基因組中共獲取到87條蛋白編碼區(qū)（Coding DNA sequence，CDS）序列，去除重復(fù)、長度小于300 bp、內(nèi)部存在終止密碼子或終止密碼子異常的序列、保留ATG作為起始密碼子的序列，得到用于分析的52條CDS序列。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 密碼子相關(guān)參數(shù)計(jì)算 使用在線軟件（CUSP（http：//emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）計(jì)算GC1，GC2，GC3，GCall以及密碼子第3位堿基的A，T（U下同），C，G含量（A3，T3，C3，G3）。使用Codon W 1.4.2軟件對每個基因的有效密碼子數(shù)（ENC）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）、密碼子偏好指數(shù)（CBI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（FOP）以及相對同義密碼子使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）進(jìn)行計(jì)算。SPSS 20.0和Excel軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

有效密碼子數(shù)（ENC）是評價同義密碼子使用偏好性的指標(biāo)［17］，其取值為20～61，偏好性強(qiáng)弱與ENC值大小成反比，一般以ENC值35為評價密碼子使用偏好性的強(qiáng)弱標(biāo)準(zhǔn)［17］。同義密碼子相對使用度（RSCU）是密碼子實(shí)際使用頻率與無偏好性理論頻率的比值［17］，密碼子使用偏好性強(qiáng)弱與RSCU值的大小成正比，RSCU值為1則代表無偏好性［28］。密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）是指對于某一個基因，編碼該蛋白的所有密碼子相對于這條基因都使用最優(yōu)密碼子的情況下的適應(yīng)系數(shù)，可預(yù)估未知基因密碼子使用偏好性程度，取值為0～1，數(shù)值越大則偏好性越強(qiáng)［29］；密碼子偏好指數(shù)（CBI）表示特定基因?qū)ψ顑?yōu)密碼子子集的使用程度，取值為0～1，當(dāng)最優(yōu)密碼子使用頻次小于平均使用頻次，CBI為負(fù)值［12］。最優(yōu)密碼子使用頻率（FOP）表示基因中最優(yōu)密碼子占同義密碼子數(shù)量的比值，取值為0～1，1表示只有最優(yōu)密碼子被使用，0則表示沒有最優(yōu)密碼子被使用到［12］。

1.2.2 中性繪圖分析 中性繪圖常用于分析密碼子使用模式和偏好性的影響因素，以GC3值為橫坐標(biāo)、密碼子第1，2位堿基GC含量的均值（Mean of GC content of the first and second bases of codon，GC12）為縱坐標(biāo)繪圖，2者的相關(guān)程度表示密碼子3個位置堿基的變異程度，通過對2者相關(guān)性進(jìn)行分析可判斷密碼子偏好性的影響因素；若GC12與GC3相關(guān)性不顯著，則密碼子3個位置的堿基構(gòu)成有明顯的不同，即偏好性主要來自于選擇壓力［30］；反之，若GC12和GC3顯著相關(guān)，回歸系數(shù)（對角線斜率）較大且接近1，說明影響密碼子使用偏好性的主要因素為突變［17］。

1.2.3 PR2-plot分析 PR2-plot分析用于揭示核苷酸組成的影響因素，分別以G3/（G3+C3），A3/（A3+T3）為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)進(jìn)行繪圖，中心點(diǎn)表示A=T且C=G，即密碼子使用無偏好性，其他各點(diǎn)與中心點(diǎn)的矢量距離則代表其偏好性強(qiáng)弱和方向［31］。如果基因在兩條中心線上或接近的位置，這表示該基因四種堿基的使用頻率大致相同，表明密碼子使用偏好性只受到突變的影響；反之，四種堿基的使用頻率有顯著差異，密碼子使用偏好性則同時受到選擇壓力和突變的影響［32］。

1.2.4 ENC-plot分析 分別以ENC，GC3為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)進(jìn)行繪圖，以公式ENC=2+GC3+29/［GC32+（1-GC3）2］［33］為標(biāo)準(zhǔn)曲線，每點(diǎn)代表一個基因。基因與標(biāo)準(zhǔn)曲線的距離為評價指標(biāo)，若基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，且距離較遠(yuǎn)，此時的ENC值較低，表明密碼子使用偏好性較強(qiáng)且受選擇壓力影響［34］。反之，若基因與標(biāo)準(zhǔn)曲線的距離越近，則密碼子偏好性主要由堿基組成決定，受突變的影響較大。當(dāng)選擇出現(xiàn)在密碼子第 3位堿基上時，為了分析選擇壓力和中性突變對密碼子偏好性的影響，我們需結(jié)合ENC比值頻數(shù)分布，以-0.05～0.05的范圍為界對差異進(jìn)行量化分析［34］。（ENC比值=（ENCact-ENCexp）/ENCact）。

1.2.5 對應(yīng)性分析 基于RSCU值使用Codon W 1.4.2軟件進(jìn)行對應(yīng)性分析［35］，將各基因分布在多維向量空間中，根據(jù)基因在多維空間中的同義密碼子使用情況、基因間值的變異及向量的情況，分析其主要變異來源和密碼子使用偏好性的影響因素，同時將所有基因按照基因功能不同分為5類。以第1軸（Asix1）為橫坐標(biāo)、第2軸（Asix2）為縱坐標(biāo)作圖，散點(diǎn)代表基因，散點(diǎn)的分布可以用于分析密碼子的使用模式，密碼子使用變化的趨勢以圖中各基因的分散程度進(jìn)行分析判斷［36］。第1軸（Asix1）表示對密碼子使用變化差異的最大影響，其余各軸的影響則依次降低［36］。

1.2.6 最優(yōu)密碼子的確定 將篩選后得到基因的ENC值從高到低的排列，選取排列在前后各10%的基因構(gòu)建高、低表達(dá)數(shù)據(jù)庫。綜合高頻密碼子與高表達(dá)密碼子的特點(diǎn)，若RSCU值＞1則為高頻密碼子，高低表達(dá)數(shù)據(jù)庫的差值（RSCU different between high and low expression groups，ΔRSCU）≥0.08則為高表達(dá)密碼子；利用Codon W 1.4.2 計(jì)算RSCU值和ΔRSCU，同時滿足高頻密碼子和高表達(dá)密碼子的則為最優(yōu)密碼子［37］。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組密碼子使用偏好性分析

2.1.1 堿基組成及表達(dá)特征分析 如表1所示，菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子GC1，GC2，GC3，GCall的均值分別為46.36%，39.01%，27.41%和37.59%，各基因密碼子不同位置堿基的GC含量存在較大差異，GC1，GC2值普遍大于GC3值；密碼子各位置堿基的GC含量均小于50%，這說明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子使用偏好以A或U結(jié)尾，此特性在第3位堿基上更為明顯，A或U的占比更高。菘藍(lán)葉綠體基因組ENC取值為35.92～55.32，均值為45.53，52個基因的ENC值均大于35，這表明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子偏好性相較弱；CAI取值為0.10～0.31，均值為0.17，則未知基因密碼子使用偏好性較弱；CBI取值為-0.24～0.20，均值為-0.10，則最優(yōu)密碼子使用次數(shù)小于密碼子平均使用次數(shù)；FOP取值為0.24～0.54，均值為0.35，則最優(yōu)密碼子占同義密碼子數(shù)量的比值較小。以上結(jié)果均表明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子使用偏好性較弱。

如表2所示，菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子GC1值與GC2值極顯著相關(guān)，GCall值與CC1，CG2，CG3值極顯著相關(guān)，而GC3值與GC2值無顯著相關(guān)，說明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子第1，2位堿基構(gòu)成無顯著差異，而第3位堿基構(gòu)成差異顯著。ENC值僅與GC3值極顯著相關(guān)，ENC值與GC1，GC2值無相關(guān)性，說明密碼子第3位堿基構(gòu)成對密碼子使用偏好性有顯著影響；此外，GCall值與CBI和FOP值極顯著相關(guān)，GC1值與CAI，CBI和FOP值極顯著相關(guān)。說明密碼子堿基構(gòu)成對使用偏好性影響較大，特別對第3位堿基的構(gòu)成影響較大。

2.1.2 相對同義密碼子使用度（RSCU）分析 RSCU分析結(jié)果顯示（圖1）：RSCU值＞1的密碼子有30個，表明這30個密碼子的使用偏好性較強(qiáng)，為高頻密碼子，占密碼子總數(shù)的46.88%。除UUG外，其余密碼子均以A（13個）或U（16個）結(jié)尾，占比97%，具有明顯的A或U偏向性。

2.2 中性繪圖分析

如圖2所示，菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子GC12取值為31.70%～55.40%，GC3取值為18.72%～36.12%，所有基因均分布于對角線上方。atpB基因離對角線最近，其GC12與GC3比值為1.02，表明該基因密碼子偏好性主要受突變影響。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，GC12與GC3無顯著相關(guān)，回歸系數(shù)為0.326，表明密碼子前2位堿基構(gòu)成與第3位堿基構(gòu)成存在差異，基因組的GC含量較為保守，第3位堿基的GC含量較低。以上結(jié)果表明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子使用偏好性更多地受選擇壓力的影響，而非突變［31］。

2.3 PR2-plot分析

PR2-plot分析結(jié)果顯示（圖3），菘藍(lán)葉綠體基因在圖中4個區(qū)域呈分散分布，僅psbA和ndhB基因距中心點(diǎn)最近，說明這2個基因的密碼子偏好性較低，其使用偏好性主要受突變影響。菘藍(lán)葉綠體基因組有26個基因分布在右下角區(qū)域，涉及：乙酰輔酶A羧化酶、光合系統(tǒng)I亞基、細(xì)胞色素c基因、成熟酶、保守假設(shè)性葉綠體開放閱讀框、核糖體小亞基蛋白、ATP合成酶亞基、細(xì)胞色素b/f復(fù)合體亞基、NADH脫氫酶亞基、光合系統(tǒng)II亞基、RNA聚合酶亞基這些基因的部分或全部基因，說明密碼子第3位堿基的使用頻率T（U下同）＞A、G＞C，使用頻率上4種堿基差異顯著，因此，密碼子第3位堿基的使用存在偏好性，主要受自然選擇影響。反之，若基因均勻分布在兩條中心線附近，則4種堿基的使用頻率基本一致，密碼子使用僅受突變影響。因此，充分說明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子使用偏好性并非僅受選擇壓力或突變的單一影響，而受2種因素共同影響，且受選擇壓力影響更大。

2.4 ENC-plot分析

如圖4所示，菘藍(lán)葉綠體基因組中大多數(shù)基因集中分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，僅3個基因（rpl20，ndhE，ycf3）其位置在標(biāo)準(zhǔn)曲線上方，表明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子使用偏好性受選擇壓力的影響較大。分析ENC比值分布（表3）發(fā)現(xiàn)，有14個基因位于（-0.05，0.05）區(qū)間，靠近標(biāo)準(zhǔn)曲線，表明這些基因的密碼子使用偏好性受突變影響更大。有38個基因位于（0.05，0.35）區(qū)間，與標(biāo)準(zhǔn)曲線的距離較遠(yuǎn)，說明這些基因的密碼子使用偏好性受選擇壓力影響更大。以上結(jié)果表明，相較于突變影響，菘藍(lán)密碼子使用偏好性受選擇壓力影響更大。

2.5 對應(yīng)性分析

如圖5所示，第1和第2軸的解釋變化分別為11.05%和8.51%，其余各軸的解釋變化均低于第1，2軸。第1軸對密碼子使用偏好性的貢獻(xiàn)率最大，表明菘藍(lán)葉綠體基因組中密碼子使用偏性存在部分變異。按照基因功能將所有基因分為5類，分別為遺傳系統(tǒng)基因（4個）、核糖體蛋白基因（13個）、光合系統(tǒng)基因（26個）、其他蛋白基因（5個）和保守開放閱讀框（4個）。其中，遺傳系統(tǒng)基因集中分布在右下角，而其他各類功能基因的分布更為分散，說明這些基因密碼子的使用模式差異顯著，密碼子使用偏好性受多種因素的影響。由表4可知，第一軸與CAI，CBI呈顯著或極顯著正相關(guān)，而與GC3和ENC則呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。說明CAI，CBI，ENC和GC3對菘藍(lán)葉綠體密碼子偏好性的影響較大。以上分析說明菘藍(lán)葉綠體的密碼子使用偏好性受多種因素影響。

2.6 最優(yōu)密碼子

由表5可知，有19個密碼子的ΔRSCU≥0.08，即高表達(dá)密碼子。有30個密碼子的RSCU＞1，即高頻密碼子。滿足上述兩個標(biāo)準(zhǔn)的密碼子為最優(yōu)密碼子，共14個，分別為：GCA，GCU，CGA，UGU，CAA，GGU，AUU，UUA，AAA，CCA，CCU，UCA，UAU，GUA，其中8個密碼子以A結(jié)尾，6個密碼子以U結(jié)尾。說明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子偏好以A或U結(jié)尾，這與密碼子堿基構(gòu)成以及相對同義密碼子使用度分析的結(jié)果一致。

3 討論

3.1 菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子的特征

密碼子使用偏好性是光合生物為應(yīng)對基因組環(huán)境變化以及自然進(jìn)化壓力而進(jìn)行的適應(yīng)性選擇［36］，受多種因素影響［16-17］。其中，堿基構(gòu)成對密碼子的影響最為普遍［36］，尤其密碼子第3位堿基構(gòu)成（GC3）。因此，GC3值被作為分析密碼子使用偏好性的重要依據(jù)［38］。本研究發(fā)現(xiàn)，菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子GC含量GC1＞GC2＞GC3，且均小于50%，表明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子第3位堿基擁有較低的GC含量，且密碼子偏好使用A或U，這與葫蘆巴（Trigonella foenum-graecum L.）［39］、珊瑚菜（Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.）［40］、甜高粱（Sorghum bicolor ‘Dochna’）［41］等植物葉綠體基因組的特征相符，也符合“高等植物密碼子偏好以A或T結(jié)尾”的這一假設(shè)［42］。參照J(rèn)iang等人［43］的研究，密碼子使用偏好性強(qiáng)弱區(qū)分以ENC值35為界，菘藍(lán)葉綠體基因組ENC的均值為45.53，有52個基因的ENC值大于35，這表明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子的偏好性較弱。密碼子使用偏好性能夠影響基因的表達(dá)水平［41］，一般來說，密碼子使用偏好性越強(qiáng)，基因表達(dá)水平越高，反之，密碼子使用偏好性越弱，則基因表達(dá)水平越低［44］。本研究中，CAI，CBI和FOP的均值分別為0.17，-0.10，0.35，均表明菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子使用偏好性較弱，因此，菘藍(lán)葉綠體基因的表達(dá)水平相對較低。相關(guān)性分析表明，密碼子堿基構(gòu)成對密碼子使用偏好性影響顯著，尤其是第3位堿基的構(gòu)成，因此，菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子堿基構(gòu)成對菘藍(lán)葉綠體基因的表達(dá)也有很大影響。密碼子使用偏好性能夠調(diào)控基因的表達(dá)水平，同時最優(yōu)密碼子的使用能夠提升翻譯的效率和精確度［45］。因此，本研究涉及的含有最優(yōu)密碼子的基因可能呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平。

3.2 菘藍(lán)葉綠體基因密碼子偏好性的主要影響因素

根據(jù)中性繪圖分析，密碼子使用偏好性主要受選擇壓力的影響，同時也受突變影響。PR2-plot分析表明，菘藍(lán)葉綠體密碼子第3位堿基的使用頻率T和G分別高于A和C，這表明選擇壓力在更大程度上影響了菘藍(lán)葉綠體密碼子使用偏好性。這與高守輿等［46］對白羊草（Bothriochloa ischaemum L. Keng）葉綠體基因組的研究結(jié)果相吻合。而Zhang等［47］研究小麥發(fā)現(xiàn)，小麥密碼子第3位堿基使用頻率上G顯著高于C，而T和A的無顯著差異。這表明葉綠體基因組的堿基構(gòu)成和密碼子偏好具有物種特異性。根據(jù)ENC-plot的分析結(jié)果，菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子使用偏好性受突變的影響較小。對應(yīng)性分析進(jìn)一步說明，菘藍(lán)密碼子使用偏好性受到多種因素影響，其中CAI，CBI，ENC和GC3影響較大。綜上所述，影響菘藍(lán)密碼子使用偏好性的主要因素是選擇壓力。

3.3 菘藍(lán)葉綠體基因密碼子偏好性的模式

本研究綜合高頻密碼子和高表達(dá)密碼子共得到14個最優(yōu)密碼子［36］，且均以A或U結(jié)尾。通過前人對人參（Panax ginseng C.A.Mey.）［48］、苦蕎（Fagopyrum tataricum L. Gaertn.）［37］、葫蘆巴（T. foenum-graecum）［39］等植物葉綠體基因的密碼子偏好性研究發(fā)現(xiàn)，這些植物同樣表現(xiàn)出偏好A或U結(jié)尾的特征，說明菘藍(lán)與其他雙子葉植物一樣偏好使用以A或U結(jié)尾的密碼子［35］，同時也說明密碼子偏好性存在物種的相似性［39］。

4 結(jié)論

本研究首次對甘肅板藍(lán)根道地產(chǎn)區(qū)的菘藍(lán)葉綠體基因組密碼子偏好性進(jìn)行了分析，確定了14個最優(yōu)密碼子，密碼子偏好使用A或U，且密碼子使用偏好性和基因表達(dá)水平較弱；密碼子堿基構(gòu)成存在位置差異，密碼子堿基第3位GC含量最低；密碼子使用偏好性受突變和選擇壓力的共同作用，且主要的受選擇壓力的影響。以上研究可為菘藍(lán)物種進(jìn)化、基因工程研究、遺傳研究、外源表達(dá)載體構(gòu)建和種質(zhì)改良等提供科學(xué)依據(jù)和理論支撐。

參考文獻(xiàn)

［1］ WANG X M，ZHOU T，BAI G Q，et al. Complete chloroplast genome sequence of Fagopyrum dibotrys：Genome features，comparative analysis and phylogenetic relationships［J］. Scientific Reports，2018，8（1）：12379

［2］ 姜汶君，郭夢月，龐曉慧. 葉綠體基因組在藥用植物鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化研究中的應(yīng)用［J］. 世界中醫(yī)藥，2020，15（5）：702-708

［3］ LI C J，LU J M，LI Y，et al. Comparative morphology of the leaf epidermis in Lobelia （Lobelioideae） from China［J］. Microscopy Research and Technique，2017，80（7）：763-778

［4］ 丁怡寧，畢光耀，胡賽文，等. 紅花不同花色變異類型葉綠體基因組特征與系統(tǒng)進(jìn)化分析［J］. 中草藥，2023，54（1）：262-271

［5］ YU B，SUN Y B，LIU X F，et al. Complete chloroplast genome sequence and phylogenetic analysis of Camellia fraterna［J］. Mitochondrial DNA.Part B，Resources，2020，5（4）：3840-3842

［6］ 宋菊，龍?jiān)录t，林麗梅，等. 五加科植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析［J］. 中草藥，2017，48（24）：5070-5075

［7］ 張瑜，杜晨暉，詹海仙，等. 桔梗葉綠體比較基因組學(xué)分析及系統(tǒng)發(fā)育研究［J］. 中草藥，2023，54（15）：4981-4991

［8］ 王星璐，李慧娟，趙偉，等. 遠(yuǎn)志葉綠體基因組序列特征與系統(tǒng)發(fā)育分析［J］. 中草藥，2023，54（11）：3655-3665

［9］ 韋海忠，潘麗芹，田盛野，等. 單葉鐵線蓮葉綠體基因組的序列特征與系統(tǒng)發(fā)育分析［J］. 中草藥，2022，53（12）：3766-3773

［10］滕騰，趙懿琛，趙德剛. 鳥王茶基因密碼子偏好性分析［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2021，40（2）：795-801

［11］李秀璋，宋輝，張宗豪，等. 甘肅內(nèi)生真菌基因組密碼子使用的偏好性分析［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2020，29（5）：67-77

［12］TANG D，WEI F，CAI Z，et al. Analysis of codon usage bias and evolution in the chloroplast genome of Mesona chinensis Benth［J］. Development Genes and Evolution，2021，231（1）：1-9

［13］ZHANG R，ZHANG L，WANG W，et al. Differences in codon usage bias between photosynthesis-related genes and genetic system-related genes of chloroplast genomes in cultivated and wild solanum species［J］. International Journal of Molecular Sciences，2018，19（10）：3142

［14］BOTZMAN M，MARGALIT H. Variation in global codon usage bias among prokaryotic organisms is associated with their lifestyles［J］. Genome Biology，2011，12（10）：R109

［15］DURET L. Evolution of synonymous codon usage in metazoans［J］. Current Opinion in Genetics and Development，2002，12（6）：640-649

［16］婁麗，袁叢軍，陳銳，等. 安龍油果樟葉綠體基因組密碼子偏好性分析［J/OL］. 分子植物育種：1-17［2024-02-05］

［17］原曉龍，李云琴，張勁峰，等. 降香黃檀葉綠體基因組密碼子偏好性分析［J］. 廣西植物，2021，41（4）：622-630

［18］梁皓輝，符虹宇，黎釗坪，等. 小球藻葉綠體基因組密碼子偏好性分析［J］. 分子植物育種，2020，18（17）：5665-5673

［19］沈宗芳，陸添權(quán)，張志榮，等. 槲蕨屬葉綠體基因組密碼子偏好性分析［J］. 廣西植物，2021，41（2）：266-273

［20］邵玉嬌，康雷，李再云. 藥用植物菘藍(lán)的遺傳及遠(yuǎn)緣雜交研究進(jìn)展［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2023，24（6）：1527-1533

［21］國家藥典委員會. 中國藥典（一部）［M］. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：21-22，205-206

［22］CAO Y，XU X，ZHANG P Y. Advances in the traditional Chinese medicine-based management of viral myocarditis［J］. Cell Biochemistry and Biophysics，2015，73（1）：237-243

［23］DAVID S N，GUILLERMO M R，ARDYTHE L M. Human milk glycans protect infants against enteric pathogens［J］. Annual Review of Nutrition，2005，25：37-64

［24］DENG W，XU Y，KONG Q，et al. Therapeutic efficacy of Pudilan Xiaoyan Oral Liquid （PDL） for COVID-19 in vitro and in vivo［J］. Signal Transduct Target Ther，2020，5（1）：66

［25］楊春望. 板藍(lán)根藥理研究進(jìn)展［J］. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2016，10（9）：282-283

［26］付照羽，馮治朋，韓顏超，等. 板藍(lán)根研究進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2023（14）：41-45

［27］YANG S，WANG Z. The complete chloroplast genome sequence of the medicinal and economic plant woad Isatis indigotica （Brassicaceae）［J］. Mitochondrial DNA.Part B，Resources，2017，2（2）：514-515

［28］LIU H B，LU Y Z，LAN B L，et al. Codon usage by chloroplast gene is bias in Hemiptelea davidii［J］. Journal of Genetics，2020，99：8

［29］LIU S S，QIAO Z Q，WANG X M，et al. Analysis of codon usage patterns in“Lonicerae Flos”（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz） based on transcriptome data［J］. Gene，2019，705：127-132

［30］MCLEAN M J，WOLFE K H，DEVINE K M. Base compositions kews，replication orientation，and gene orientation in 12 prokaryote genomes［J］. Journal of Molecular Evolution，1998，47：691-696

［31］SUEOKA N. Two aspects of DNA base composition：G+C content and translation-coupled Deviation from intra-strandruie of A=T and G=C［J］. Journal of Molecular Evolution，1999，49（1）：49

［32］楊國鋒，蘇昆龍，趙怡然，等. 蒺藜苜蓿葉綠體密碼子偏好性分析［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（12）：171-179

［33］NOVEMBRE J A. Accounting for background nucleotide composition when measuring codon usage bias［J］. Molecular Biology and Evolution，2002，19（8）：1390-1394

［34］NIE X J，DENG P C，F(xiàn)ENG K W，et al. Comparative analysis of codon usage patterns in chloroplast genomes of the Asteraceae family［J］. Plant Molecular Biology Reporter，2014，32（4）：828-840

［35］MCINERNEY J O. Replicational and transcriptional selecation on codon usage in Borrelia burgdorferi［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（18）：10698-10703

［36］牛元，徐瓊，王崳德，等. 大花香水月季葉綠體基因組密碼子使用偏性分析［J］. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，33（3）：123-130

［37］胡莎莎，羅洪，吳琦，等. 苦蕎葉綠體基因組密碼子偏愛性分析［J］. 分子植物育種，2016，14（2）：309-317

［38］WAN X F，XU D，KLEINHOFS A，et al. Quantitative relationship between synonymous codon usage bias and GC composition across unicellular genomes［J］. BMC Evolutionary Biology，2004，4：19

［39］杜明川，王偉，鮑海娟，等. 葫蘆巴葉綠體基因組密碼子偏好性分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2024，32（2）：409-418

［40］孫月琪，李密密，周義峰. 珊瑚菜葉綠體基因組密碼子使用偏性分析［J］. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2023，32（6）：1-10

［41］洪森榮，林順來，李盈萍，等. 甜高粱葉綠體基因組特征及密碼子偏好性分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（12）：3636-3650

［42］CAMPBLL W H，GOWRI G. Codon usage in higher plants，green algae，and cyanobacteria［J］. Plant Physiology，1990，92（1）：1-11

［43］JIANG Y，DENG F，WANG H L，et al. An extensive analysis on the global codon usage pattern of baculoviruses［J］. Archives Virology，2008，153：2273-2282

［44］ZHOU Z P，DANG Y K，ZHOU M，et al. Codon usage is an important determinant of gene expression levels largely through its effects on transcription［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2016，113（41）：6117-6125

［45］SHARP P M，MATASSI G. Codon usage and genome evolution［J］. Current Opinion in Genetics and Development，1994，4：851-860

［46］高守輿，李鈺瑩，楊志青，等. 白羊草葉綠體基因組密碼子使用偏好性分析［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2023，32（7）：85-95

［47］ZHANG W J，ZHOU J，LI Z F，et al. Comparative analysis of codon usage patterns among mitochondrion，chloroplast and nuclear genes in Triticum aestivum L［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2007，49（2）：246-254

［48］石巖碩，趙永星. 人參屬植物葉綠體基因組密碼子偏好性分析［J］. 分子植物育種，2022，20（19）：6350-6361

（責(zé)任編輯 劉婷婷）