輔酶Q0增強氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素殺滅大腸桿菌的效果分析

摘要：尋找新型的抗生素佐劑以提高現有抗生素的殺菌效率，實現快速高效殺滅病原菌是降低細菌耐藥風險的重要手段。通過外源添加輔酶Q0（CoQ0）聯合氨基糖苷類或喹諾酮類抗生素對大腸桿菌進行殺滅效果測試。結果表明：輔酶Q0能夠顯著增強氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素對大腸桿菌BW25113及8株臨床耐藥大腸桿菌的殺滅效果。濃度梯度測試和時間依賴性試驗結果顯示輔酶Q0增強氨基糖苷、喹諾酮類抗生素殺菌具有濃度依賴性和時間依賴性。輔酶Q0最適濃度為30μg mL-1，其中輔酶Q0輔助慶大霉素的最佳作用時間為5h、輔助氧氟沙星的最佳作用時間為8h。研究結果為開發輔酶Q0作為新型氨基糖苷類或喹諾酮類抗生素佐劑提供了數據支撐。關鍵詞：輔酶Q0;氨基糖苷類；喹諾酮類；抗生素；細菌耐藥；大腸桿菌

中圖分類號：S859.796文獻標志碼：A文章編號：0253-2301（2024）09-0030-06

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.09.006

Analysis on the Enhancement of Aminoglycoside and Quinolone Antibiotics’Effect on KillingEscherichia Coli by Coenzyme Q0

LI Ying-hong，LI Jia-chen-chen，WANGZi-han，ZHAO Hang-yu，CHEN Ya-juan*

（Fujian University KeyLaboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation，College of Life Science，Fujian Normal university，Fuzhou，Fujian 350108，China）

Abstract：Finding the new-type antibiotic adjuvant to improve the bactericidal efficiency of the existing antibiotics and achieve the rapid and efficient killing of pathogens is an important means to reduce the risk of bacterial resistance.The bactericidal effect of coenzyme Q0（CoQ0）combined with aminoglycosides or quinolones antibiotics against Escherichia coli was tested by adding the exogenous coenzyme Q0.The results showed that the coenzyme Q0 could significantly enhance the bactericidal effect of aminoglycosides and quinolones antibiotics against Escherichia coli BW25113 and 8 strains of clinical drug-resistant Escherichia coli.The results of concentration gradient test and time-dependent test showed that the coenzyme Q0 enhanced the bactericidal activity of aminoglycosides and quinolones antibiotics in a concentration-dependent and time-dependent manner.The optimal concentration of coenzyme Q0 was 30μgmL1.The optimal action time of coenzyme Q0 assisted gentamicin was 5 h，and the optimal action time of coenzyme Q0 assisted ofloxacin was 8 h.The results provided data support for the development of coenzyme Q0 as a new-type adjuvant for aminoglycoside or quinolones antibiotics

Keywords：Coenzyme Q0;Aminoglycosides;Quinolones;Antibiotic;Bacterial resistance;Escherichia coli

抗生素用于農業畜牧養殖業上治療細菌感染無疑是一項重大突破，然而，自抗生素被大量發現并廣泛應用的熱潮過后，發現或者開發新抗生素的難度越來越大1-3]。雖然美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的抗生素藥物在過去幾年呈上升趨勢4，然而大部分抗生素在投入使用后不久便發現有對應的耐藥菌株產生，耐藥菌的進化速度已經顯著超越了新抗生素的發現與人工合成步伐，導致泛耐藥甚至全耐藥的細菌不斷涌現5-6。面對抗生素耐藥性問題，全世界科學家都在積極致力于耐藥機制的研究以尋找新的治療細菌感染的方法。

抗生素佐劑又被稱為“耐藥性爆破者”或“抗生素增效劑”?？股刈魟┡c抗生素聯合用藥時能降低現有抗生素的使用濃度，并且能夠降低抗生素帶來的副作用?；衔锉旧韼缀鯖]有抗生素活性，但可以阻斷耐藥性或以其他方式增強抗生素作用7。理想情況下，抗生素佐劑可以通過干擾抗生素滅活酶、膜穩定性或外排泵從而增強抗生素的作用來輔助殺菌。隨著研究的不斷深入，已有報道表明葡萄糖和丙酮酸與抗生素聯合使用能有效增強現有抗生素對耐藥菌的抗菌活性，提高殺菌效果[8。此外，新抗生素研發周期長且長期單獨用藥易產生耐藥，由于抗生素與佐劑雙重靶點的存在，聯合使用的治療策略在減少用藥量和減緩耐藥性發展方面具有很大的潛力9，延長了現有抗生素的使用壽命，為臨床用藥提供了新的治療選擇。

輔酶Q0（CoQ0）是輔酶Q（CoQ）系列化合物，其也稱泛醌。輔酶Q（CoQ）在呼吸鏈中是一種和蛋白質結合不緊密的輔酶，CoQ在電子傳遞鏈中處于中心地位。脂溶性的異戊二烯側鏈使CoQ在線粒體內膜脂雙層中局部擴散，作為一種流動著的電子載體在復合體I（復合體Ⅱ）和復合體Ⅲ之間起傳遞電子的作用。有報道證實，泛醌氧化還原酶作為Na泵來干擾細菌的質子動力勢（PMF）可以作為新的抗生素潛在靶標10;輔酶Q0（CoQ0）已被證明具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化活性，其對大腸桿菌具有顯著的抑菌活性[1]，并且通過破壞金黃色葡萄球菌細胞膜而對金黃色葡萄球菌表現出抗菌作用12。CoQ0破壞鼠傷寒沙門氏菌細胞膜完整性并誘導細胞形態變化，導致超極化、細胞內ATP濃度降低和細胞成分泄漏13]。已有文章報道，CoQ0對食源性病原體阪崎腸桿菌同樣具有很強的滅活作用14]?；谝陨螩oQ0對多種細菌的抗菌活性，本研究提出將抗生素與CoQ0聯用，嘗試殺滅模式生物大腸桿菌-BW25213，將CoQ0開發為新型的抗生素佐劑，以期找到新的抗菌作用靶點，能夠降低細菌耐藥帶來農業畜牧業養殖業上的危機。

1材料與方法

1.1試驗材料

大腸桿菌E.coli K-12 BW25113，8株臨床耐藥大腸桿菌由福建醫科大學第一附屬醫院饋贈。

1.1.1試驗藥品與儀器試劑藥品：輔酶Q0（CoQ0）、無菌磷酸鹽緩沖液（pH7.4）。以上藥品配制成溶液后均經過0.22μm微孔濾膜過濾確保無菌后備用。（1）試劑藥品及使用濃度：CoQ0（30μg mL-1）。（2）氨基糖苷類抗生素：妥布霉素（Tob 100μgmL-1）、慶大霉素（Genta 100μgmL-1）、鏈霉素（Strep 400μg·mL1）、卡那霉素（Kana 200μg·mL1）。（3）β-內酰胺類抗生素：美羅培南（Mer 100μg mL-1）、羧芐青霉素（Car 200μg·mL1）。（4）喹諾酮類抗生素：氧氟沙星（Of15μg mL1）、環丙沙星（Cip5μg·mL1）。

試驗儀器：-80℃冰箱、37℃培養箱、振蕩器、超凈工作臺、離心機、高壓滅菌鍋。

1.2試驗方法

1.2.1菌種培養及稀釋點板方法

（1）菌種培養

大腸桿菌活化（BW25113）：取保存于-80℃冰箱中的大腸桿菌BW25113的20%甘油菌液1μL，加至1 mL LB液體培養基中，于37℃搖床（220r·min-1）培養過夜至平臺期，將得到的菌液稀釋500倍后接種于20 mL的MHB液體培養基中，37℃搖床（220 r·min-1）培養過夜20h，得到大腸桿菌培養液。

（2）細菌存活

將處理后的菌液按照每次10倍的梯度用10 mmol-L1無菌磷酸鹽緩沖液（pH為7.4）稀釋，稀釋梯度為10、102、103、10?、10?，每個稀釋度取4μL菌液點滴在LB固體培養基平板上，置于37℃溫箱培養12 h后，檢查細菌死亡，并進行菌落計數，計算大腸桿菌經處理后的存活率。

1.2.2 CoQ0輔助氧氟沙星殺滅平臺期大腸桿菌的濃度梯度測試取18 mL的大腸桿菌培養液，分裝于無菌搖菌管中，分為空白組（control）、單處理組（編號為1～8單加CoQ0，設置濃度梯度1、2、5、10、15、20、25、30μgmL1）、雙處理組（編號為9～16，CoQ0單處理組的濃度下加入氧氟沙星，氧氟沙星最終工作濃度5μg mL1），將搖菌管置于37℃搖床（220 r·min1）培養處理5 h。得到的處理后菌液進行無菌磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，10倍稀釋點板，計算細菌存活數。

1.2.3 CoQ0輔助三類殺菌型抗生素殺滅平臺期大腸桿菌效果測試取18 mL的大腸桿菌培養液，分裝于無菌搖菌管中，隨機分為空白組、Tob組、Genta組、Kana組、Strep組、Car組、Ofl組、Cip組、Mer組。每組分為未加CoQ0組（標記為-CoQ0）、加CoQ0組（標記為+CoQ0），加入相應濃度的抗生素與CoQ0后，將搖菌管置于37℃搖床（220 r·min-）培養處理5h。得到的處理后菌液進行無菌磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，10倍稀釋點板，計算細菌存活數。

1.2.4 CoQ0輔助抗生素殺滅大腸桿菌的最佳作用時間測試取8mL大腸桿菌培養液，分裝于無菌搖菌管中，隨機分為4組，即空白組、Cip組、Ofl組和Genta組。每組分為未加CoQ0組（標記為-CoQ0）、加CoQ0組（標記為+CoQ0），加入相應濃度的抗生素與CoQ0后，將搖菌管置于37℃搖床（220 rpm）培養處理。分別在0、1、3、5、8h后，取出50μL菌液，得到的處理后菌液進行無菌磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，10倍稀釋點板，計算細菌存活數。

1.2.5 CoQ0輔助氧氟沙星、慶大霉素殺滅臨床耐藥大腸桿菌的效果測試為了驗證CoQ0在臨床耐藥方面的應用價值，本研究從福建醫科大學第一附屬醫院獲得8株臨床上分離的大腸桿菌耐藥菌株，其耐藥特性見表1。對8株臨床分離出來的大腸桿菌進行殺菌測試，選取測試有效的喹諾酮類抗生素氧氟沙星、氨基糖苷類抗生素慶大霉素作為試驗。將臨床大腸以1.2.1同樣的方式培養，得到大腸桿菌培養液。

每株臨床大腸取6 mL大腸桿菌培養液，分裝于無菌搖菌管中，隨機分為空白組、Ofl組、Genta組。每組分為未加CoQ0組（標記為-CoQ0）、加CoQ0組（標記為+CoQ0），加入相應抗生素以及CoQ0后，將搖菌管置于37℃搖床（220 r·min-1）培養處理5 h。得到的處理后菌液進行無菌磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，10倍稀釋點板，計算細菌存活數?？偣灿?株臨床大腸桿菌均重復以上步驟。

1.3數據處理與分析

試驗數據統計通過ANOVA方差分析，數據來源于3次獨立試驗。

2結果與分析

2.1 CoQ0輔助氧氟沙星殺滅平臺期大腸桿菌的濃度梯度測定

由圖1可知，在均不殺菌的反應體系下，雙處理組顯示出優越的輔助殺菌效果，并且CoQ0濃度越高輔助殺菌效果最好，這表明CoQ0輔助氧氟沙星殺滅平臺期大腸桿菌具有濃度依賴效應。選取殺菌效果最好的濃度30μgmL1開展后續研究。

2.2 CoQ0輔助三大類殺菌型抗生素殺滅平臺期大腸桿菌的效果分析

由圖2可知，CoQ0能顯著增強氨基糖苷類抗生素（Tob、Genta、Kana、Strep）殺滅平臺期大腸桿菌，與單處理相比增強了3個數量級以上的殺傷效果。同樣CoQ0能增強喹諾酮類抗生素（Ofl、Cip）殺滅大腸桿菌，與單處理組相比能夠增強2個數量級及以上的殺傷。而CoQ0沒有增強β-內酰胺類抗生素（Car、Mer）的殺菌效果。

2.3 CoQ0輔助氧氟沙星、慶大霉素殺滅平臺期大腸桿菌的時間梯度效果分析

為了測試CoQ0聯合抗生素處理的最佳作用時間，本研究選取了氨基糖苷類抗生素慶大霉素以及喹諾酮類抗生素作為代表，進行時間殺傷曲線測定。由圖3可知，在1 h時CoQ0聯合抗生素雙處理組輔助殺菌效果已初步顯現，隨著時間的增加輔助殺傷的效果也隨之增加，CoQ0聯合Genta組在5h效果達到最佳，CoQ0聯合Ofl組的輔助殺傷效果在8h后達到最佳狀態。由此可知CoQ0輔助Of1以及Genta殺菌具有時間依賴效應。

2.4 CoQ0輔助氧氟沙星、慶大霉素殺滅平臺期臨床耐藥大腸桿菌的效果分析

由圖4可知，在這8株臨床分離的耐藥大腸桿菌中，與慶大霉素單處理組相比，CoQ0聯合慶大霉素雙處理對這8株的殺滅效果均有極顯著增強；而與氧氟沙星單處理相比，CoQ0聯合氧氟沙星雙處理對其中6株大腸桿菌無輔助殺菌效果，而對其中215749、305622這兩株臨床大腸具有2～3個數量級的輔助殺滅效果。

3結論與討論

目前，畜禽類細菌耐藥研究已受到國內外研究人員的廣泛關注，已有大量關于畜群細菌耐藥的研究報道[15-16]。我國又是世界上最大的抗生素生產和使用國家?？股卦卺t療保健、畜牧養殖等方面有著廣泛的用途，對人類傳染病的治療、動物疫病的防治和公眾健康的保護具有十分重要的意義。然而，抗生素的大量濫用導致其對人、畜的危害越來越大，有時還會導致敏感菌演變為耐藥菌7。特別是某些多藥耐藥菌的產生，極大地降低了抗菌藥物的療效18]?？咕幬锏拈_發速度遠遠跟不上臨床的需求，因此，迫切需要找到其他有效的藥物來對抗耐藥菌。

本研究發現CoQ0能夠增效氨基糖苷、喹諾酮類抗生素殺滅大腸桿菌以及臨床大腸，并且初步研究其增效抗生素殺菌的效果，而具體其增效殺菌的機制是怎樣的？研究人員還需進一步探究。未來還需要對其他多種病原菌進行殺菌驗證，以擴展輔酶Q0在多種耐藥細菌中的增效殺菌應用。本研究為尋找新型有效地增強抗生素殺菌效果的方法提供新的思路，并為有效降低病原菌產生耐藥風險提供新的策略。

參考文獻：

[1]COURTEMANCHE G，WADANAMBY R，KIRAN A，et al Looking for solutions to the pitfalls of developing novel antibacterials in an economically challenging system[J].Microbiology Research，2021，12（1）：173-185.

[2]DHINGRA S，RAHMAN NAA，PEILE E，etal.Microbial resistance movements：an overview of global public healththreats posed by antimicrobial resistance，and how best to counter[J].Frontiers in Public Health，2020，8：535668.

[3]HUTCHINGS MI，TRUMAN AW，WILKINSON B.Antibiotics：past，present and future[J].Current Opinion in Microbiology，2019，51：72-80.

[4]ANDREI S，DROC G，STEFAN G.FDA approved antibacterial drugs：2018-2019[J].Discoveries：Craiova，2019，7（4）：e102.

[5]CDC.Antibiotic resistance threats in the united States，2019[R].Centers forDisease Control and Prevention（U.S.），2019.

[6]ZAMAN S B，HUSSAIN M A，NYE R，etal.A review on antibiotic resistance：alarm bells are ringing[J].Cureus，2017，9（6）：e1403.

[7]WRIGHTGD.AntibioticAdjuvants：Rescuing Antibiotics from Resistance[J].TrendsMicrobiol.，2016，24（11）：862-871.

[8]ALLISON KR，BRYNILDSEN MP，COLLINS JJ.Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides[J].Nature.，2011，473（7346）：216-20.

[9]LIU Y，TONG Z，SHI J.Drug repurposing for next-generation combination therapies against multidrug-resistant bacteria[J].Theranostics.，2021，11（10）：4910-4928.

[10]WANG R，LI J，QU G，etal.Antibacterial Activity and Mechanism of Coenzyme Q0 Against Escherichia coli[J]Foodborne PathogDis.，2021，18（6）：398-404.

[11]FAN Q，YAN C，SHI C，etal.Inhibitory Effect of Coenzyme Q0 onthe Growth of Staphylococcus aureus[J].Foodborne Pathog Dis.，2019，16（5）：317-324.

[12]YANG Z，MA X，LI Y，etal.Antimicrobial Activity and Antibiofilm Potential of Coenzyme Q0 against Salmonella Typhimurium[J].Foods.，2021，10（6）：1211.

[13]GUO D，WANG S，LI J，etal.The antimicrobial activity of coenzyme Q0 against planktonic and biofilm forms of Cronobactersakazakii[J].Food Microbiol.，2020，86：103337.

[14]DIBROV P，DIBROV E，PIERCE GN.Na-NQR（Na-translocating NADH：ubiquinone oxidoreductase）as a novel target for antibiotics[J].FEMS Microbiology Reviews，2017，41（5）：653-671.

[15]楊睿，王婷婷，王孝友，等.腹瀉仔豬中奇異變形桿菌分離鑒定與耐藥基因分析[J].中國獸醫學報，2019，39（11）：2146-2151.

[16]王瞳，萬佳宏，常佳偉，等.寧夏地區牛源腸球菌分離鑒定及耐藥性與毒力基因檢測[J].中國獸醫學報，2020，40（3）：562-567.

[17]胡燕，白繼庚，胡先明，等.我國抗生素濫用現狀、原因及對策探討[J].中國社會醫學雜志，2013（2）：128-130.

[18]鐘艾玲，田敏，劉艷全等.氨基糖苷類抗生素的耐藥機制研究進展[J].中國抗生素雜志，2019，44（4）：401-405.

（責任編輯：陳文靜）