一起肅南牦牛犢牛沙門氏菌及病毒性腹瀉病毒混合感染的實驗室診斷和防治建議

摘要：對一起肅南牦牛犢牛傳染性腹瀉疾病進行實地查看和解剖，根據臨床癥狀和剖檢變化，筆者初步診斷為疑似病毒性腹瀉病毒和沙門氏菌感染，為進一步進行確診和為養殖戶提供科學的防治建議，采集未經藥物治療死亡的2頭病死犢牛肝臟和10頭病牛全血到實驗室診斷。實驗通過病毒性腹瀉抗原檢測、沙門氏菌直接PCR檢測、培養菌落觀察、菌體顯微鏡觀察、分離菌株PCR檢測、藥敏敏感性以及動物攻毒試驗，確診為沙門氏菌和病毒性腹瀉病毒混合感染，并提出了防治建議。

關鍵詞：肅南牦牛犢牛；沙門氏菌；病毒性腹瀉病毒；實驗室診斷；防治

“肅南牦牛”是在祁連山北麓這種獨特的地理氣候環境條件下，經過長期的自然選擇和人工選育而成的一個牦牛遺傳資源，也是肅南裕固族自治縣牧民飼養的主要家畜，在全縣畜牧業生產中占有重要的地位。但腹瀉是導致肅南牦牛犢牛高死亡率的主要因素，給畜牧業發展造成重大損失和嚴重影響農牧民收入，其中，沙門氏菌病和病毒性腹瀉病是導致牦牛犢牛發生腹瀉的主要傳染病。筆者將一例肅南牦牛犢牛沙門氏菌和病毒性腹瀉混合感染的實驗室診斷報告如下，并提出了防治建議。

1 發病情況

肅南縣康樂鎮賽鼎村牦牛養殖戶申某于2022年10月中旬從本縣境內分批購買了86頭肅南牦牛7～8月齡犢牛，11月15日開始，3頭牦牛犢牛陸續出現臨床癥狀，主要表現為腹瀉的疾病，至11月30日，發病22頭，死亡6頭。

2 臨床癥狀

發病初期體溫可升高到 40～42 ℃，并可持續 1～2 d，采食情況不良，精神狀態萎靡，12～36 h 后排出流水狀灰綠色稀便，夾雜著纖維狀的物質和黏膜組織，部分糞便中夾雜帶有黏液和血液，散發出惡臭難聞的氣味。病牛有腹部疼痛感，會用后肢踢腹部。大部分患病牛口腔唇內、齒齦、硬腭和鼻黏膜處有米粒至蠶豆大糜爛或潰瘍，嚴重者整個口腔覆有呈煮熟樣的灰色壞死上皮，大量流出泡沫樣口涎。部分患病牛出現眼結膜炎癥狀，并伴隨著咳嗽、呼吸急促，隨著病程延長癥狀也逐漸加重，病牛體質虛弱、消瘦，直至脫水嚴重死亡。

3 剖檢變化

剖檢發現，食道存在小的潰爛斑點和出血點，腹膜有點狀出血，皺胃和小腸黏膜出現彌散性出血和炎性水腫的情況，腸系膜淋巴結腫大。大腸內有脫落的纖維素性壞死膜，肝臟顏色變淡，脾臟腫大嚴重，充血，為暗紅色。

4 實驗室診斷

4.1 病毒性腹瀉抗原檢測

根據牛病毒性腹瀉抗原檢測試劑盒使用說明書，在反應板每孔加入50 μL檢測抗體，然后分別加入雙孔陰性對照和雙孔陽性對照各50 μL，待檢全血50 μL，按照步驟進行ELISA試驗操作，用酶標儀在450 nm波長讀取每個反應孔的A（450 nm）值。應用公式S-N=樣品（450 nm）值-陰性對照平均A（450 nm）值計算每個反應孔樣品的修正OD值，當被檢測樣品COD值大于0.3時判定為陽性。

4.2 沙門氏菌直接PCR檢測

將采集的2份病死牛肝臟，編號為1、2，對表面進行消毒（火焰），從內部組織剪取約1 g大小組織，置于預冷的裝有大磁珠的消毒EP管內，加入2 mL的生理鹽水，放置于高通組織研磨器（SCIENTZ-48）內，以1 200 rpm 研磨3 min。提取組織的細菌DNA（按試劑盒說明書操作）。采用InvA引物，用于沙門氏菌核酸的檢測。PCR反應體系為50 μL，其包括上下引物各1 μL、 Premix Taq（Ex Taq Version 2.0 plus dye） 25 μL、滅菌后的ddH2O 18 μL、DNA模板5 μL。設置反應程序（如表1所示），進行DNA電泳檢測，觀察擴增片段的大小。在陰性對照孔無擴增條帶，且在陽性對照孔出現相應擴增條帶時判定結果。若在陽性對照孔出現相應的條帶，陰性對照孔無條帶，且樣品擴增帶與陽性擴增帶處于同一位置，則可判定為沙門氏菌。

4.3 沙門氏菌的分離培養

將采集的2份病死牛肝臟，編號為1、2，對表面進行消毒（火焰），從內部組織剪取一小塊置于10 mL緩沖蛋白胨水（BPW）中，于37 ℃渦旋振蕩器中培養6 h進行菌的富集，然后移取緩沖蛋白胨水3 mL于5 mL RVS肉湯中，于42 ℃水浴鍋中過夜來選擇性增菌。然后蘸取RVS肉湯進行SS瓊脂平板劃線，每株菌劃線兩個平板，于37 ℃溫箱中培養18～24 h。挑取SS瓊脂無色透明有黑色中心的沙門氏菌疑似菌，于3 mL LB中培養6 h進行菌的純化。

4.4 分離菌株PCR擴增

將上述疑似沙門氏菌菌落分離培養和純化后，用細菌DNA 提取試劑盒提取DNA，并將其作為DNA模板，采用Hut為引物，進行沙門氏菌PCR檢測進一步確認。其PCR反應體系、反應程序和結果判定與沙門氏菌直接PCR檢測相同。

4.5 沙門氏菌藥敏試驗

1）實驗方法。將純化后的單個菌落加入4 mL的 TSB 培養基中，37 ℃、100 r/min搖床培養18 h。使用無菌生理鹽水以1∶20的比例對培養后的菌液進行稀釋，制成均勻的菌懸液，與濁度管（0.5 麥氏單位）濁度一致。吸取100 μL制成的菌懸液于TSA培養基表面，用涂布棒迅速涂布，使菌液均勻分布。將平板正置放入37 ℃培養箱中 2～4 min后，取藥敏片有規律平貼到平皿培養基表面，具體要求為：藥敏片邊緣距離平皿內邊緣不小于13 mm，相鄰兩張藥敏片的距離不小于24 mm。貼好藥敏片后，標記藥敏片名稱，將平皿倒置于37 ℃溫箱中培養18～24h 后，觀察。

2）結果判定。將平板取出后，使用游標卡尺測量抑菌環直徑，并記錄。

4.6 實驗動物攻毒試驗

選取6只健康昆明小白鼠，隨機分為試驗組3只和對照組3只。實驗組小鼠腹腔注射0.3 mL一定濃度的沙門氏菌TSB培養液，對照組腹腔注射0.3 mL的滅菌TSB培養液，兩組小白鼠隔離飼養16 h后，觀察記錄小白鼠生存狀態。

4.7 實驗室診斷結果

1）病毒性腹瀉抗原檢測結果。利用抗原檢測試劑盒檢測全血中的病毒性腹瀉病毒，結果從10份樣品中檢出9份為病毒性腹瀉抗原陽性。

2）沙門氏菌直接PCR檢測結果。2份樣品出現與陽性對照同樣的特異性擴增條帶，且陰性對照無條帶，即可判定為沙門氏菌（如圖1所示）。

3）沙門氏菌的分離培養結果。在所采集病死牛肝臟中分離純化出了在SS瓊脂平板上呈現為黑色中心、白色透明外周、光滑表面、邊緣整齊、形狀為圓形的菌落。通過革蘭氏染色和顯微鏡檢查，可見為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌（如圖2所示）。

4）分離菌株PCR擴增檢測結果。2份樣品出現與陽性對照同樣的特異性擴增條帶，且陰性對照無條帶，即可判定為沙門氏菌（如圖3所示）。

5）沙門氏菌藥敏試驗結果。見表2。

6）實驗動物攻毒試驗結果。對實驗組3只小白鼠實驗組小鼠腹腔注射0.3 mL一定濃度的沙門氏菌TSB培養液16 h后，全部死亡。 對照組3只小白鼠腹腔注射0.3 mL的滅菌TSB培養液16 h后，無任何反應。無菌采集實驗組死亡小白鼠的肝臟，并進行細菌檢測，結果分離出與病原菌形態極為相似的細菌，證明小鼠死亡由沙門氏菌引起。

7）實驗室診斷結論。通過上述7種實驗室實驗結果顯示，確診為沙門氏菌和病毒性腹瀉病毒混合感染。

5 防治建議

1）及時隔離患病牛，并對環境進行消毒。可使用 2%～4%氫氧化鈉進行消毒，能夠很好地殺滅環境中的沙門氏菌，避免二次感染[1]。

2）免疫接種是預防的重要措施。制定合理免疫程序，及時對未發病牛群（包括1歲以上牛）接種牛副傷寒滅活疫苗，1 周歲以下的牛只接種2 mL，1周歲以上使用劑量為5 mL。接種牛副傷寒滅活疫苗1周后接種牛病毒性腹瀉疫苗，每頭接種2 mL，21 d后以相同劑量進行二免[2]。

3）患牛的治療一定要結合實際情況。根據患牛表現出的臨床癥狀，給予適量抗生素，及時補液和補充電解質。要禁止使用皮質類固醇藥物，否則會明顯加劇病牛消化道潰爛癥狀，對口腔糜爛或潰瘍的病牛應用外用藥物對癥治療[3]。

4）加強牛群飼養管理。對患病牦牛犢牛進行圈養飼喂補飼，增加飼草料適口性和營養，提升病牛機體的免疫力。

5）使用益生菌。飼料中添加或灌服適當濃度的乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌等益生菌，增加胃腸道有益菌群，調節胃腸道微生物平衡和提高免疫力，降低疾病對機體的損害程度[4]。

6）加強引種調運工作。在購買牛之前，需要對養牛場（戶）進行必要的評估，以保證牛群的健康[3]。運輸過程中和到達目的地后，最大限度減少牛群的應激。

7）開展監測。通過胎盤屏障垂直傳播并感染胎兒是導致牛群持續性感染病毒性腹瀉病毒的重要原因[5]，該病流行地區應在繁殖季節前應對牛群開展必要的監測，及時淘汰感染牛只[6]。

6 討論

隨著家畜在不同地域的交易和流通日益頻繁，裕固縣牦牛發生的疫病種類和數量也在持續上升，肅南牦牛這一生活在祁連山高海拔地區的獨有牦牛品種有關沙門氏菌及病毒性腹瀉病毒混合感染的相關報道尚缺乏。牛病毒性腹瀉病毒在我國各地區的感染情況較為嚴重，已成為威脅牛養殖業的主要傳染病之一，此次是首次在肅南牦牛中檢出病毒性腹瀉病毒感染的報道，說明肅南牦牛群體中也存在牛病毒性腹瀉病毒病的流行和感染，因為牛病毒性腹瀉病毒病大部分是隱性感染和免疫耐受，導致沒有明顯的臨床癥狀，而沒有被重視，所以應該要及時采取積極有效的防控措施來遏制該病不斷蔓延[6]。沙門氏菌是生產生活中常見的一種病菌，血清型多[4]，可根據病牛臨床特征和分離培養判定病原，并進行對癥治療，常用的抗生素對牛沙門氏菌病應具有較好療效，但是從該菌的耐藥性來看，進行藥敏試驗可較為準確的選擇應用藥敏性高的藥物，提升療效，縮短用藥時間，降低治療經濟成本[1]。

參考文獻：

[1] 顏瑞娟.牛沙門氏菌病的診斷和防治措施[J].中國動物保健，2021，23（11）：36+40.

[2] 侯天燕，韓邦運.牛沙門氏菌病的診斷要點及防控措施[J].吉林畜牧獸醫，2021，42（4）：75.

[3] 婁金艷.牛病毒性腹瀉的診斷與治療[J].畜牧獸醫科技信息，2023（6）：78-80.

[4] 張蕾，陳亮，馮萬宇，等.牛沙門氏菌病的病原耐藥表型和防治技術研究進展[J].現代畜牧科技，2021，79（7）：5-7+15.

[5] 高閃電，王錦明，田占成，等.1株牛病毒性腹瀉病的分離毒株的基因組特征[J].畜牧獸醫學報，2020，51（8）：1913-1922.

[6] 夏秀麗，姜濤，李成波，等.牛病毒性腹瀉防制[J].吉林畜牧獸，2023，44（5）：87-88.