基于網絡藥理學與分子對接探究“茵陳-玉竹”藥對治療糖尿病腎病的機制

［摘要］目的：利用網絡藥理學和分子對接技術分析“茵陳-玉竹”藥對治療糖尿病腎病的機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫及分析平臺（TCMSP）、中醫藥百科全書（ETCM）、中醫藥分子機制生物信息學注釋數據庫（BATMAN-TCM）檢索“茵陳-玉竹”藥對的主要化學成分，通過藥物靶點數據庫（TTD）、人類在線孟德爾遺傳（OMIM）數據庫、DisGeNET、GeneCards等數據庫收集糖尿病腎病的疾病靶點，進而篩選茵陳、玉竹與糖尿病腎病的交集核心靶點。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“化合物-靶點-疾病網絡”，同時基于DAVID數據庫對靶點進行GO功能富集和KEGG通路富集分析。結果：獲取“茵陳-玉竹”藥對主要活性成分31個，作用靶點351個，糖尿病腎病相關基因2 911個，交集基因185個，其中起關鍵作用的活性成分為槲皮素、濱蒿內酯、莨菪亭、D-香芹酮和異鼠李素；構建可視化PPI網絡得到185個節點，851條邊，平均度值9.2，獲得前列腺素內過氧化物酶2（PTGS2）、核因子κB1（NFKB1）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、MAPK3、MAPK14等“茵陳-玉竹”藥對治療糖尿病腎病的關鍵靶點。GO富集分析獲得1 181條相關通路，KEGG通路富集獲得180條信號通路。結論：“茵陳-玉竹”藥對可能通過調控磷脂酰肌醇3激酶-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）、MAPK、糖基化終末產物-糖基化終產物受體（AGE-RAGE）等信號通路，抑制各種炎癥反應與氧化應激，調節異常代謝，從而對糖尿病腎病產生治療作用。

［關鍵詞］茵陳；玉竹；糖尿病腎病；網絡藥理學；信號通路；靶點；機制；分子對接

［中圖分類號］R285.5；R587.2［文獻標志碼］A［文章編號］1671-7783（2024）06-0485-05

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230273

［引用格式］方雨陽，李靖，趙鑫雨，等. 基于網絡藥理學與分子對接探究“茵陳-玉竹”藥對治療糖尿病腎病的機制［J］. 江蘇大學學報（醫學版），2024，34（6）： 485-489，506.

［基金項目］2018年首都衛生發展科研專項（首發2018-1-4192）

［作者簡介］方雨陽（2000—），男，碩士研究生，主要從事腎病內分泌研究；李靖（通訊作者），主任醫師，博士生導師，E-mail： Natashalee@163.com

糖尿病腎病是糖尿病中最常見的微血管并發癥，以蛋白尿和腎功能進行性下降為主要特征，其發病機制與糖代謝紊亂、腎臟血流動力學異常、脂代謝紊亂以及氧化應激相關，多發展為終末期腎病^［1］。目前，糖尿病相關的慢性腎臟疾病已經比腎小球腎炎相關的慢性腎臟疾病更為常見^［2］，一項基于中國社區糖尿病人群的臨床特征研究表明，至少有21%的糖尿病患者出現慢性腎臟疾病^［3］。雖然有眾多治療方案可供醫生選擇，但目前現代醫學尚未發現能夠阻斷糖尿病腎病進展的有效方式。

中醫藥防治糖尿病腎病具有獨特優勢。國醫大師呂仁和教授稱糖尿病腎病為消渴病腎病，其基本病機為消渴病日久，傷陰耗氣，復加以熱毒、痰濕、郁、瘀等而形成“微型癥瘕”損傷腎絡，故以益氣養陰、散結消癥為基本治法^［4］。通過數據挖掘分析呂仁和教授治療糖尿病腎病的經驗^［5］，發現“茵陳-玉竹”為常用的治療糖尿病腎病的藥對，臨床治療效果良好。本研究探討“茵陳-玉竹”藥對治療糖尿病腎病的藥效物質基礎及作用機制，為其臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 篩選“茵陳-玉竹”藥對活性成分

檢索中藥系統藥理學數據庫及分析平臺（TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）^［6］、中醫藥百科全書（ETCM）（http：//www.tcmip.cn/ETCM2/front/#/）、中醫藥分子機制生物信息學注釋數據庫（BATMAN-TCM）（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php/），獲取“茵陳-玉竹”藥對的化學成分。利用Swiss Target Prediction平臺（http：//www.swisstargetprediction.ch/）^［7］預測上述化學成分的潛在作用靶點，篩選出置信度≥0.1的靶點。

1.2 篩選糖尿病腎病疾病靶點

檢索藥物靶點數據庫（TTD）（http：//db.idrblab.net/ttd/）、人類在線孟德爾遺傳（OMIM）數據庫（https：//omim.org/）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/）和DrugBank數據庫（https：//go.drugbank.com/），檢索詞為“diabetic nephropathy”和“diabetic kidney disease”，合并后刪除重復條目，獲得糖尿病腎病對應的靶點。

1.3 藥物-疾病交集靶點的篩選

將“茵陳-玉竹”藥對的靶點與糖尿病腎病的靶點導入在線韋恩圖制作軟件VENNY 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），獲得藥物-疾病交集基因靶點。

1.4 構建蛋白相互作用（PPI）網絡及篩選關鍵靶點

將獲得的“藥物-疾病”共同靶點使用String數據庫（https：//cn.string-db.org/）進行分析。選擇最小相互作用閾值為“highest confidence（0.9）”，同時設定隱藏網絡中的無關節點，得到PPI網絡，并進一步篩選關鍵靶點。

1.5 構建藥對-有效成分-靶點-疾病網絡

將篩選的靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“茵陳-玉竹”藥對的有效成分作用于糖尿病腎病相關靶點的網絡關系圖。

1.6 富集分析

利用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對關鍵靶點進行GO生物學過程與KEGG代謝通路富集分析。

1.7 分子對接

通過PubChem數據庫下載度值排名前五的化合物的3D結構文件，用PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）搜索度值排名前三的基因靶點的3D結構圖，篩選出年份最新、分辨率最高的結構文件，將文件導入AutoDock和PyMol軟件進行分子對接和可視化操作。

2 結果

2.1 “茵陳-玉竹”藥對有效成分與靶點篩選

篩選出31個“茵陳-玉竹”藥對的有效成分，主要為β-谷甾醇、茵陳黃酮、異鼠李素、槲皮素、鈴蘭苦苷、澤蘭素等，預測得到相對應的351個藥物靶點，主要為前列腺素內過氧化物酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、核因子κB1（NFKB1）、胱天蛋白酶3（CASP3）、IL-6等。

2.2 疾病相關靶點的收集

在TTD數據庫中檢索到22個相關疾病靶點，OMIM數據庫中檢索到794個相關疾病靶點，DrugBank數據庫中檢索到44個相關疾病靶點，DisGeNET數據庫中檢索到1 189個相關疾病靶點，GeneCards數據庫中檢索到2 125個相關疾病靶點，將5個數據庫的結果合并，去重之后得到2 911個與糖尿病腎病相關的疾病靶點。

2.3 PPI網絡構建

將糖尿病腎病靶點與“茵陳-玉竹”藥對靶點取交集，篩選得到185個交集靶點，導入String數據庫平臺，預測蛋白相互作用關系，構建PPI網絡。網絡內包含185個節點和851條相互作用連線，線條的粗細代表相互作用力的強弱，其中平均度值為9.2，平均介數為7.977 4×10^-2。靶點度值與介數均超過平均值的靶點共有10個，分別為PTGS2、MAPK1、MAPK3、NFKB1、CASP3、IL-6等。

2.4 構建藥對-有效成分-靶點-疾病網絡

應用Cytoscape 3.7.2軟件構建網絡圖，黃色菱形代表作用的基因靶點，藍色正八邊形代表藥物主要化合物成分，綠色箭頭代表信號通路，其中節點越大，代表其連接度越高（圖1）。網絡分析顯示，與靶點連接較多的活性成分主要有槲皮素、濱蒿內酯、莨菪亭、D-香芹酮、異鼠李素等。

2.5 富集分析

使用DAVID數據庫對“茵陳-玉竹”藥對治療糖尿病腎病的潛在靶點進行GO分析，共收集到1 181條相關通路，其中GO生物過程919條，主要涉及對RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄進行正向調節、信號轉導、基因表達的正向調節等；GO細胞組分91條，主要涉及細胞液、細胞核、質膜等；GO分子功能171條，主要涉及蛋白結合、相同的蛋白質結合、ATP結合等。KEGG分析共收集到180個信號通路，主要涉及糖尿病并發癥中的糖基化終末產物-糖基化終產物受體（AGE-RAGE）信號通路，內分泌抵抗，磷脂酰肌醇3激酶-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號傳導途徑等（圖2）。

2.6 分子對接驗證

將度值前五的化合物與度值前三的基因靶點進行分子對接，共得到15對受體-配體對接結果（圖3）。結合能越小，說明對接越穩定，當結合能小于-5.0 kJ/mol時，說明兩者具有良好的親和力。15對受體-配體對接結果中有14對的結合能小于-5.0 kJ/mol。其中3個靶點最穩定的對接分別是：PTGS2與異鼠李素，結合能為-9.3 kJ/mol；NFKB1與異鼠李素，結合能為-7.0 kJ/mol；MAPK1與槲皮素，結合能為-7.5 kJ/mol（圖4）。

3 討論

“茵陳-玉竹”藥對是呂仁和教授基于糖尿病腎病“微型癥瘕”、糖尿病“從肝論治”和腎病“從風論治”的理論基礎而來。糖尿病的基本病機為熱傷氣陰，在熱、虛、瘀的病理狀態與風邪的作用下，在腎之脈絡可產生微型癥瘕，濕熱濁毒瘀滯，繼而損傷腎元，發為消渴病腎病。玉竹有甘寒清熱，柔潤熄風之功效，又可養肺胃之陰而除燥熱，消除患者饑餓之感。在傳統的以上中下三焦論治消渴病以外，肝臟在消渴發病中亦有重要作用，消渴病患者平素飲食失調，脾胃受損，水濕內蘊，濕邪化熱導致肝膽郁熱；同時，由于生活壓力大導致肝郁氣滯的情況較為多見，氣機升降失調，氣隨血行，氣郁化火，累及肝陰，肝腎同源，肝陰不足也可累及腎陰。呂仁和教授認為現代消渴病本質不離肝臟，茵陳一藥“可掃肝臟”，而肝的疏泄等生理功能若得以恢復，則“濕熱可除，癥瘕可散，內風可滅”，故形成了“茵陳-玉竹”藥對治療糖尿病腎病，兩藥配伍可相互促進，相輔相成，對治療糖尿病腎病有良好的臨床療效^［8-9］。

基于藥對-有效成分-靶點-疾病網絡圖，“茵陳-玉竹”藥對的關鍵化合物為槲皮素、濱蒿內酯、莨菪亭、D-香芹酮和異鼠李素。槲皮素具有抗炎、抗氧化、降糖、降壓等作用，研究表明其通過抑制半乳糖苷酶基因表達，激活硫氧化蛋白的表達，降低高血糖介導的人胚胎腎細胞的衰老標志物，也通過降低轉化生長因子-β1（TGF-β1）的表達水平抑制高血糖介導的腎小球系膜細胞增殖，對腎臟起保護作用^［10］。濱蒿內酯可以抑制高血糖環境中的細胞外調節蛋白激酶1/2（ERK1/2）信號通路的激活，抑制細胞內活性氧的產生以及NADPH氧化酶2（NOX2）與NOX4的表達，是治療糖尿病腎病的潛在藥物^［11］。莨菪亭能通過抑制腎小球系膜細胞增殖，從而抑制細胞外基質的增殖，降低關鍵纖維化因子TGF-β與結締組織生長因子的表達，抑制腎小球的硬化^［12］。已證實D-香芹酮具有抗炎、抗氧化應激的作用^［13］，而糖尿病腎病與氧化應激有著密切關系。異鼠李素則可從消化和腸道吸收階段促進碳水化合物的代謝，改善肝臟與肌肉對葡萄糖的攝取，保護胰島β細胞并減輕胰島素分泌障礙^［14］。

網絡圖顯示PTGS2、NFKB1、MAPK1、MAPK3和MAPK14等是“茵陳-玉竹”藥對治療糖尿病腎病的關鍵靶點。研究表明^［15］，高血糖增加線粒體活性氧的生成，導致NF-κB的活化，誘導PTSG2 mRNA的表達。NFKB1參與炎癥反應與氧化應激，增加糖尿病血脂異常的風險，并能導致糖尿病相關并發癥的發展。MAPK是一組進化保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可經細胞外的刺激信號激活，并從細胞膜向細胞核傳導信號，這些信號通路調控增殖、分化等細胞活動和炎癥、凋亡、癌化等生理活動，MAPK1、MAPK3、MAPK14均為其家族的重要成員。研究表明在高糖培養基下，人糖尿病腎病活檢樣本中的MAPK1與MAPK3快速磷酸化，從而抑制Ras GTP酶激活含IQ基元GTP酶激活蛋白1（IQGAP1）的活性，導致足細胞的損傷，進而促進糖尿病腎病的發展^［16］。

GO富集分析結果顯示，“茵陳-玉竹”藥對主要通過對RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄進行正向調節等生物過程，影響細胞液、細胞核等生物組分以及蛋白結合、ATP結合等分子功能。KEGG通路富集分析結果顯示，核心通路為PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗途徑等，提示“茵陳-玉竹”藥對可能通過上述信號通路調控糖尿病腎病的疾病進程。糖尿病等多種疾病均可發生PI3K-Akt信號通路失調。PI3K在細胞膜上催化形成三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3充當第二信使激活Akt，Akt則可以通過磷酸化參與細胞代謝、蛋白質合成來控制關鍵的細胞過程。研究表明抑制細胞中PI3K-Akt的信號傳導，可以減輕糖尿病腎病進程中的腎臟損傷^［17-18］。MAPK信號通路是在受體酪氨酸激酶下游的另一條重要通路，通過阻止MAPK信號通路的激活，能有效降低腫瘤壞死因子、IL-6和NF-κB的表達，從而抑制炎癥反應，也能增加Bcl-2的表達、減少Bax和半胱天冬酶-3來抑制細胞凋亡，進而改善糖尿病腎病帶來的腎損傷^［19］。AGEs與RAGE主要通過激活NF-κB，刺激產生血管內皮生長因子和TGF-β1，誘導單核細胞趨化蛋白-1的表達，激活腎素-血管緊張素系統，通過激活NOX引發氧化應激等機制，促進糖尿病腎病的發生及進展^［20］。

綜上所述，“茵陳-玉竹”藥對可以通過多成分、多靶點、多通路抑制各種炎癥反應與氧化應激，調節異常代謝，發揮對糖尿病腎病的治療作用，為“茵陳-玉竹”藥對臨床防治糖尿病腎病提供理論依據。由于網絡藥理學與分子對接是基于計算機技術、數學模型以及生物信息學的方法，并沒有涉及藥代動力學等學科，仍存在一些問題亟待解決，如藥物配伍比例對治療效果的影響，藥物在體內的代謝途徑，后續可進行細胞或動物實驗，進一步了解“茵陳-玉竹”藥對治療糖尿病腎病的作用機制。

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［收稿日期］2023-12-11［編輯］郭 欣