鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯暴露對斑馬魚胚胎的發育毒性及作用機制

［摘要］目的：研究鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯［di-（2-ethylhexyl） phthalate，DEHP］對斑馬魚胚胎發育的影響及潛在的分子機制。方法：將斑馬魚胚胎隨機分為5組，分別為空白對照組、二甲基亞砜組以及8、40、200 μg/L DEHP組，暴露至96 hpf，記錄死亡率、孵化率、畸形率、心率、體長和胚胎自主運動次數等發育指標；采用酶學分析檢測仔魚體內超氧化物歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽過氧化氫酶（GPx）活力及丙二醛含量；采用實時熒光定量PCR法測定細胞凋亡、葡萄糖轉運以及蛋白質、脂肪酸和糖原合成相關mRNA表達。結果：（1） 與對照組相比，8 μg/L DEHP組斑馬魚胚胎/仔魚死亡率顯著增加（P＜0.01），仔魚體長顯著降低（P＜0.05）；40、200 μg/L DEHP組斑馬魚胚胎/仔魚死亡率和畸形率顯著增加（P＜0.01），孵化率、心率、體長以及胚胎自主運動次數明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。（2） 與對照組相比，8 μg/L DEHP組斑馬魚仔魚體內GPx活力顯著降低（P＜0.05）；40、200 μg/L DEHP組斑馬魚仔魚體內SOD、GPx活力明顯降低且丙二醛含量顯著增加（P＜0.01）。（3） 與對照組相比，8 μg/L DEHP組葡萄糖轉運信號通路中Pi3k mRNA表達顯著上調（P＜0.01）；40、200 μg/L DEHP組凋亡信號通路中Bax/Bcl-2、Caspase-3和Ras mRNA表達顯著上調（P＜0.01），葡萄糖轉運信號通路中Akt和Pi3k mRNA表達顯著上調（P＜0.01），Erk1/2 mRNA表達顯著下調（P＜0.05或P＜0.01），蛋白質、脂肪酸和糖原合成信號通路中Mtor、Gsk-3α和Gsk-3β mRNA表達顯著上調（P＜0.05或P＜0.01）。結論：DEHP可能通過誘導細胞凋亡，改變代謝相關mRNA表達，造成氧化損傷，從而影響斑馬魚胚胎的生長發育，產生發育毒性。

［關鍵詞］鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯；斑馬魚胚胎；發育毒性；分子機制

［中圖分類號］R994［文獻標志碼］A［文章編號］1671-7783（2024）06-0507-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230024

［引用格式］錢顯，馮偉偉，茆廣華，等. 鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯暴露對斑馬魚胚胎的發育毒性及作用機制［J］. 江蘇大學學報（醫學版），2024，34（6）：507-513，521.

［基金項目］國家自然科學基金面上項目（21976072）

［作者簡介］錢顯（1997—），男，碩士研究生；吳向陽（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail： wuxy@ujs.edu.cn

Developmental toxicity and molecular mechanism of

Di-（2-ethylhexyl） phthalate exposure on zebrafish embryos

QIAN Xian¹， FENG Weiwei¹， MAO Guanghua¹， CHEN Yao¹，

LUO Mengna¹， WU Chaoqiong¹， YANG Liuqing²， WU Xiangyang¹

（1. School of Environment and Safety Engineering， 2. School of Chemistry and Chemical Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013， China）

［Abstract］Objective：To study the effects of di-（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP） on embryonic development of zebrafish and its potential molecular mechanism. Methods：Zebrafish embryos were randomly divided into 5 groups： blank control group， dimethyl sulfoxide group， and 8， 40， 200 μg/L DEHP groups， which were exposed to 96 hours post-fertilization （hpf）. The mortality rate， hatching rate， malformation rate， heart rate， body length and the number of spontaneous movements of embryos were recorded. The activity of superoxide dismutase （SOD）， glutathione catalase （GPx） and malondialdehyde （MDA） content in larvae were measured by enzymatic analysis. Real-time quantitative PCR was used to determine the expression of mRNA related to cell apoptosis， glucose transport， and the synthesis of proteins， fatty acids， and glycogen. Results：（1） Compared with the control group， the embryo/larvae mortality of zebrafish in 8 μg/L DEHP group was significantly increased （P＜0.01）， and the larvae body length was greatly decreased （P＜0.05）; in 40 and 200 μg/L DEHP groups， the mortality and malformation rate of zebrafish embryo/larvae were significantly increased （P＜0.01）， and the hatching rate， heart rate， body length and the number of embryonic autonomous movement were greatly decreased （P＜0.05 or P＜0.01）. （2） Compared with the control group， the activity of GPx in zebrafish larvae in 8 μg/L DEHP group was significantly decreased （P＜0.05）; the activities of SOD and GPx in zebrafish larvae were significantly decreased and the content of MDA was greatly increased in 40 and 200 μg/L DEHP groups （P＜0.01）. （3） Compared with the control group， the expression of Pi3k mRNA in glucose transport signaling pathway in 8 μg/L DEHP group was significantly up-regulated （P＜0.01）; the mRNA expressions of Bax/Bcl-2， Caspase-3 and Ras were greatly up-regulated （P＜0.01）， and the mRNA expressions of Akt and Pi3k in glucose transport signaling pathway were significantly up-regulated （P＜0.01）， the mRNA expression of Erk1/2 was greatly down-regulated （P＜0.05 or P＜0.01）， and the mRNA expressions of Mtor， Gsk-3 and GSK-3β in protein， fatty acid and glycogen synthesis signaling pathways were significantly up-regulated （P＜0.05 or P＜0.01） in 40 and 200 μg/L DEHP groups. Conclusion：DEHP may induce apoptosis， disrupt the expression of metabolism-related mRNA， cause oxidative damage， and thus affect the growth and development of zebrafish embryos， resulting in developmental toxicity.

［Key words］di-（2-ethylhexyl） phthalate; zebrafish embryo; developmental toxicity; mechanism of toxicity

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid ester，PAE）是全球使用最為廣泛的增塑劑，年產量已超600萬噸，廣泛應用于玩具、食品包裝材料和醫療器材等多種產品中^［1］。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯［di-（2-ethylhexyl） phthalate，DEHP］因其可提高塑料產品的延展性、可塑性和耐寒耐熱強度，已成為使用量最大、應用最廣泛的PAE，其產量約占PAE總產量近一半^［2］。由于DEHP是以非共價鍵結合在塑料制品中，因而在其生產、加工和使用過程中極易從產品中浸出，目前已在多種環境介質如大氣、水、土壤和生物體中檢出，并可通過飲用水、食物、呼吸和皮膚接觸等途徑進入人體且長期保持穩定，危害機體健康^［3-4］。

作為一種典型的環境內分泌干擾物，DEHP已被世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）列為2B類致癌物，相關研究已證實其具有神經毒性、生殖毒性、免疫毒性、細胞毒性和內分泌與代謝毒性等^［5-9］。目前，關于DEHP對水生生物的毒性效應尚不清楚。因此，本研究以斑馬魚胚胎為研究對象，通過檢測發育相關指標、酶學指標等探究DEHP暴露對斑馬魚胚胎的發育影響，并通過對凋亡、葡萄糖轉運、蛋白質、脂肪酸和糖原合成相關信號通路中mRNA表達的檢測，探討DEHP暴露對發育期生物的毒性作用及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 DEHP標準品（純度≥99.8%）購于美國Sigma公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）ELISA試劑盒購于合肥博美生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司；RNA提取試劑盒購于日本TaKaRa公司；反轉錄試劑盒和PCR擴增預混反應液購于美國Bio-Rad公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計提供；其他分析純試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器 體式熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；超低溫冰箱（日本Panasonic公司）；電子天平（德國Sartorius公司）；超微量分光光度計（美國Thermo公司）；實時熒光定量PCR系統（瑞士Roche公司）。

1.2 溶液制備

1.2.1 胚胎培養液制備 稱取1.0 g NaCl，0.03 g KCl，0.03 g CaCl²和0.16 g MgSO⁴·7H²O置于燒杯中，用適量超純水溶解并定容至1 L，滴加適量1 mol/L NaOH調整pH為7.0～7.2。

1.2.2 DEHP溶液制備 稱取適量DEHP固體粉末并用二甲基亞砜助溶，配制成1 mg/L儲備液于4 ℃避光保存，實驗前加胚胎培養液稀釋使用。

1.3 親魚飼養與魚卵采集

野生型AB系斑馬魚（Danio rerio），購于國家斑馬魚資源中心（武漢）。飼養用的脫氯水在使用前用海鹽調節電導率至500～530 μS/cm，養殖用水溫度設定為（27±0.5）℃，pH為7.0～7.6，溶解氧為7.0～7.4 mg/L，水硬度為（132.6～140.2）mg/L，光照周期14 h∶10 h。每天喂食2次豐年蝦卵。實驗前一天傍晚將3條雌魚和3條雄魚放入產卵盒中，中間用隔板將雌雄魚分開，放入光照培養箱中過夜。次日早晨將隔板抽出，打開光照讓雌雄親魚自行交配30 min，收集產下的受精卵，去除異常卵后轉移至胚胎培養液中用于后續暴露實驗。

1.4 斑馬魚胚胎發育毒性實驗及分組

將“1.3”收集到的胚胎隨機分為5組，分別為空白對照組（無任何試劑）、二甲基亞砜組以及8、40、200 μg/L DEHP組，二甲基亞砜組和各DEHP劑量組中二甲基亞砜含量均為0.05%（V/V）；分配至玻璃培養皿中，暴露至受精后96 h（hours post fertilization，hpf），每天更換一半的暴露液。

每隔24 h在體式顯微鏡下觀察胚胎和孵化后仔魚的死亡、孵化和畸形情況，觀察至96 hpf。從每組隨機挑選10枚胚胎，在24 hpf時，記錄1 min內胚胎自主運動次數；在72 hpf時，在顯微鏡下觀察胚胎/仔魚1 min內心跳次數；在96 hpf時，在顯微鏡下測量仔魚體長（不包括尾鰭）。

1.5 酶活性測定

胚胎/仔魚暴露至96 hpf后，收集并加入PBS制成10%組織勻漿，于4 ℃以8 000×g離心5 min，取上清液至預冷離心管中。按照試劑盒說明書檢測仔魚體內SOD活力、GPx活力及丙二醛含量。GPx檢測采用ELISA法，SOD和MDA檢測采用比色法。

1.6 qRT-PCR法測定相關mRNA表達

胚胎/仔魚暴露至96 hpf后，每組隨機選擇30條仔魚，根據RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，采用超微量分光光度計（Nanodrop 2000）測定總RNA濃度，根據逆轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA，隨后以cDNA為模板，斑馬魚Gapdh基因為內參基因，根據PCR擴增預混反應液說明書行PCR，反應體系為20 μL，包括2 μL cDNA模板和2 μL上、下游混合引物；反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火衍生20 s，共50個循環；熔融曲線反應條件設置：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。相關基因表達水平用2^-ΔΔCt法進行計算處理，檢測凋亡信號通路中Bax/Bcl-2、Caspase-3和Ras mRNA相對表達，葡萄糖轉運信號通路中Glut4、Akt、Pi3k和Erk1/2 mRNA相對表達，蛋白質、脂肪酸和糖原合成信號通路中Mtor、Gsk-3α和Gsk-3β mRNA相對表達。

PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計，Gapdh、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Ras、Glut4、Akt、Pi3k、Erk1/2、Mtor、Gsk-3α和Gsk-3β引物設計如表1所示。

1.7 數據分析

實驗數據采用SPSS 22.0（SPSS Inc.，Chicago）軟件進行分析。計量數據用均值±標準差（x±s）表示，在檢驗數據的正態性和方差齊性后，采用單因素方差分析和Tukey檢驗比較分析各暴露組與對照組之間的差異性，Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DEHP對胚胎/仔魚發育指標的影響

如圖1A所示，與空白對照組相比，8、40、200 μg/L DEHP組胚胎/仔魚死亡率均顯著升高（P均＜0.01）。由此可見，DEHP暴露可顯著增加斑馬魚死亡率。

如圖1B所示，與空白對照組相比，40、200 μg/L DEHP組孵化率顯著下降（P＜0.01）。由此可見，DEHP暴露可抑制斑馬魚胚胎孵化。

如圖1C所示，與空白對照組相比，40、200 μg/L DEHP組畸形率顯著增加（P＜0.01），胚胎/仔魚出現心包水腫、腦出血、脊柱彎曲等畸形形態。由此可見，DEHP暴露可致斑馬魚發育畸形。

如圖1D所示，與空白對照組相比，40、200 μg/L DEHP組中斑馬魚心率明顯降低（P＜0.01）。由此可見，DEHP暴露可損傷斑馬魚的心臟發育，導致心臟供血不足從而影響營養物質的輸送，進一步影響斑馬魚的發育。

如圖1E所示，與空白對照組相比，暴露至96 hpf時，DEHP各劑量組中仔魚平均體長均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），仔魚體長呈劑量依賴性降低，由此可見，DEHP暴露顯著影響仔魚的生長發育。

如圖1F所示，與空白對照組相比，8、40、200 μg/L DEHP組胚胎自動運動次數分別下降10.3%、27.6%（P＜0.05）和44.8%（P＜0.01），該結果與胚胎孵化結果一致。胚胎自主運動是影響胚胎孵化的元素之一^［10］，由此表明，DEHP可通過抑制胚胎的自主運動，從而影響胚胎的孵化及正常發育。

2.2 DEHP對氧化應激相關酶的影響

結果顯示，暴露至96 hpf時，與空白對照組相比，8 μg/L DEHP組SOD活力降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），40、200 μg/L DEHP組SOD活力明顯降低（P＜0.01，圖2A）；8、40、200 μg/L DEHP組仔魚體內GPx活力明顯降低（P＜0.05或P＜0.01，圖2B）；8 μg/L DEHP組丙二醛含量增加，但差異無統計學意義（P＞0.05），40、200 μg/L DEHP組仔魚體內丙二醛含量明顯增加（P＜0.01，圖2C）。由此可見，DEHP暴露可改變斑馬魚體內氧化應激相關的酶活力及丙二醛含量。

2.3 DEHP對細胞凋亡相關mRNA表達的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，8 μg/L DEHP組仔魚體內Bax/Bcl-2、Caspase-3和Ras mRNA相對表達量升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），40、200 μg/L DEHP組仔魚體內Bax/Bcl-2、Caspase-3和Ras mRNA相對表達量明顯升高（P均＜0.01）。由此可見，DEHP暴露可影響細胞凋亡相關mRNA的表達。

2.4 DEHP對葡萄糖轉運相關mRNA表達的影響

如圖4所示，與空白對照組相比，8、40 μg/L DEHP組仔魚體內Glut4 mRNA相對表達量增加，但差異無統計學意義（P＞0.05），200 μg/L DEHP組Glut4 mRNA相對表達量明顯增加（P＜0.01）；8 μg/L DEHP組Erk1/2 mRNA相對表達量降低，Akt mRNA相對表達量增加，但差異無統計學意義（P＞0.05），40、200 μg/L DEHP組Erk1/2 mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），Akt mRNA相對表達量顯著增加（P＜0.01）；8、40、200 μg/L DEHP組中Pi3k mRNA相對表達量顯著上調（P＜0.05或P＜0.01）。由此可見，DEHP暴露可影響葡萄糖轉運相關mRNA的表達。

2.5 DEHP對蛋白質、脂肪酸和糖原合成相關mRNA表達的影響

如圖5所示，與空白對照組相比，8 μg/L DEHP組仔魚體內Mtor、Gsk-3α和Gsk-3β mRNA相對表達量增加，但差異無統計學意義（P＞0.05），40、200 μg/L DEHP組Mtor、Gsk-3α和Gsk-3β mRNA相對表達量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。由此可見，DEHP暴露可影響蛋白質、脂肪酸和糖原合成相關mRNA的表達。

3 討論

斑馬魚與人類基因相似度高達87%，其胚胎發育過程與人類極為相似，因此斑馬魚胚胎發育毒性實驗被廣泛應用于評估外源性化學污染物的毒性效應^［11］。本研究結果顯示，斑馬魚胚胎暴露于DEHP后產生了多種發育和形態學變化：在暴露期間，胚胎孵化顯著延遲，死亡率和畸形率明顯增加；同時可觀察到心包水腫、腦出血、脊柱彎曲等畸形形態，其心率和胚胎自主運動次數也明顯下降，這可能是DEHP在體內積累致使心肌細胞損傷和肌肉發育不協調的結果。此外，DEHP暴露顯著縮短斑馬魚仔魚的體長。由此表明，DEHP在斑馬魚胚胎發育初期具有發育毒性。既往研究發現，斑馬魚胚胎暴露于同屬于PAE的鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）72 h后，畸形形態增加，死亡率升高，胚胎發育受到顯著抑制^［12］；潘欣穎等^［13］研究發現，鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）暴露可影響熱帶爪蛙胚胎的心肌細胞代謝活動，致心率下降，影響正常發育。本實驗結果與之類似，表明DEHP可通過影響斑馬魚胚胎發育相關指標對其胚胎的發育過程產生不利影響。

氧化應激是機體在發生損傷時的一種自發的保護機制，其發生可能會打破活性氧和抗氧化系統之間的平衡^［14］。抗氧化酶在細胞抗氧化應激中起重要作用，其中，SOD普遍存在于需氧生物的組織細胞中，可催化O^2-歧化成H₂O₂和O₂，H₂O₂可通過GSH-Px進一步清除^［15］。氧化應激發生時，大量氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸通過脂質過氧化反應生成丙二醛，丙二醛含量的高低可反映機體的損傷程度^［16］。本研究結果表明，DEHP暴露顯著降低斑馬魚體內SOD、GPx活力并增加丙二醛含量，可能是由于DEHP引起斑馬魚體內氧自由基的大量產生，隨著暴露時間延長，DEHP在斑馬魚體內累積并誘發氧化應激，從而導致抗氧化酶SOD和GPx活力下降；此外，過量的氧自由基又造成脂質過氧化物水平升高，對斑馬魚產生氧化損傷。肖杰鋒^［17］將斑馬魚暴露于DEHP中，可引起細胞凋亡和氧化應激，導致SOD活力下降，丙二醛含量上升；Feng等^［18］研究發現，DEHP暴露可導致小鼠體內SOD和GPx活力降低。本研究結果與上述研究類似，表明DEHP可誘導發育期斑馬魚發生氧化應激，從而影響斑馬魚胚胎的正常生長發育，產生發育毒性。

分布于線粒體外膜的Bcl-2家族蛋白通過調控膜通道開放以及凋亡物質外流，在細胞凋亡信號通路中起關鍵作用^［19］。當細胞受凋亡信號刺激后，抗凋亡蛋白Bcl-2對促凋亡蛋白Bax的抑制作用減弱^［20］，Bax蛋白經激酶激活，重新定位于線粒體表面，通過降低線粒體膜電位增加膜通透性，進而啟動凋亡程序，釋放凋亡因子^［21］。作為細胞凋亡的執行因子，Caspase-3的激活致膜通透性進一步增加，導致ATP釋放和K⁺外流；此外，Ras過度活化加速藥物作用誘發的凋亡，從而加劇細胞凋亡^［22］。本實驗結果顯示，負責編碼上述蛋白的mRNA均受到影響，具體表現為隨著DEHP暴露濃度增加，Bax mRNA相對表達量增加，Bcl-2 mRNA表達降低，Bax/Bcl-2比值升高從而致Caspase-3激活，誘發細胞凋亡從而導致細胞死亡，影響斑馬魚的正常發育。細胞對葡萄糖的攝入需要借助細胞膜上的葡萄糖轉運蛋白實現，GLUT4即參與該過程^［23］。作為MAPK家族成員，ERK1/2在機體生長發育過程中起著促進轉錄、生長、增殖和抗凋亡的作用^［24］。PI3K和Akt負責參與調控細胞的增殖和分化，Liu等^［25］研究發現，Pi3k和Akt mRNA表達升高可能與機體內發生異常增殖和凋亡有關。研究表明，暴露于DEHP的大鼠肝BRL細胞其體內PI3K和AKT蛋白表達水平升高^［26］。本實驗結果顯示，DEHP暴露后斑馬魚體內Glut4、Akt和Pi3k mRNA相對表達量升高，這可能與DEHP暴露導致斑馬魚損傷后引發的細胞異常增殖分化以及葡萄糖的異常轉運相關，而Erk1/2 mRNA相對表達量下降致斑馬魚抗凋亡能力降低，進一步影響斑馬魚正常的生長發育。

GSK-3α和GSK-3β是糖原和脂肪酸合成限速蛋白，其含量高低與糖原、脂肪酸合成密切相關^［27］；mTOR作為下游蛋白，在蛋白質合成、細胞生長和增殖中起重要作用^［28］。研究表明，細胞的自我修復過程會增加細胞的分裂與增殖，并增強細胞內糖原利用、脂質代謝和蛋白質合成的過程^［29］。本實驗中Mtor、Gsk-3α和Gsk-3β mRNA相對表達量隨DEHP暴露濃度的增加而增加，表明受DEHP刺激后，斑馬魚自發地通過增強蛋白質、脂肪酸和糖原的合成以此提高自身修復水平，從而抵抗DEHP暴露產生的不利影響。

綜上所述，在一定范圍內DEHP暴露可增加斑馬魚胚胎/仔魚的死亡率和畸形率，抑制其胚胎自主運動從而延緩其胚胎孵化，同時引起仔魚體內SOD和GPx活力下降及丙二醛含量增加，造成氧化損傷，產生發育毒性；其可能的作用機制如圖6所示，DEHP可能通過誘發氧化應激，致使細胞凋亡，改變凋亡、葡萄糖轉運、蛋白質、脂肪酸和糖原合成信號通路中相關mRNA的表達，影響斑馬魚的正常發育過程。

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［收稿日期］2023-01-13［編輯］劉星星