QuEChERS結合高效液相色譜串聯質譜法檢測豬肉中16種獸藥殘留量

摘要：建立了一種QuEChERS前處理與高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）相結合同時檢測豬肉中16種獸藥殘留的方法。樣品采用水-0.1%甲酸乙腈經QuEChERS技術提取和凈化后，在正離子多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）下進行分析測定。結果表明：16種獸藥在2.0～100.0μg·kg1的范圍內有良好的線性關系（相關系數r>0.9970）;檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）的范圍分別為0.01～0.25μg·kg1、0.03～0.82μg kg-1;在豬肉樣品中進行了2、4、20μg-kg13個不同濃度水平的加標試驗，相對標準偏差RSD為1.1%～9.0%，加標回收率在70.4%～118.1%。該方法的重復性和回收率滿足試驗要求，靈敏度高，適用于豬肉中多種類獸藥殘留的分析檢測。

關鍵詞：獸藥殘留；豬肉；高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）;QuEChERS

中圖分類號：S859.84文獻標志碼：A文章編號：0253-2301（2024）09-0051-08

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.09.009

Determination of 16 Kinds of Veterinary Drug Residues in Pork by QuEChERS Coupled with HPLC-MS/MS

CHEN Nan-nan，CHEN Xiu-ming，ZHANQing，JIE Xiao-ling，ZHOU A-rong，FANG Dong-sheng*

（Fujian Institute of Microbiology，Fuzhou，Fujian 350007，China）

Abstract：A method for the simultaneous determination of 16 veterinary drug residues in pork by using QuEChERS pretreatment combined withhigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）was established.The samples were extracted and purified by using the QuEChERS technology with water-0.1%formic acid acetonitrile，and then analyzed and determined in the positive ion multiple reaction monitoring（MRM）model.The results showed that：there was a good linear relationship among the 16 veterinary drugs in the range of 2.0-100.0μg-kg1（the correlation coefficient r>0.9970）.The limits of determination（LOD，S/N=3）and limits of quantitation（LOQ，S/N=10）ranged from 0.01 to 0.25μg-kg1and from 0.03 to 0.82μg-kg1，respectively.The spiked experiments at three different concentration levels of 2，4 and 20μg-kg1were carried out in the pork samples.The relative standard deviation（RSD）ranged from 1.1%to 9.0%，and the recovery rate ranged from 70.4%to 118.1%.The repeatability and recovery rate of the method met the test requirements，and the sensitivity was high，which was suitable for the analysis and detection ofvarious veterinary drug residues in pork.

Key words：Veterinary drug residues;Pork;High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）;QuEChERS

作為世界上主要的豬肉生產和消費國，獸藥在畜牧業中扮演著至關重要的角色，在預防動物疫病，確保食品產量方面發揮著關鍵作用。然而，部分養殖戶為了經濟利益，可能會濫用獸藥或不遵守用藥規范，造成豬肉中獸藥殘留超過規定限度，從而引起食品安全的問題1-2]。如果人們長期攝入這些獸殘超標的動物源性食品，體內藥物的累積可能會誘發毒性反應，危害健康3。因此，確保市售豬肉符合質量和安全標準，加強對豬肉中獸藥殘留的檢測和研究顯得尤為關鍵。現行國家標準GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》[4和GB 31650.1-2022《食品中41種獸藥最大殘留限量》5等標準和法規已經為肉類、蛋類、乳制品等動物源食品的獸藥殘留量設定了明確的限制標準。為了保護消費者的健康和確保動物源食品的質量安全，開發出快捷、高效且能同時準確檢測多種獸藥殘留的分析方法具有重要意義。

動物源食品由于其基質的復雜性，潛在干擾物多，這給獸藥殘留的檢測帶來了挑戰。由于獸藥殘留在樣品中含量很低，儀器的高選擇性和高靈敏度成為了推動獸藥殘留檢測技術發展的關鍵因素。高效液相色譜串聯質譜技術（HPLC-MS/MS）結合了液相色譜的高效分離能力和質譜檢測器的高靈敏度與選擇性的優點，使其成為獸藥殘留檢測的首選方法[6-9]。現行國家標準GB 31658.17-2021《動物性食品中四環素類，磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》[10已提供一種用于檢測豬肉中36種獸藥殘留的檢測分析方法。然而，該標準中的樣品前處理過程較為繁瑣，處理效率不高，溶劑使用量大，成本也相對較高，無法很好地滿足獸藥殘留快速檢測的需求。因此，開發更為高效的樣品前處理方法成為了當前獸藥殘留分析領域的重點。

QuEChERS技術是通過提取劑、吸水劑和凈化劑對樣品進行前處理。常用的凈化劑包括N-丙基乙二胺（PSA）、C18和GCB，能夠有效吸附并去除大部分雜質，達到凈化樣品的目的。QuEChERS技術因其高效省時、操作便捷、成本低、穩定性強和安全性佳等優勢[1，在獸藥殘留分析領域被廣泛應用[12-15]。因此，本研究采用QuEChERS前處理結合LC-MS/MS技術，對前處理條件、色譜、質譜條件等參數進行優化，構建了簡單高效且具有高靈敏度的檢測方法，能夠同時檢測豬肉中常見的16種殘留獸藥（包括磺胺類、喹諾酮類、大環內酯類等），以期為今后獸藥殘留檢測提供借鑒。

1材料與方法

1.1供試材料

供試樣品豬肉為市售產品。

1.2儀器和試劑

1.2.1主要試劑甲醇、乙腈均為色譜純試劑（德國Merck公司）;無水乙醇為分析純試劑（西隴科學股份有限公司）;甲酸為色譜純試劑（德國CNW公司）;PSA粉、C18粉、無水硫酸鎂購自月旭科技（上海）股份有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉等其他試劑均為分析純；陶瓷均質子（長2 cm×直徑1 cm）;尼龍微孔濾膜（13 mm，0.22μm）;試驗所用超純水為Milli-Q超純水儀制備。

標準品磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺嘧啶、磺胺氯噠嗪、鹽酸林可霉素（一水物）均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；標準品磺胺間甲氧嘧啶、羅紅霉素、替米考星、鹽酸金剛乙胺、左旋咪唑、甲氧氯普胺、洛美沙星、氧氟沙星、沙拉沙星均購自北京壇墨質檢科技有限公司。

1.2.2儀器與設備Agilent 6470三重四極桿質譜儀（Agilent公司）;KQ-5200DE數控型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）;絞肉機（美的）;超純水儀Milli-Q（Millipore公司）;XSE105分析天平（Mettler Toledo公司）;BC-1000數顯型多管式旋渦振蕩儀（深圳逗點生物技術有限公司）;Eppendorf 5810R冷凍離心機（Eppendorf公司）;HSC-4B水浴氮吹儀（天津市恒奧科技發展有限公司）。

1.3試驗方法

1.3.1樣品前處理取豬肉適量，經絞肉機絞碎后，準確稱量5.00 g的樣品放入50 mL的離心管內，隨后添加3.0 mL的超純水和陶瓷均質子，通過渦旋混合1 min以確保肉質均勻分散。再加入20.0 mL含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液，蓋緊瓶蓋充分振搖1 min，渦旋振蕩提取5 min，使樣品充分分散，再加入4.0 g硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋5 min后，在低溫下以5500 r min1轉速離心10min。將上清液轉移到1個裝有50 mg PSA粉末、200 mg C18粉末、1.0 g無水硫酸鈉的15 mL塑料離心管中，渦旋振蕩2 min，以6000 r·min1的轉速離心10 min。定量移取5mL凈化后的上清液，于40℃下氮吹至干，然后加入1.0 mL的25%乙腈/水（體積比1：3）溶液溶解后再加入1.0 mL乙腈飽和的正已烷，渦旋混勻，5000 r·min1離心5 min，將下層溶液通過0.22μm孔徑的微孔濾膜進行過濾，然后進行上機測定。

1.3.2溶液配制（1）獸藥標準儲備液的配制：分別準確稱取適量的獸藥標準品，用甲醇溶解，獲得濃度為1.0 mgmL1的標準儲備液，避光保存在-18℃的條件下。（2）混合標準中間溶液的配制：分別準確吸取適量上述各種獸藥標準儲備液，用甲醇稀釋，配成濃度為10μg：mL1的混合標準中間溶液，避光保存在4℃的條件下。（3）混合標準工作液的配制：準確量取適量獸藥混合標準中間溶液，并用甲醇稀釋，配成濃度為1μgmL1的混合標準工作液，現配現用。

1.3.3儀器檢測條件

（1）色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm）;流速：0.4 mL.min1;進樣量：2μL;柱溫：40℃。流動相A：含0.1%（體積分數）甲酸水溶液；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～3.60 min，5%B;3.60～3.80 min，5%～12%B;3.80～7.00 min，12%B;7.00～7.10 min，12%～26%B;7.10～9.00 min，26%～55%B;9.00～9.10 min，55%～100%B;9.10～11.50 min，100%B;11.50～11.60 min，100%～5%B;11.60～14.00 min，5%B。

（2）質譜條件

電噴霧離子源正離子模式（ESI），鞘氣溫度設定為250℃;鞘氣流速調節至11.0 L·min-1;霧化氣壓力設置為45 psi;毛細管電壓調整至3.5 kV;干燥氣溫度升至300℃;干燥氣流速設定為8.0 L·min1;掃描方式：多反應離子監測，優化后的各種獸藥的質譜檢測參數見表1。

1.3.4提取溶劑的選擇與其他有機溶劑相比，乙腈的優勢在于它能有效減少脂肪和色素等雜質的提取，同時還能沉淀蛋白16，提取效果好17，因此適合用于動物源性食品中大部分偏極性獸藥的提取18]。考慮到磺胺類和喹諾酮類獸藥可呈酸堿兩性，在酸性條件下更易于萃取，因此本試驗中加入了一定量的甲酸。分別利用含有0.1%甲酸的乙腈溶液以及含有1%甲酸的乙腈溶液對豬肉樣品進行提取，觀察提取效果。在提取過程中，由于乙腈具有沉淀蛋白質的作用，直接添加會導致肉質結塊。為避免出現以上問題，可以先加入適量的水使樣品充分分散，然后再進行有機溶劑的提取。隨后，通過添加無水硫酸鈉和氯化鈉，并在低溫環境下進行快速離心，以實現水相和有機相的有效分離，從而在有機相中高效地富集目標化合物。這種方法能夠有效防止水分和水溶性雜質混進提取液中，從而達到脫水和鹽析的目的，同時提高提取效率。以陰性豬肉樣品加標量10μg·kg-1為試驗樣品，對比該樣品在未加水分散情況下直接用有機溶劑提取和先加水分散后再用有機溶劑提取的16種獸藥的上機響應值。

1.3.5凈化條件優化在經過鹽析處理后，豬肉提取液中仍然存在脂肪、蛋白質、甾醇、脂肪酸和色素等雜質。在QuEChERS凈化技術中，常用的吸附劑包括N-丙基乙二胺（PSA）、C18和GCB。PSA通常用于吸附脂肪酸、色素和糖類等極性物質；C18能高效吸附甾醇、脂質化合物以及其他非極性成分；GCB的平面結構不僅能夠吸附色素，還能吸附含有苯環結構的物質[1。由于本試驗中的大部分獸藥具有苯環結構，為了能有效去除基質提取液中大部分干擾物的影響，因而確定了PSA+C18這個凈化劑組合。按照1.2.1樣品前處理方法，利用加標量為20μg.kg1的豬肉樣品來評估凈化效果，考察在脫水劑無水硫酸鈉用量為1.0 g時，比較PSA與C18不同使用量的凈化效果和加標回收率。1.3.6檢測方法評估將陰性豬肉樣品按1.2.1方法進行前處理，配制6個梯度水平（2、5、10、20、50、100μg·kg-1）的基質匹配標準工作溶液，上機測定。以定量離子峰面積作為縱坐標，濃度作為橫坐標，做定量工作曲線，考察方法的線性范圍、靈敏度。通過對陰性豬肉樣品進行加標回收試驗，添加水平：2.0、4.0、20.0μg·kg-1，按前述方法進行前處理和檢測，每組濃度平行6次試驗，計算實驗的加標平均回收率和RSD，考察方法的準確度與精密度。

2結果與分析

2.1前處理條件優化

2.1.1提取溶劑的選擇由圖1可知，使用含有1%（v/v）甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑時，豬肉樣品出現了一定程度的結塊現象，這不利于樣品的均勻分散和獸藥的徹底提取。因此，選擇含有0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑。

由圖2可知，以陰性豬肉樣品加標量10μg-kg-1為試驗樣品，加水分散后再用有機溶劑提取的樣品中的獸藥在儀器上的響應較高說明該方法的提取效率比直接加入有機溶劑的要好。因此，本研究采用0.1%甲酸乙腈/水混合溶劑進行提取，并通過鹽析離心分離技術來實現分層。

2.1.2凈化條件優化由圖3可知，通過比較3種吸附劑組合的回收率，可以發現50 mg PSA+200 mg C18這種吸附劑組合的回收率總體優于其他組合。因此，采用1.0 g無水硫酸鈉、50 mg PSA和200 mg C18為凈化劑組合對樣品進行前處理。

2.2儀器條件的優化

2.2.1色譜分離條件的選擇本研究選用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱來進行分離，考察了不同流動相條件對16種化合物的分離效果、峰形和信號響應產生的影響。結果表明，在采用乙腈-水作為流動相的條件下，這些獸藥能在較短的時間內得到有效的分離，且分離效果較甲醇-水流動相體系更佳。此外，添加甲酸可較好提高目標化合物的信號響應。因此本研究使用乙腈和含0.1%體積分數甲酸的水溶液作為流動相。通過進一步優化梯度洗脫程序，基本實現本試驗中16種獸藥能在9 min內分離，且16種獸藥均可取得較好的響應值，有利于后續的質譜檢測分析。16種獸藥混合標準溶液的總離子流色譜圖見圖4。

2.2.2質譜檢測參數的優化本試驗16種獸藥化合物均易于進行離子化，因此適合采用電噴霧離子源。在正離子模式（ESI+）下，通過全掃描確定各化合物的母離子。在最優碎裂電壓下，對母離子進行二級Product Ion質譜掃描，確定出定量與定性的離子對，進行多反應監測MRM參數優化，建立MRM采集方法。獲得的最佳質譜參數見表1，各目標物的MRM色譜圖見圖5。

2.3方法的標準曲線及檢出限與定量限

由表2可知，16種獸藥在2.0～100.0μg-kg-的范圍內有良好的線性關系（r>0.9970）。檢出限（LOD）通過3倍信噪比（S/N）來確定，其對應的濃度范圍為0.01～0.25μg-kg-1。定量限（LOQ）則是基于10倍信噪比計算得出，對應的濃度范圍為0.03～0.82μg-kg-1。這些結果表明，該分析方法具有較高的靈敏度，能夠滿足GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》4和GB 31650.1-2022《食品中41種獸藥最大殘留限量》?對這16種化合物最大殘留限量的檢測標準。

2.4方法的回收率和精密度

由表3可知，各獸藥加標回收率范圍在70.4%～118.1%內，相對標準偏差RSD為1.1%～9.0%，符合GB/T 27404-2008《食品理化檢測》[20對回收率和精密度的要求。

2.5實際樣品測試

為了驗證本方法在實際樣本中的檢測效果，對市場上購買的12批次不同品種的豬肉進行測定。結果顯示其中1份豬肉樣品（圖6）同時檢出氧氟沙星、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺甲惡唑，濃度分別為16.1、1.9、2.1μg-kg-1，其余樣品均未檢出。國標GB 31650.1-2022《食品中41種獸藥最大殘留限量》s規定了磺胺類合成抗菌藥在所有食品動物的肌肉中的最大殘留限量為100μg·kg-1，氧氟沙星在所有食品動物的肌肉中的最大殘留限量為2μg-kg-1，因此在此次樣品檢測試驗中有1份實際樣品存在獸藥殘留超標現象。

3結論與討論

本研究采用QuEChERS前處理方式與高效液相色譜串聯質譜法相結合的方法，用于同時檢測豬肉中的16種獸藥殘留。對前處理條件、色譜、質譜條件等參數進行優化，有效地減少豬肉樣品中復雜基質對分析結果的干擾。樣品先用水分散后再用0.1%甲酸乙腈進行提取，經過吸附劑組合50 mg PSA和200 mg C18凈化后，通過Agilent Eclipse Plus C18色譜柱分離，在HPLC-MS/MS系統的正離子多反應監測模式下進行分析。檢測方法評估試驗結果表明，16種獸藥在2.0～100.0μg-kg-1的范圍內有良好的線性關系（相關系數r>0.9970）;檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）的范圍分別為0.01～0.25μg·kg-1、0.03～0.82μg-kg1;在豬肉樣品中進行了2、4、2 0μg·kg13個不同濃度水平的加標試驗，相對標準偏差RSD為1.1%～9.0%，加標回收率在70.4%～118.1%。經本方法測試的各項獸殘檢出限均低于現有國家標準，同時具有良好的回收率和精密度。該方法檢測分析結果靈敏度高，準確度好，且操作簡便快速，能夠滿足豬肉中獸藥殘留相關安全檢測要求，為動物源食品獸藥殘留檢測提供方法參考，也為食品安全提供了技術支持。

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（責任編輯：林玲娜）