乙磺酸尼達尼布霧化吸入制劑的制備及評價

［摘要］目的：研究乙磺酸尼達尼布（nintedanib ethanesulfonate，NE）霧化吸入制劑的處方工藝，并對其進行體內外評價。方法：通過篩選抗氧劑、滲透壓調節劑、pH等確定其最優處方；測定NE霧化吸入制劑的霧化動態粒徑；通過液相色譜測定NE霧化吸入制劑的體內藥代動力學；以肺功能、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等為指標評價體內治療效果。結果：確定NE吸入溶液的最終處方為NE 10 mg，亞硫酸氫鈉4 mg，丙二醇50 mg，水2 mL，鹽酸調pH至4.0；NE霧化吸入制劑的平均粒徑約為3.3 μm；SD大鼠體內藥代動力學結果顯示，NE吸入溶液的體內消除半衰期為5.27 h，生物利用度顯著提高，達到63.71%；吸入制劑后肺纖維化模型小鼠肺功能各項參數（氣管收縮參數、50%潮氣量呼氣流量和呼吸速率等）及肺干/濕重比、HYP、TNF-α等指標均有顯著改善。結論：NE霧化吸入制劑可有效改善肺功能參數，提高其生物利用度。

［關鍵詞］乙磺酸尼達尼布；吸入制劑；霧化吸入；藥動學；特發性肺纖維化

［中圖分類號］R944［文獻標志碼］A［文章編號］1671-7783（2024）06-0536-06

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y240053

［引用格式］李其德，米翠蘭，徐樂圓，等. 乙磺酸尼達尼布霧化吸入制劑的制備及評價［J］. 江蘇大學學報（醫學版），2024，34（6）： 536-541.

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（82272662）

［作者簡介］李其德（1980—），男，碩士研究生；沈松（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail： shensong@ujs.edu.cn

Preparation and evaluation of nebulized inhalation preparation of nitanib ethanesulfonate

LI Qide¹， MI Cuilan²， XU Leyuan¹， ZHU Shun¹， ZHOU Zaijun¹， SHEN Song¹

（1. School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013; 2. Bishuilantian Community Health Service Center of Yinchuan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Yinchuan Ningxia 750010， China）

［Abstract］Objective：To study the optimized formulation of nidanib ethanesulfonate （NE） solution for inhalation and evaluate the formulation in vitro and in vivo. Methods：The prescription of NE solution was studied by optimizing the amount of the antioxidants， osmotic pressure regulators and pH value. The dynamic particle size of NE nebulized inhalation formulations was measured. The in vivo pharmacokinetics of NE nebulized inhalation formulations was determined by high performance liquid chromatography. Lung function， hydroxyproline （HYP）， tumor necrosis factor-α（TNF-α）， transforming growth factor-β1 （TGF-β1） were used as indicators to evaluate the therapeutic effect in vivo. Results：Optimized prescription was obtained： NE： 10 mg， sodium bisulfite： 4 mg， propylene glycol： 50 mg， water： 2 mL. The pH of the solution was adjusted to 4.0. The average particle size of NE nebulized inhalation was about 3.3 μm. The in vivo pharmacokinetic results in SD rats showed that the elimination half-life of NE inhalation preparation was 5.27 h. The bioavailability was significantly improved， reaching 63.71%. Pulmonary function parameters （tracheal contraction parameters， 50% tidal volume expiratory flow rate， respiratory rate） and lung dry/wet weight ratio， HYP， TNF-α in mice with pulmonary fibrosis model after inhalation administration had been significantly improved. Conclusion： NE inhalation can greatly improve lung function parameters and increase its bioavailability.

［Key words］nidanib ethanesulfonate; inhalation preparations; nebulized inhalation; pharmacokinetics; idiopathic pulmonary fibrosis

近年來，特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）患病率呈現上升趨勢，已成為世界性的健康問題^［1-2］。IPF是一種病因未明的慢性進展性纖維化型間質性肺炎，缺乏有效的治療藥物。乙磺酸尼達尼布（nintedanib ethanesulfonate，NE）是一種小分子藥物，抑制多種受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）和非-受體酪氨酸激酶（non-receptor tyrosine kinase，nRTKs）^［3-4］。NE可抑制以下幾種RTKs：血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）α和β，成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR）1-3，血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）1-3和Fms樣酪氨酸激酶3（Fms-like tyrosine kinase 3，FLT3），其中FGFR、PDGFR和VEGFR與IPF的發病機制相關^［5-8］。NE作為美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市的首個IPF靶向治療藥物，可以明顯延緩IPF疾病進展，為患者的治療提供了可能。但由于NE軟膠囊絕對生物利用度僅4.7%，肝臟首過效應和轉運子效應顯著，且肝臟胃腸道不良反應大^［9-11］；同時考慮到IPF患者需要長期服藥，口服膠囊的諸多不良反應限制了該藥品的適用范圍。

吸入液體制劑作為一種新型的給藥系統，通過霧化器產生連續供吸入用氣溶膠，其優點是靶向給藥，可直接把藥物遞送至肺部，相對全身不良反應比較少，且生物利用度高^［12-13］。此外，吸入液體制劑霧化時間短，患者耐受性好，順應性高。所以該給藥系統在解決NE吸入溶液存在的問題上具有明顯優勢。

本研究對NE霧化吸入溶液的處方工藝進行研究，確定最優的處方工藝。在體外對NE霧化吸入制劑的霧化粒徑等參數進行研究；同時，以NE注射劑為參比，對霧化吸入制劑的體內藥代動力學及藥效學進行研究，旨在為NE霧化吸入制劑的研究及開發提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（U3000，美國Thermo公司）；呼吸模擬機（BRS 100i，英國Copley Scientific公司）；實時高速噴霧粒度儀（Spraytec，英國Malvern公司）；霧化器（PARI LC Plus，德國Bari公司）；0.22 μm過濾器（美國Millipore公司）。

1.2 藥品和試劑

焦亞硫酸鈉（成都華邑藥用輔料制造有限公司）；甘油（湖南爾康制藥有限公司）；丙二醇（南京威爾化學有限公司）；博來霉素（碧云天生物技術有限公司）；NE、肺組織中羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）試劑盒（美國Sigma公司）；對硝基苯酚（≥99.0%）、乙腈、甲醇（國藥化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠12只，體重（150±20）g，SPF級ICR小鼠24只，體重2～22 g，購自江蘇大學實驗動物中心，合格證號：SYXK（蘇）2022-0081。大鼠自由進食和飲水，保證12 h/12 h明暗交替的飼養環境，維持相對濕度為40%～70%。本研究依照江蘇大學動物保護和使用委員會指南協議進行。

1.4 實驗方法

1.4.1 NE吸入溶液制備 采用除菌過濾的無菌工藝生產NE吸入溶液，生產過程包括膠塞清洗、滅菌、洗瓶、配制、除菌過濾、灌裝、軋蓋等。通過測定飽和溶解度、篩選pH、抗氧劑、滲透壓調節劑，確定本品的最終處方為NE 10 mg，亞硫酸氫鈉4 mg，丙二醇50 mg，水2 mL，鹽酸調pH至4.0。

1.4.2 NE含量測定方法 采用Thermo U3000高效液相色譜儀進行檢測，檢測器：VWD/DAD檢測器；色譜柱：Nucleodur C18 Gravity（4.0 mm×50 mm，5 μm）；流動相A：磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二銨1.0 g，加超純水1 000 mL溶解，用磷酸調節pH值至6.4）；流動相B：乙腈。線性梯度洗脫，流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣器溫度：5 ℃；檢測波長：235 nm。將樣品溶于溶劑（甲醇∶超純水=50∶50）后進樣。

1.4.3 NE液體制劑霧化動態粒徑測定 開啟真空泵，將流量計連接至L型連接管處，調節流量控制閥使通過系統的穩定流量達到15 L/min。取下流量計，取供試品1支，移取2 mL藥液至未使用的霧化器中，將吸嘴連接至L型連接管（使用吸嘴適配器來保證連接的氣密性）。開啟Spraytec實時高速噴霧粒度儀，背景出發時間為10 s。開啟霧化裝置，進行測定。

1.4.4 大鼠體內藥代動力學研究 將12只SD大鼠隨機分成2組，每組6只，禁食過夜。分別通過靜脈注射和霧化吸入給藥，給藥劑量為2.5 mg/kg。分別于0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、24 h取血，置于肝素鈉管中，5 000 r/min高速離心10 min，移取血漿于離心管中，-20 ℃冷凍保存備用，臨用前室溫融化。將80 μL血漿與80 μL內標對硝基苯酚乙腈溶液混合，然后渦旋混合30 s。混合后，將制劑在4 ℃以10 000×g離心5 min。將上清液通過0.22 μm過濾器，并將濾液注入HPLC系統，進樣分析，記錄峰面積，并代入血漿樣品線性方程中，計算血漿樣品中NE吸入溶液在不同時間點的濃度。采用藥動學軟件BAPP 2.0計算藥動學參數。

1.4.5 肺纖維化小鼠模型的建立及治療 按照Phillips等^［14］以及Zhao等^［15］的報道，吸入博來霉素溶液建立小鼠肺纖維化模型。24只小鼠平均分為對照組、模型組、靜脈注射組和吸入制劑組，每組6只，對照組給予生理鹽水（0.25 mL），其他組通過使用氣管內氣霧劑給予博來霉素溶液（5 mg/mL，5 mg/kg）。造模后第2天開始給藥，每天給藥1次，模型組、靜脈注射組和吸入制劑組分別給予生理鹽水（0.25 mL）、NE注射液（2.5 mg/kg）和NE吸入溶液（2.5 mg/kg）。

1.4.6 肺功能檢測 于第21天采用非束縛小動物肺功能測量儀（美國Buxco公司）檢測小鼠的吸氣、呼氣氣道阻力，呼吸頻率、潮氣量、每分鐘通氣量、50%潮氣量呼氣流量等數據。

1.4.7 肺干/濕重比 各組分別于給藥21 d隨機選取3只小鼠，安樂死后摘取左肺，無菌生理鹽水漂洗，吸除表面水分，稱濕重，然后在60 ℃干燥箱中干燥后稱重3次，直至重量不再改變為止，稱干重，按下式計算可得到干/濕重比：肺干/濕重比（%）=肺干重（g）/肺濕重（g）×100%。

1.4.8 肺組織中HYP分析 樣品經酸水解產生游離的HYP，進一步被對甲苯磺酰氯胺鈉氧化，氧化產物與對二甲氨基苯甲醛反應，產生紅色化合物，在560 nm處有特征吸收峰。通過測定樣品水解液560 nm的光密度值，可計算HYP含量。各組分別于給藥14、21 d隨機選取3只小鼠，安樂死后摘取左肺，將約60 mg左肺置于2 mL的水解液中，使用勻漿器對肺組織進行精細切碎和勻漿，然后置于110 ℃烘箱水解6 h。用提取液定容至2 mL，12 000 r/min離心20 min，取上清液于560 nm測定光密度，計算含量。

1.4.9 肺組織中TNF-α和TGF-β1的測定 肺纖維化小鼠在治療14、21 d后，分離獲取各組小鼠肺組織，取少量稱重后，按照1∶9加入預冷PBS（pH 7.4）。剪碎后，將肺組織樣本充分勻漿，3 000 r/min離心20 min，取上清液按照ELISA試劑盒說明書，測定TNF-α及TGF-β1含量。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量數據先進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態分布和方差齊性的數據采用均數±標準差（x±s）表示，多組樣本間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NE含量測定方法專屬性

NE的專屬性色譜圖如圖1所示，空白溶劑、空白輔料和各已知雜質均不干擾主峰測定且主峰純度符合要求。

2.2 三種霧化器霧化動態粒徑

采用Spraytec實時高速噴霧粒度儀測定不同霧化裝置PARI LC Plus、PARI LC Sprint及eFlow rapid的動態霧化粒徑，PARI LC Sprint相對于其他兩種霧化器的DV（10）、DV（50）和DV（90）更小，DV（10）、DV（50）和DV（90）均值為2.22 μm、3.30 μm及5.49 μm。

2.3 大鼠體內藥代動力學研究

NE在大鼠體內的藥動學曲線見圖2。SD大鼠以2.5 mg/kg劑量單次靜注NE吸入溶液后，血漿AUC_0-t為291 ng·（h·mL）^-1，體內消除半衰期為4.30 h；SD大鼠以2.5 mg/kg劑量單次肺部噴霧給予NE吸入溶液后，血漿AUC_0-t為186 ng·（h·mL）^-1，體內消除半衰期為5.27 h，計算絕對生物利用度為63.71%（表1）。

2.4 體內藥效學研究

2.4.1 小鼠體重在治療過程中的變化 各組小鼠分別在0、3、7、10、14、21 d稱重，觀察體重變化。對照組小鼠各方面正常，體重隨時間增加穩定增長；模型組小鼠從第3天開始精神萎靡，食欲不振，體重隨時間增加明顯下降（圖3）；靜脈注射組和吸入制劑組小鼠第7天，相較對照組體重均明顯下降，吸入制劑組小鼠體重高于靜脈注射組；在21 d給藥結束后，靜脈注射組和吸入制劑組小鼠體重接近對照組。

2.4.2 吸入制劑對肺功能的影響 小鼠肺纖維化一般表現為呼吸頻率加快、潮氣量降低等，由圖4可見，與對照組相比，模型組的支氣管收縮參數、50%潮氣量呼氣流量和呼吸頻率均顯著升高（P均lt;0.01），潮氣量顯著降低（Plt;0.01），其中50%潮氣量呼氣流量和呼吸頻率模型組達到了對照組的2倍左右。與模型組相比，靜脈注射組和吸入制劑組均能明顯降低支氣管收縮參數、50%潮氣量呼氣流量和呼吸頻率（P均lt;0.05）。21 d后模型組的潮氣量降低到對照組的一半左右，靜脈注射組和吸入制劑組較模型組潮氣量明顯提高，表明肺纖維化小鼠在給藥后肺功能得到改善。

2.4.3 肺干/濕重比結果分析 肺干/濕重比是反映肺水腫的直接指標，也是反映肺損傷嚴重程度的敏感指標。建模后，大量液體滲出至肺泡和肺間質，導致肺的重量增加，而肺的干重則不受影響。21 d后模型組肺干/濕重比較對照組明顯降低（Plt;0.01），說明模型組小鼠出現了肺水腫。吸入制劑組和靜脈注射組肺干/濕重比較模型組明顯上升（Plt;0.05），表明NE可有效抑制小鼠肺部水腫（圖5）。

2.4.4 肺組織中HYP、TNF-α、TGF-β1含量分析 小鼠肺組織HYP治療14、21 d的結果顯示（圖6A、6B），模型組14、21 d的HYP含量為1.1和1.3 μg/mg，與對照組（0.8 μg/mg）比較明顯增加（Plt;0.05）；與模型組相比，吸入制劑組治療14、21 d的HYP水平均明顯降低（Plt;0.05），而靜脈注射組治療21 d時HYP水平明顯降低（Plt;0.05）。

TNF-α測定結果見圖6C、6D，對照組14、21 d的TNF-α水平均為0.5 μg/L，模型組TNF-α在14、21 d持續升高（Plt;0.05）；與模型組相比，吸入制劑組治療21 d時TNF-α水平明顯降低（Plt;0.05）。

TGF-β1測定結果見圖6E、6F，模型組14、21 d TGF-β1水平較對照組明顯升高（Plt;0.01或Plt;0.05）。與模型組相比，吸入制劑組和靜脈注射組均能降低肺組織TGF-β1水平，且吸入制劑組的TGF-β1水平略低于靜脈注射組，但差異無統計學意義（Pgt;0.05）。

3 討論

吸入制劑能夠直接到達患者的肺部，使藥物在肺部的局部濃度更高，從而提高療效、降低不良反應，同時吸入制劑較口服制劑等起效快、生物利用度高。本文對NE吸入溶液處方工藝進行研究，結果表明，NE霧化吸入制劑的平均粒徑約為3.3 μm；其體內消除半衰期為5.27 h，平均滯留時間為2.58 h，較注射劑（1.3 h）顯著提高；其絕對生物利用度達到63.71%。目前，FDA批準上市的NE劑型為膠囊制劑，說明書中提到該藥品的絕對生物利用度僅為4.70%，肝臟首過效應和轉運子效應顯著，且胃腸道和肝臟不良反應發生率較高，吸入制劑顯著提高了本品的生物利用度。

HYP是機體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白在皮膚、肌腱、軟骨和血管中廣泛存在，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標。NE吸入制劑組能夠顯著降低肺組織的膠原含量，且對肺纖維化的治療效果優于靜脈注射組。TNF-α是一類重要的炎癥因子，能夠反映肺纖維化進程中炎癥反應程度，NE吸入制劑組經過21 d治療的炎癥反應明顯小于模型組，說明吸入制劑緩解了肺纖維化進程中的肺損傷程度。TGF-β1是一種多效性的細胞因子，是目前肺纖維化的研究熱點和重要的藥物作用靶點，NE吸入制劑組對肺組織TGF-β1的效果與靜脈注射組相當。以上藥效學結果顯示，NE吸入制劑可顯著改善肺功能各項參數（支氣管收縮參數、50%潮氣量呼氣流量和呼吸頻率等），肺干/濕重比以及HYP、TNF-α等指標。

綜上所述，本研究制備了NE吸入溶液，通過優化其處方及制備工藝，可顯著提高NE的生物利用度，改善其在肺部疾病的治療中給藥不便、不良反應大等臨床問題。

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［收稿日期］2024-04-07［編輯］郭 欣