大腸桿菌過表達WcaB對氨基糖苷類抗生素敏感性的影響

摘要：為尋找新的靶點以加速解決由于抗生素濫用而引發(fā)的細菌耐藥問題，通過利用pCA24N表達載體構(gòu)建大腸桿菌BW25113過表達乙酰基轉(zhuǎn)移酶WcaB菌株，在對數(shù)期進行氨基糖苷類抗生素殺傷效果測試，并進一步測定大腸桿菌BW25113過表達WcaB對氨基糖苷類抗生素的最小抑菌濃度（MIC）和生長曲線。結(jié)果表明：WcaB過表達后會抑制細菌生長，氨基糖苷類抗生素對WcaB過表達株的MIC沒有明顯變化，WcaB過表達使細菌在慶大霉素或卡那霉素處理下的存活率降低，證明WcaB過表達提高了大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素的敏感性。研究結(jié)果顯示乙酰基轉(zhuǎn)移酶在增強抗生素對大腸桿菌產(chǎn)敏感性方面具有重要的作用，該酶有望成為大腸桿菌新的藥理靶點。

關(guān)鍵詞：乙酰基轉(zhuǎn)移酶；氨基糖苷類抗生素；大腸桿菌

中圖分類號：S859.796文獻標志碼：A文章編號：0253-2301（2024）09-0023-07

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.09.005

Effect on the Sensitivity of Escherichia coli Overexpressing WcaB to Aminoglycoside Antibiotics

YU Dan-dan，ZHANG Yu-dan，WENG Li-hong，GAO Yuan-yuan*

（Fujian University KeyLaboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation，College of Life Science，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350108，China）

Abstract：In order to find the new targets to accelerate the solution of bacterial resistance problem caused by the antibiotic abuse，Escherichia coli BW25113 overexpressing acetyltransferase WcaB strain was constructed by using the pCA24N expression vector，and the killing effect of aminoglycoside antibiotics was tested in the logarithmic phase.Then，the minimum inhibitory concentration（MIC）and growth curve of Escherichia coli BW25113 overexpressing WcaB to aminoglycoside antibiotics were further determined.The results showed that：the overexpression of WcaB would inhibit the bacterial growth，and the MIC of aminoglycoside antibyAvbpagogOzYAuRSiMm5Qw==iotics to WcaB overexpressing strain did not change significantly.The overexpression of WcaB reduced the survival rate of bacteria treated with gentamicin or kanamycin，indicating that the overexpression of WcaB increased the sensitivity of Escherichia coli to aminoglycoside antibiotics.The results showed that acetyltransferase played an important role in enhancing the sensitivity of antibiotics to Escherichia coli，and the enzyme was expected to become a new pharmacological target for Escherichia coli.

Key words：Acetyltransferase;Aminoglycosideantibiotics;Escherichia coli

抗生素的廣泛使用會出現(xiàn)很多問題，在畜牧業(yè)中使用抗生素不科學、用量過大等不規(guī)范操作會引起細菌產(chǎn)生耐藥性1，甚至導(dǎo)致超級細菌產(chǎn)生2，也會誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生抗生素抗性基因3，進而使抗生素治療畜禽的效果不佳。自1940年以來，氨基糖苷類抗生素主要用于治療廣泛的細菌感染[4。細菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥機制主要是通過氨基糖苷類修飾酶的化學修飾5、核糖體修飾6、外排泵的作用7等方式逃逸抗生素的殺菌作用。

面對大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥性的問題，研究人員通過聯(lián)合使用抗菌藥物防治策略解決這一問題，如氨基糖苷類藥物和β-內(nèi)酰胺類藥物之間的協(xié)同作用已經(jīng)被證實有效8;通過使用-些抗生素佐劑輔助抗生素殺菌，或是通過熱休克等方法增強慶大霉素的殺菌作用9-11。為了解決耐藥問題，研究者著力于新藥開發(fā)，但是新藥開發(fā)需要的時間長12]，因而，找到新的藥物作用靶點成為解決耐藥問題的關(guān)鍵。在探索新藥物作用靶點的過程中，大多數(shù)靶標是細胞基本功能所需的酶，新靶點還未用于抗生素治療，因此具有避免當前耐藥機制的優(yōu)勢[13]。

WcaB是一種乙酰基轉(zhuǎn)移酶，在細胞外多糖可樂定（CA）的生物合成過程中催化糖鏈中半乳糖基殘基的乙酰化[14]。有研究者針對傷寒沙門氏菌，預(yù)測了乙酰基轉(zhuǎn)移酶WcaB可作為潛在的藥物靶點[15。乙酰基轉(zhuǎn)移酶在細胞代謝過程中發(fā)揮重要作用，但WcaB在大腸桿菌中的相關(guān)研究較少，在耐藥性方面的研究還未有被報道。因此，本試驗擬探討乙酰基轉(zhuǎn)移酶WcaB對大腸桿菌氨基糖苷類抗生素的影響，以評估乙酰基轉(zhuǎn)移酶WcaB在氨基糖苷類抗生素環(huán)境中對細菌存活率的影響，有望為解決大腸桿菌耐藥問題提供新的藥物靶點。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌株本試驗選用菌株為實驗室保藏的大腸桿菌BW25113菌株，構(gòu)建的過表達菌株選用的質(zhì)粒為pCA24N表達載體。

1.1.2試驗試劑慶大霉素儲液濃度為25mg mL1、卡那霉素儲液濃度50 mg·mL-1，以上兩種抗生素需要用無菌超純水配制后用0.22μm濾膜過濾除菌。氯霉素濃度為35 mg·mL-1，用分析乙醇配制后用0.22μm濾膜過濾除菌。

SDS-PAGE試驗試劑：無菌超純水、30%丙烯酰胺、1.5 mol-L1Tris-HCl（pH 8.8）、0.5 mol-L-Tris-HC1（pH 6.8）、10%SDS溶液、10%APS、TEMD、6×loading buffer、考馬斯亮藍R-250快染液、固定液、洗脫液、1×SDS電泳緩沖液。

LB液體培養(yǎng)基（1L）：氯化鈉10 g，酵母粉5g，蛋白胨10 g;0.01 mol-L1PBS緩沖液（1 L）：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na?HPO?1.42 g，KH?PO?0.27 g;MHB培養(yǎng)基（1L）：24 g MHB混合粉末（由北京索萊寶科技有限公司提供）;LB固體培養(yǎng)基（1L）需在LB液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂后高溫高壓滅菌，在培養(yǎng)基溫熱時倒入無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后備用，以上液體培養(yǎng)基均經(jīng)過高溫高壓滅菌。

1.2試驗主要儀器

超低溫冰箱（-80℃）、普通冰箱、超凈工作臺、恒溫振蕩搖床（37℃）、恒溫培養(yǎng)箱（37℃）、紫外可見分光光度計、掃描儀、通風櫥、SDS-PAGE電泳儀、凝膠成像儀、振蕩渦旋儀、加熱制冷型金屬浴連接儀、高速離心機、垂直搖床和水平搖床等。

1.3試驗方法

1.3.1 BW25113-pCA24N（wcaB）過表達菌株的構(gòu)建質(zhì)粒pCA24N（wcaB）的獲取：在本實驗室-80℃超低溫冰箱保藏的ASKA文庫中選取AG1-pCA24N（wcaB）菌株，劃線于含有氯霉素（35μg·mL1）抗性的固體平板上過夜培養(yǎng)，次日挑取單克隆于含有氯霉素（35μg·mL1）的新鮮液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩搖床中過夜培養(yǎng)12～16 h，并同時用已合成的上下游引物pCA24N-F（5'-ATACGGATCCGGCCCTGA-3'）和pCA24N-R（5'-GCTGCAGGTCGACCCTTA-3'）進行菌落PCR，將PCR獲得的產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳分離后觀察wcaB基因長度是否正確，將PCR結(jié)果中長度正確的菌株送往生物公司進行測序，測序結(jié)果與NCBI上E.coli K-12菌株的wcaB基因進行比對。挑取測序成功的單克隆菌株過夜培養(yǎng)后用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取質(zhì)粒，用制備好的野生型大腸桿菌BW25113感受態(tài)利用化學轉(zhuǎn)化法進行轉(zhuǎn)化。

過表達菌株BW25113-pCA24N（wcaB）的構(gòu)建：野生型大腸桿菌BW25113感受態(tài)細胞中加入1μL質(zhì)粒pCA24N（wcaB）或者空質(zhì)粒pCA24N，混勻后在冰上靜置30 min，在預(yù)熱完全的42℃金屬浴中熱激90 s，再放置冰上靜置2 min，靜置后加入1 mL LB培養(yǎng)基于37℃恒溫振蕩搖床中復(fù)蘇細胞1 h。復(fù)蘇后的菌液涂布在含有氯霉素（35μg·mL1）抗性的固體平板上，過夜培養(yǎng)后挑取大腸桿菌BW25113中攜帶pCA24N（wcaB）的單克隆菌株，用引物pCA24N-F和pCA24N-R通過PCR將條帶長度正確的菌株送往生物公司進行測序驗證，挑取測序成功的單克隆過表達菌株過夜培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2考馬斯亮藍染色法驗證WcaB表達情況將保藏的BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N（wcaB）菌株接種于新鮮液體LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)12～16 h至平臺期后，以1：100的接菌比例轉(zhuǎn)接至含有35μgmL1氯霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫搖床中以220 rmin-1、37℃培養(yǎng)至OD?oo≈0.5后，加入終濃度為1 mmol-L?1IPTG進行誘導(dǎo)，繼續(xù)在恒溫搖床中培養(yǎng)0.5 h，使菌株養(yǎng)至OD?o?≈0.8。取用IPTG（1 mmol-L1）誘導(dǎo)后的菌液800μL于干凈的1.5 mL EP管中，用13000 r·min1離心2 min，徹底去除上清中的培養(yǎng)基，在通風櫥中向菌體沉淀加入40μL的10%SDS溶液和40μL的6×loading buffer，用移液槍充分混合均勻，將初步制備的蛋白樣品放置于99.9℃的金屬浴上煮沸15 min。通過上述步驟將獲得的蛋白樣品用15%的SDS-PAGE凝膠進行電泳分離蛋白質(zhì)，電泳液為1×SDS電泳緩沖液。待電泳結(jié)束后，將膠切下后用固定液固定蛋白質(zhì)1 h，而后將膠轉(zhuǎn)移至考馬斯亮藍R250染色1 h，最后用洗脫液將深藍色的蛋白膠洗至有清晰的蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)。

1.3.3 WcaB過表達菌株進行抗生素敏感性測試將保藏的BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N（wcaB）菌株預(yù)先活化。將活化好的菌液1：100轉(zhuǎn)接至含35μg·mL1氯霉素抗性的新鮮液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫搖床中以220 r·min-1、37℃培養(yǎng)至OD6o?～0.5時加入終濃度為1 mmol-L?1的IPTG進行誘導(dǎo)，繼續(xù)放置在恒溫搖床中培養(yǎng)0.5 h，使菌株養(yǎng)至OD?o?≈0.8。取誘導(dǎo)后的菌液100μL于干凈的1.5mL EP管中，13000 r·min1離心2 min，去上清，加入等體積100μL的0.01 mol-L1PBS緩沖液重懸菌體，將其作為未處理組的對照樣品備用。另取1 mL誘導(dǎo)至OD?00≈0.8的菌液于無菌玻璃搖菌管中，分別加入慶大霉素（終濃度為5μg mL1）、卡那霉素（終濃度為10μg·mL1）處理，繼續(xù)置于搖床中培養(yǎng)，分別在0.5、1、1.5、2 h時取100μL處理過的樣品于EP管中，離心去上清，用等體積100μL的0.01 mol-L1PBS緩沖液重懸菌體，將其作為實驗組試驗樣品，將以上試驗樣品用PBS緩沖液按照10倍濃度梯度稀釋法稀釋后進行細胞存活率點板，平板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)12 h，次日觀察細菌存活情況，根據(jù)菌落計數(shù)，計算存活率。取3次平行試驗的結(jié)果進行顯著性分析。

1.3.4 WcaB過表達菌株最小抑菌濃度（MIC）測試將活化好的BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N（wcaB）菌株按1：100轉(zhuǎn)接至含氯霉素的液體MHB培養(yǎng)基中，置于搖床中培養(yǎng)至OD600～0.5時加入濃度為1 mmol-L1的IPTG，繼續(xù)放置于搖床中誘導(dǎo)至OD?00～0.8。將抗生素用2倍稀釋法在MHB培養(yǎng)基中稀釋成相應(yīng)濃度（0、0.5、1、2、4、8、16、32、64μgmL1），在無菌96孔板上按照濃度梯度順序每孔加入200μL抗生素稀釋液，將誘導(dǎo)后的菌液稀釋5倍后，每個孔中加入2μL稀釋后的菌液即每孔菌量約為10?～10?CFU·mL-1，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。取出96孔板，用槍頭輕輕吹打混勻菌液，在肉眼條件下對光觀察，清澄透光的孔對應(yīng)的最低抗生素濃度為該菌體外培養(yǎng)的最低抑菌濃度（MIC）。

1.3.5 WcaB過表達菌株的生長曲線測定將活化好的BW25113-pCA24N（emp）、BW25113-pCA24N（wcaB）菌株按1：100轉(zhuǎn)接至含氯霉素的LB培養(yǎng)基中，置于搖床中連續(xù)培養(yǎng)10h，培養(yǎng)前期每隔1h取1 mL菌液在紫外可見光分光光度計（OD?00）中測量細菌密度，培養(yǎng)后期是2 h取一次樣品，每組樣品做3次生物學平行試驗。

2結(jié)果與分析

2.1 WcaB過表達菌株的測序驗證

由圖1可知，從ASKA庫中經(jīng)過菌落PCR驗證過表達菌株的基因長度正確。由圖2可知，構(gòu)建的WcaB過表達菌株中的目的片段wcaB基因測序結(jié)果與NCBI上大腸桿菌K-12菌株wcaB基因一致。由圖3可知，考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示BW 25113-pCA24N（wcaB）能夠表達目的蛋白WcaB。綜上結(jié)果表明WcaB過表達菌株可以成功表達。

2.2大腸桿菌過表達WcaB對氨基糖苷類抗生素的殺傷效果測試

2.2.1慶大霉素處理下BW25113-pCA24N（emp）、BW25113-pCA24N（wcaB）表型結(jié)果由圖4可知，BW25113-pCA24N（emp）、BW25113-pCA24N（wcaB）經(jīng)濃度為5μg·mL1的慶大霉素處理0、0.5、1、1.5、2 h后細胞存活數(shù)的情況。結(jié)果顯示：在沒有慶大霉素處理情況下，WcaB過表達株的細胞存活數(shù)與BW25113-pCA24N空質(zhì)粒株的生長情況是沒有差異的。然而，經(jīng)過5μg·mL1的慶大霉素處理0.5 h后，WcaB過表達株細胞存活數(shù)少，與空質(zhì)粒株相比有4個數(shù)量級的顯著差異；處理1 h后，WcaB過表達株的細胞存活數(shù)較0.5h處理時又少了十倍，其細胞存活數(shù)比空質(zhì)粒株少5個數(shù)量級；而處理1.5h和2 h后，WcaB過表達株的細胞存活數(shù)比空質(zhì)粒株少3個數(shù)量級。這些結(jié)果證明，過表達WcaB可以顯著增強大腸桿菌對慶大霉素的敏感性。

2.2.2卡那霉素處理下BW25113-pCA24N（emp）、BW25113-pCA24N（wcaB）表型結(jié)果由圖5可知，BW25113-pCA24N（emp）、BW25113-pCA24N（wcaB）經(jīng)濃度為10μg mL?1的卡那霉素處理0、0.5、1、1.5、2 h后細胞存活數(shù)的情況。結(jié)果顯示：在沒有卡那霉素的處理條件下，WcaB過表達株的細胞存活數(shù)與BW25113-pCA24N空質(zhì)粒株的生長情況是沒有差異。在10μg·mL1的卡那霉素處理0.5h后，WcaB過表達株的細胞存活數(shù)與空質(zhì)粒株相比有3個數(shù)量級的差異；處理1 h和1.5 h后，WcaB過表達株的細胞存活數(shù)較少，比空質(zhì)粒株少5個數(shù)量級；而處理2 h后，WcaB過表達株的細胞存活數(shù)比空質(zhì)粒株少4個數(shù)量級。這些結(jié)果證明，過表達WcaB可以明顯增強大腸桿菌對卡那霉素的敏感性。

2.3 WcaB過表達菌株MIC（最小抑菌濃度）的測定

由圖6可知，在慶大霉素處理條件下BW25113-pCA24N（emp）的MIC為1μgmL1，BW25113-pCA24N（wcaB）的MIC為0.5μg·mL-1，表明WcaB過表達菌株增強了大腸桿菌對慶大霉素的敏感性。在卡那霉素處理條件下BW25113-pCA24N、BW-25113-pCA24N（wcaB）的MIC都為2μgmL1，表明WcaB過表達菌株增強了大腸桿菌對卡那霉素的敏感性。

2.4 WcaB過表達菌株的生長曲線測定

由圖7可知，WcaB過表達株在生長了4h后基本停止生長，而空質(zhì)粒株在生長6h后才基本進入平臺期。結(jié)果表明，WcaB過表達后會抑制細菌生長，這可能導(dǎo)致了WcaB過表達株對慶大霉素更敏感。

3討論與結(jié)論

自抗生素被研究者發(fā)現(xiàn)至今，抗生素在治療人類疾病或畜禽生物疾病中都占據(jù)了重要地位。而在過去的幾十年里，世界各地的牲畜飼料中都添加了抗生素以預(yù)防疾病，為了避免抗微生物藥物耐藥性在農(nóng)業(yè)場所內(nèi)或通過動植物源性食品向人類傳播[16，因此盡早找到新的藥物靶點是目前研究方向的重點之一。

本研究通過抗生素敏感性測試發(fā)現(xiàn)WcaB過表達后能提高大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素的敏感性，通過MIC實驗測定了WcaB過表達后MIC并未升高，反而對慶大霉素的MIC與對照組相比有下降，表明WcaB過表達菌株增強了大腸桿菌對慶大霉素的敏感性；通過生長曲線測定發(fā)現(xiàn)WcaB過表達后會抑制細菌生長，表明WcaB過表達株可能通過抑制細菌生長進而提高大腸桿菌對氨基糖類抗生素的敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)在37℃富含氧氣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞時，wcaB基因不表達[17，這表明在自然環(huán)境下，WcaB不表達可能會導(dǎo)致大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素在較短時間內(nèi)沒有顯著的殺菌效果。大腸桿菌過表達基因在解決抗生素耐藥方面也有相關(guān)研究，如PurB過表達能增強大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素的耐受性18，外膜蛋白ompC過表達會提高大腸桿菌對慶大霉素的敏感性[191，這些研究的新發(fā)現(xiàn)都有望成為解決抗生素耐藥的新靶點。結(jié)合本試驗研究結(jié)果，認為WcaB可以作為藥物靶點之一去激活其表達后輔助抗生素殺菌，進而減少大腸桿菌對抗生素產(chǎn)生耐藥，但其是如何提高大腸桿菌對氨基糖苷類抗生素敏感性的機制需要下一步的深入研究。

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（責任編輯：柯文輝）