骨髓間充質干細胞源外泌體對急性肺損傷大鼠肺泡巨噬細胞M1/M2極化的影響及其機制

［摘要］目的：探討大鼠骨髓間充質干細胞來源的外泌體（bone marrow mesenchymal stem cells derived exosomes，BMSCs-Exos）對脂多糖（LPS）誘導的急性肺損傷大鼠肺泡巨噬細胞NR8383 M1/M2極化的影響及其潛在的機制。方法：分離SD大鼠骨髓間充質干細胞并制備BMSCs-Exos。分別用0.1、1 mg/mL BMSCs-Exos預處理NR8383細胞1 h，再用1 μg/mL LPS誘導48 h，采用ELISA和蛋白免疫印跡分別檢測細胞上清液中炎性因子含量以及細胞內極化標志物蛋白表達。將NR8383細胞單獨培養或與BMSCs共培養，經20 μmol/L外泌體抑制劑GW4869處理并予以1 μg/mL LPS誘導48 h，采用實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡分別檢測細胞內miR-212-5p以及IL-4Rα和p-STAT6蛋白相對表達。生物信息學預測miR-212-5p與IL-4Rα mRNA結合位點并通過熒光素酶實驗驗證。結果：成功制備BMSCs-Exos。ELISA和免疫印跡結果表明，1 μg/mL LPS誘導48 h可促進NR8383細胞分泌炎性因子（TNF-α，IL-1β和IL-10）及M1極化，BMSCs-Exos預處理可明顯降低LPS誘導的NR8383細胞培養上清液中炎性因子TNF-α和IL-1β含量，增加抗炎因子IL-10含量，同時抑制細胞M1極化并促進其M2極化，且1 mg/mL BMSCs-Exos明顯強于0.1 mg/mL BMSCs-Exos。細胞共培養實驗結果表明，1 μg/mL LPS誘導48 h可增加NR8383細胞中miR-212-5p相對表達量以及IL-4Rα和p-STAT6蛋白表達，與BMSCs共培養可有效抑制LPS對上述指標的影響，但BMSCs的作用可被GW4869阻斷。熒光素酶實驗結果顯示，miR-212-5p可與IL-4Rα mRNA 3′UTR結合并促進其蛋白表達。結論：BMSCs-Exos可能通過miR-212-5p/IL-4Rα/STAT6通路抑制LPS誘導的急性肺損傷大鼠肺泡巨噬細胞NR8383的M1極化并促進其M2極化。

［關鍵詞］骨髓間充質細胞來源外泌體；急性肺損傷；肺泡巨噬細胞；M2極化；miR-212-5p

［中圖分類號］R563［文獻標志碼］A［文章編號］1671-7783（2024）06-0514-08

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230267

［引用格式］任振軍，黃麗娜. 骨髓間充質干細胞源外泌體對急性肺損傷大鼠肺泡巨噬細胞M1/M2極化的影響及其機制［J］. 江蘇大學學報（醫學版），2024，34（6）：514-521.

［作者簡介］任振軍（1982—），男，主治醫師，主要從事急診和腫瘤等研究。

Effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes on M1/M2 polarization of alveolar macrophages in rats with acute lung injury and its mechanism

REN Zhenjun， HUANG Li′na

（Department of Emergency， Shanghai Deji Hospital， Shanghai 200331）

［Abstract］Objective： To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes （BMSCs-Exos） on the M1/M2 polarization of alveolar macrophages NR8383 in rats with lipopolysaccharide （LPS）-induced acute lung injury and its potential mechanism. Methods： Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from Sprague-Dawley （SD） rats， and BMSCs-Exos were prepared. NR8383 cells were pretreated with 0.1 or 1 mg/mL BMSCs-Exos for 1 h， followed by induction with 1 μg/mL LPS for 48 h， respectively. ELISA and Western blotting were used to detect the inflammatory factor levels in the cell supernatant and the expression of intracellular polarization marker proteins， respectively. NR8383 cells were cultured alone or co-cultured with BMSCs， treated with 20 μmol/L exosome inhibitor GW4869， and induced with 1 μg/mL LPS for 48 h. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and Western blotting were used to detect the intracellular miR-212-5p expression and the relative expression of IL-4Rα and p-STAT6 proteins， respectively. The binding site of miR-212-5p and IL-4Rα mRNA were predicted by bioinformatics and verified by luciferase assay. Results： BMSCs-Exos were successfully prepared. ELISA and Western blotting results showed that 1 μg/mL LPS induced for 48 h promoted the secretion of inflammatory factors （TNF-α， IL-1β， and IL-10） and M1 polarization of NR8383 cells. Pretreatment with BMSCs-Exos significantly reduced the contents of LPS-induced inflammatory factors TNF-α and IL-1β， upregulated the content of anti-inflammatory factor IL-10， inhibited M1 polarization and promoted M2 polarization of NR8383 cells， and the effect of 1 mg/mL BMSCs-Exos was significantly stronger than that of 0.1 mg/mL BMSCs-Exos. The cell co-culture experiment results showed that 1 μg/mL LPS induced for 48 h increased miR-212-5p levels and IL-4Rα and p-STAT6 protein expression in NR8383 cells. Co-culture with BMSCs greatly inhibited the effects of LPS on the above indicators， however the effect of BMSCs could be blocked by GW4869. Luciferase assay results indicated that miR-212-5p could bind to the 3′UTR of IL-4Rα mRNA and promote its protein expression. Conclusion： BMSCs-Exos could inhibit M1 polarization and promote M2 polarization of LPS-induced rat alveolar macrophage NR8383 through the miR-212-5p/IL-4Rα/ STAT6 pathway.

［Key words］extracellular vesicles derived from bone marrow mesenchymal cells; acute lung injury; alveolar macrophages; M2 polarization; miR-212-5p

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）均屬臨床常見危重癥，目前較為認可的發病原因是失控的炎癥反應^［1］。在ALI/ARDS早期階段，肺泡巨噬細胞經肺部炎性微環境激活發生M1極化，在吞噬清除肺部病原微生物的同時釋放大量炎性因子，促進肺泡炎癥進展和組織損傷^［2］；隨著疾病進展至恢復期，M1型肺泡巨噬細胞可發生M2極化并釋放多種抗炎因子，進而抑制炎癥進展并減輕組織損傷^［3］。通過藥物干預和生物療法等誘導肺泡巨噬細胞發生M2極化并抑制其M1極化，可有效控制ALI/ARDS患者肺部級聯炎性反應，減輕組織損傷^［4-5］。

間充質干細胞是一類起源于中胚層的成體干細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能^［6］，可定植于ALI小鼠肺組織并發揮免疫調節功能，有效降低肺組織水腫進而提高其生存率^［7］。研究發現，經尾靜脈輸入間充質干細胞可減輕小鼠經細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ALI^［8］。已證實人骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）移植可明顯減輕LPS誘導的ALI小鼠肺部組織損傷^［9］。研究顯示，BMSCs來源的外泌體（BMSCs derived exosomes，BMSCs-Exos）是介導間充質干細胞抗炎的重要方式和途徑^［10］，然而，關于BMSCs-Exos內溶活性物質及其作用途徑尚不清楚。本研究擬探討大鼠BMSCs-Exos對LPS誘導的ALI大鼠肺泡巨噬細胞NR8383 M1/M2極化的影響及其潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、試劑與主要儀器

18只雄性SD大鼠，5周齡，體重（100±10）g，購于常州卡文斯實驗動物有限公司，合格證號No.202373857。大鼠肺泡巨噬細胞NR8383和人胚腎293細胞購于中科院上海細胞典藏中心。

Lipofectamine2000脂質體轉染試劑、MEM、無外泌體胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、Dulbecco磷酸鹽緩沖液（DPBS）購自美國Thermo公司；細胞培養皿、培養板、一次性無菌移液管和Trans-well小室購自美國Corning公司；BMSCs-Exos抑制劑GW4869與LPS購于美國Sigma公司；細胞RNA提取及反轉錄試劑盒，qRT-PCR檢測試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產品；兔抗大鼠蛋白一抗、HRP標記的羊抗兔二抗均購于英國Abcam公司；細胞蛋白提取定量試劑盒、化學底物發光試劑、蛋白預染分子量標準購自美國Pierce公司。RNA和DNA合成由上海生工生物科技有限公司完成。熒光素酶報告基因表達載體、雙熒光素酶檢測試劑盒以及GloMax20/20 Luminometer型熒光素酶活性檢測儀均為美國Promega公司產品。CellXpert C170i型CO²培養箱購自德國Eppendorf公司；Optima XPN系列超速離心機購自美國Beckman Coulter公司；JEM-F200型透射電鏡購自日本電子株式會社（JEOL）。

1.2 細胞實驗

1.2.1 大鼠BMSCs分離和培養 SD大鼠適應性飼養1周后用于BMSCs的分離培養，步驟和方法參照文獻［11］并略作改進。首先分離大鼠脛骨和股骨，然后用1 mL無菌注射器吸取含10%胎牛血清的MEM充分沖洗骨髓腔，反復3次；收集沖洗液至無菌離心管，2 000×g室溫離心2 min；取沉淀，加入5 mL紅細胞裂解液重懸；室溫放置5 min充分裂解紅細胞；再次室溫2 000×g離心2 min，取細胞沉淀；加入含10 mL 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的MEM重懸；接種至3 cm培養皿，于37 ℃、5%CO₂條件下培養；每兩天換液一次，更換為完全培養基；至接種后第7天，用胰酶消化形成的細胞集落；室溫2 000×g離心2 min；取沉淀，用含10%胎牛血清的MEM重懸；接種至10 cm培養皿，命名為P2代，于37 ℃、5%CO₂條件下培養；當細胞貼壁生長至密度達75%時，通過胰酶消化法進行傳代。

1.2.2 BMSCs細胞標志物鑒定 取P2和P4代BMSCs于倒置相差顯微鏡下觀察細胞外形。取P3代BMSCs以1×10⁵個/孔密度接種于6孔板，培養48 h；0.25%蛋白酶消化細胞，3 000×g離心2 min；取沉淀，DPBS洗滌2次；加入500 μL PBS重懸；參考文獻［12］采用流式細胞術檢測細胞表面標志物蛋白表達。取200 μL含1×10⁵個BMSCs的細胞懸液，分別加入5 μL FITC標記的兔抗大鼠CD90、CD29、CD105和CD34蛋白一抗，充分混勻，室溫避光孵育15 min；加入5 mL上樣緩沖液并充分混勻，1 000×g離心5 min；取沉淀，加入200 μL上樣緩沖液重懸，上機檢測熒光信號并評估相關標志物表達。

1.2.3 BMSCs-Exos制備 參考文獻［12-13］的順序離心法制備和純化BMSC-Exos。將BMSCs擴增至P4代，接種后常規培養48 h；收集上清液，500×g離心10 min；取上清液，12 000×g離心20 min以去除細胞碎片；取上清液，于4 ℃行100 000×g超速離心120 min；取沉淀，重懸于適量DPBS，-80 ℃保存。

1.2.4 BMSCs-Exos形貌表征 參照文獻［14］采用透射電子顯微鏡對BMSCs-Exos形貌進行表征。將BMSCs-Exos重懸于PBS，加入2.5%戊二醛室溫固定15 min；取10 μL滴加至覆蓋碳膜的鎳網，室溫靜置10 min使其沉積附著于碳膜；2%磷鎢酸溶液染色2 min；濾紙吸去多余染液，室溫自然晾干15 min；采用透射電子顯微鏡觀察結果（50 000×）。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測BMSCs-Exos標志物表達 取1×10¹⁰個外泌體，用RIPA裂解液（0.1%-1% NP-40、0.1%-1% SDS、50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA）充分裂解；15 000×g離心10 min，以去除細胞碎片；取上清液，即為外泌體總蛋白提取物；通過Bradford法對蛋白進行定量。每樣本取15 μg行11% SDS-PAGE，80 V電泳15 min，120 V電泳1 h；450 mA濕法轉膜1 h，使蛋白質完全轉至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；TBST洗膜3次；加入兔抗大鼠CD9、CD63、CD81和Calnexin一抗，稀釋比為1∶500，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次；加入HRP標記的羊抗兔二抗，稀釋比為1∶3 000，室溫孵育2 h；再次TBST洗膜3次；用化學發光底物顯影，通過X光片檢測目的蛋白條帶。

1.2.6 BMSCs-Exos對LPS誘導的NR8383細胞炎性因子分泌及細胞極化指標影響檢測

1.2.6.1 NR8383細胞分組及LPS誘導 取對數期NR8383細胞，0.25%胰蛋白酶消化，計數后重懸于含10%胎牛血清的MEM，接種至6孔板（1×10⁵個/孔），于37 ℃、5%CO₂細胞培養箱中培養。待細胞完全貼壁后，將其分為4組：① 空白對照組，細胞常規培養；② LPS組，培養基中加入終濃度1 μg/mL LPS誘導細胞48 h；③ PBS對照組，培養基中加入10 μL DPBS和終濃度為1 μg/mL LPS誘導細胞48 h；④ BMSCs-Exos低劑量+LPS組，培養基中加入終濃度為0.1 mg/mL BMSCs-Exos培養1 h，再加入終濃度1 μg/mL LPS誘導細胞48 h；⑤ BMSCs-Exos高劑量+LPS組，培養基中加入終濃度1 mg/mL BMSCs-Exos培養1 h，再加入終濃度1 μg/mL LPS誘導細胞48 h。

1.2.6.2 ELISA法檢測炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-10含量 收集“1.2.6.1”各組細胞，10 000×g離心2 min；取上清液，根據試劑盒要求將樣品、標準品及空白對照添加至96孔板中；加入按照1∶1 000稀釋的捕獲抗體，室溫孵育1 h；用含Tween-20的DPBS洗板3次；加入1∶3 000稀釋的生物素標記的二抗，室溫孵育30 min；洗板；加入HRP標記的鏈霉親和素，孵育30 min；再次洗板；加入TMB底物液，觀察顏色變化，15 min后加入終止液；于450 nm波長處讀取光密度值，根據標準曲線計算細胞上清液中炎性因子含量。

1.2.6.3 蛋白免疫印跡法檢測巨噬細胞極化標志物表達 具體方法同“1.2.5”。兔抗大鼠CD68、CD80、Arg-1、CD206和β-actin一抗稀釋比分別為1∶300，1∶500，1∶400、1∶800和1∶2 000，HRP標記的羊抗兔二抗稀釋比為1∶3 000。

1.2.7 BMSCs共培養對NR8383細胞內miR-212-5p、IL-4α和磷酸化STAT6蛋白表達影響檢測

1.2.7.1 細胞分組、共培養與處理 將NR8383細胞單獨培養以及與BMSCs細胞進行共培養。共培養體系建立：將P4代BMSCs以1×10⁵個/孔密度接種于Trans-well下室，NR8383細胞則以5×10⁴個/孔密度接種于Trans-well上室，均用含10%胎牛血清的MEM培養。按照上室和下室接種細胞組合將實驗分為4組：① NR8383組，僅上室接種NR8383細胞；② NR8383+LPS組，僅上室接種NR8383細胞，培養基中加入終濃度為1 μg/mL LPS誘導細胞48 h；③ BMSCs/NR8383共培養+LPS組，上室接種NR8383而下室接種BMSCs，同時向培養液中加入終濃度為1 μg/mL LPS誘導細胞48 h；④ BMSCs/NR8383共培養+GW4869+LPS組，上室接種NR8383而下室接種BMSCs，培養基中加入終濃度為20 μmol/L GW4869和終濃度為1 μg/mL LPS誘導細胞48 h。

1.2.7.2 qRT-PCR檢測miR-212-5p相對表達量 取上述4組細胞，采用Trizol裂解法提取總RNA；取1 μg細胞RNA反轉錄為cDNA，采用隨機引物Random（10 μmol/L）以及miR-212-5p特異性反轉錄引物5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGC-AATTGCACTGGATACGACAGTAA-3′（10 μmol/L）。取2 μL反轉錄產物行PCR，總體系為20 μL：SYBR染料預混液10 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.2 μL，cDNA 2 μL，無菌水7.6 μL。PCR條件設定：95 ℃ 10 min；60 ℃ 20 min；72 ℃ 20 min，40個循環。引物序列：miR-212-5p，5′-GTCGTATCCAGT-GCGTGTCGT-3′和5′-ACCTTGGCTCTAGACTGCTT-ACTG-3′；U6，5′-GCCTGCTTCGGCAGCACATATA-3′和5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′。采用2^-ΔCt法分析miR-212-5p相對表達量，U6作為參照。

1.2.7.3 蛋白免疫印跡檢測IL-4α和磷酸化STAT3相對表達 取上述4組細胞，用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法定量；后續實驗方法同“1.2.5”。兔抗大鼠IL-4Rα和磷酸化STAT6一抗稀釋比均為1∶400，兔抗大鼠STAT6一抗稀釋比為1∶800，兔抗大鼠β-actin（內參）一抗稀釋比為1∶2 000；HRP標記的羊抗兔二抗稀釋比為1∶3 000。

1.2.8 熒光素酶實驗分析IL-4Rα mRNA與miR-212-5p結合位點

1.2.8.1 生物信息學預測IL-4Rα mRNA與miR-212-5p結合位點 登錄美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站查找大鼠IL-4Rα基因序列信息（NM_133380.2），再用在線分析軟件TargetScan預測其mRNA 3′UTR與miR-212-5p結合位點。

1.2.8.2 熒光素酶報告基因表達載體構建以及RNA合成 以大鼠cDNA為模版，PCR擴增大鼠IL-4Rα mRNA 3′UTR（206 bp）并用于構建熒光素酶基因表達載體pGL3-wt-IL-4Rα。引物序列：上游，5′-GCTCTAGATCACAGCAGTCCTGGCATAG-3′；下游，5′-GCTCTAGATGCATTTAGACACCGGATCTAAACTG-GGCCAAGCTGGGACAG-3′。PCR體系組成：SYBR Green PCR Master Mix（2×）10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，反轉錄產物2 μL，無核酸酶水7.2 μL，總反應體系為20 μL；條件：95 ℃變性10 min，58 ℃退火30 min，72 ℃延伸30 min，36個循環。

采用定點突變對miRNA種子區結合位點（5′-CCAAGGA-3′）進行錯義突變（5′-AGACCAG-3′）構建pGL3-mt-IL-4Rα。化學合成miR-212-5p mimics（5′-ACCUUGGCUCUAGACUGCUUACUGtt-3′），miR-212-5p inhibitor（5′-CAGUAAGCAGUCUAGAGCCAA-GGUtt-3′）以及scrambled miR-212-5p（5′-CAGUGUCUGACUGCUAUGUCCACUtt-3′）。

1.2.8.3 細胞分組及轉染 將對數期人胚腎293細胞以1×10⁴個/孔密度接種于24孔板，用含10%胎牛血清的MEM常規過夜培養；將其分為7組：① pGL3-wt-IL-4Rα組，轉染pGL3-wt-IL-4Rα；② pGL3-mt-IL-4Rα組，轉染pGL3-mt-IL-4Rα；③ pGL3-wt-IL-4Rα+miR-212-5p mimics組，同時轉染pGL3-wt-IL-4Rα和miR-212-5p mimics；④ pGL3-mt-IL-4Rα+miR-212-5p mimics組，同時轉染pGL3-mt-IL-4Rα和miR-212-5p mimics；⑤ pGL3-wt-IL-4Rα+miR-212-5p inhibitor組，同時轉染pGL3-wt-IL-4Rα和miR-212-5p inhibitor；⑥ pGL3-mt-IL-4Rα+miR-212-5p inhibitor組，同時轉染pGL3-mt-IL-4Rα和miR-212-5p inhibitor；⑦ pGL3-wt-IL-4Rα+scrambled miR-212-5p mimics組，同時轉染pGL3-wt-IL-4Rα和scrambled miR-212-5p mimics。轉染前用500 μL無血清MEM對細胞進行換液。每孔轉染質粒DNA和RNA的用量分別為0.8 μg和50 pmol，Lipofectmaine2000轉染試劑為3 μL。轉染物與轉染試劑分別用250 μL無血清MEM稀釋并靜置5 min，然后將二者充分混合后室溫靜置20 min，全量加入細胞上清液，混勻，繼續培養48 h。

1.2.8.4 熒光素酶活性檢測 取上述7組細胞，每孔加100 μL裂解緩沖液，冰上孵育5 min以裂解細胞；取裂解產物，12 000×g離心5 min；收集上清液，每樣本取20 μL于96孔板中，隨后加入相應的熒光素酶底物，用熒光酶標儀讀取發光強度。

1.3 統計分析

采用GraphPad Prism 9.3數據分析軟件進行統計分析，每組實驗設3次生物學重復，計量數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs分離、培養和鑒定

形態學觀察結果顯示，P2和P4代大鼠BMSCs以單層貼壁方式生長，P2代細胞呈紡錘形，直徑在35～70 μm之間，P4代細胞形態逐漸轉變為梭形，且細胞間形態趨于均一。標志物檢測結果顯示，絕大多數BMSCs呈CD90、CD29和CD105表達陽性，CD34表達陰性。由此說明，BMSCs不但具有較高純度，而且具備較強的分化潛能。見圖1。

2.2 BMSCs-Exos形貌表征和鑒定

透射電子顯微鏡觀察結果顯示，BMSCs-Exos直徑平均約為80 μm。蛋白免疫印跡檢測結果顯示，BMSCs-Exos蛋白提取物中有外泌體陽性標志物CD9、CD63和CD81蛋白表達，而未檢測到外泌體陰性標志物Calnexin蛋白表達。由此說明，成功制備BMSCs-Exos。見圖2。

2.3 BMSCs-Exos可抑制LPS誘導的NR8383細胞M1極化并促進M2極化

ELISA檢測結果顯示（圖3A），與空白對照組比較，LPS組炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-10含量明顯升高（P均＜0.01）；與LPS組比較，BMSCs-Exos低、高劑量+LPS組TNF-α和IL-1β含量明顯降低（P＜0.05或P均＜0.01），BMSCs-Exos高劑量組IL-10含量明顯升高（P均＜0.01）；與BMSCs-Exos低劑量+LPS組比較，BMSCs-Exos高劑量+LPS組炎性因子含量變化更明顯（P＜0.01或P＜0.05）。

蛋白免疫印跡結果顯示（圖3B），與空白對照組比較，LPS組CD68、CD80、CD206和Arg-1蛋白相對表達水平明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；與LPS組比較，BMSCs-Exos低劑量+LPS組CD68相對表達水平明顯降低（Plt;0.05），CD206相對表達水平明顯升高（Plt;0.05）；BMSCs-Exos高劑量+LPS組CD68和CD80相對表達水平明顯降低（P均＜0.01），Arg-1和CD206相對表達水平明顯升高（P均＜0.01）；與BMSCs-Exos低劑量+LPS組相比，BMSCs-Exos高劑量+LPS組上述蛋白相對表達水平變化更顯著（P均＜0.01）。

2.4 BMSCs共培養可通過外泌體途徑上調經LPS誘導的NR8383細胞中miR-212-5p、IL-4Rα和p-STAT6蛋白表達

qRT-PCR結果顯示（圖4A），與對照組相比，NR8383+LPS組細胞中miR-212-5p相對表達量無明顯變化（P＞0.05），但共培養+LPS組miR-212-5p相對表達量明顯升高（P＜0.01）；與共培養+LPS組相比，共培養+GW4869+LPS組miR-212-5p相對表達量明顯降低（P＜0.01）。

蛋白免疫印跡結果顯示（圖4B），與NR8383組相比，NR8383+LPS組細胞中IL-4Rα、p-STAT6蛋白相對表達水平明顯升高（P均＜0.05）；與NR8383+LPS組相比，BMSCs/NR8383共培養+LPS組IL-4Rα、p-STAT6蛋白相對表達水平明顯升高（P均＜0.01）；與BMSCs/NR8383共培養+LPS組相比，BMSCs/NR8383共培養+GW4869+LPS組IL-4Rα、p-STAT6蛋白相對表達水平明顯降低（P均＜0.01）。由此說明，BMSCs可上調與之共培養且經LPS誘導的NR8383細胞中miR-212-5p含量，并上調其下游蛋白IL-4Rα表達以及STAT6蛋白磷酸化。

2.5 miR-212-5p可與IL-4Rα mRNA 3′UTR結合并上調其蛋白表達

生物信息學預測結果顯示（圖5A），大鼠IL-4Rα mRNA 3′UTR存在7個堿基的miR-212-5p種子區結合位點5′-CCAAGGA-3′。

熒光素酶實驗結果顯示（圖5B），與pGL3-wt-IL-4Rα組比較，pGL3-wt-IL-4Rα+miR-212-5p mimics組熒光素酶相對活性明顯增強（P＜0.01），而pGL3-wt-IL-4Rα+miR-212-5p inhibitor組熒光素酶相對活性明顯降低（P＜0.05），pGL3-wt-IL-4Rα+scrambled miR-212-5p mimics組熒光素酶相對活性無明顯變化（P＞0.05）。此外，與pGL3-mt-IL-4Rα組相比，pGL3-mt-IL-4Rα+miR-212-5p mimics組和pGL3-mt-IL-4Rα+miR-212-5p inhibitor組熒光素酶相對活性均無明顯變化（P均＞0.05）。由此表明，miR-212-5p可通過預測結合位點促進IL-4Rα蛋白表達。

3 討論

間充質干細胞外泌體內溶物中包含多種活性生物物質，如miRNA、長鏈非編碼RNA和小分子量多肽等，因而可作為間充質干細胞移植療法的有效替代方案；與間充質干細胞移植相比，間充質干細胞外泌體還具有極佳的生物相容性和免疫通過性^［15-16］。有研究將異體脂肪間充質干細胞外泌體以霧化吸入形式給予重癥新冠肺炎患者，結果顯示患者肺損傷均明顯減輕，受損肺功能得到明顯改善^［17］。同時期另一項來自北卡羅來納州立大學的研究表明，通過霧化吸入方式輸送肺干細胞外泌體至肺損傷部位，患者肺損傷明顯減輕，早期肺纖維化進展明顯延緩^［18］。本研究結果表明，大鼠來源的BMSCs-Exos可有效抑制LPS誘導的大鼠肺泡巨噬細胞NR8383致炎因子TNF-α和IL-1β分泌并增加抗炎因子IL-10表達；此外，LPS可誘導NR8383細胞發生M1極化，而BMSCs-Exos預處理可有效抑制LPS誘導的NR8383細胞M1極化并促進M2極化。由此從肺泡巨噬細胞M1/M2極化角度證實BMSCs-Exos可改善ALI^［18-19］。

研究表明，BMSCs-Exos不僅可抑制巨噬細胞M1極化，還可誘導M1型巨噬細胞發生M2極化，由促炎表型轉化為抗炎表型，并最終改善失控性炎癥反應^［19-21］。本研究結果顯示，與BMSCs細胞共培養，可明顯上調LPS誘導的NR8383細胞中IL-4Rα蛋白表達以及STAT6蛋白磷酸化，即IL-4Rα/STAT6通路的活化；采用外泌體抑制劑GW4869可有效逆轉BMSCs的上述作用，則說明該作用由BMSCs-Exos所介導；此外，與BMSCs細胞共培養可增加LPS誘導的NR8383細胞中miR-212-5p相對表達量，且該現象可被GW4869阻斷。由此說明，來自于大鼠BMSCs-Exos可通過上調肺泡巨噬細胞中miR-212-5p相對表達量，進一步活化IL-4Rα/STAT6軸而促進細胞M2極化。這與肺泡巨噬細胞通過M1/M2極化參與肺損傷^［22］的研究結果相符。

miR-212-5p定位于人17號染色體以及大鼠10號染色體，且序列跨物種高度保守，本研究發現其作為BMSCs-Exos活性內溶物，參與肺泡巨噬細胞的極化調控。與研究報道的miRNA對其靶基因表達的負調控方式不同^［23］，本研究結果顯示，miR-212-5p可通過與IL-4Rα mRNA 3′UTR結合對蛋白表達進行正向調控。雖然miRNA抑制靶蛋白表達的負調控現象已經其他幾項研究所證實^［23-25］，但miRNA對靶基因存在正向和負向調控的具體作用有待進一步研究。此外，miRNA可能具有多個靶基因，在miR-212-5p通過IL-4Rα/STAT6通路參與肺泡巨噬細胞M1/M2極化的作用模式中，miR-212-5p是否為IL-4Rα/STAT6的唯一影響因素以及IL-4Rα/STAT6是否為miR-212-5p參與巨噬細胞極化調控的唯一下游通路，有待進一步研究。

綜上所述，本研究結果表明，大鼠源BMSCs-Exos可能通過增加大鼠肺泡巨噬細胞NR8383中miR-212-5p表達致IL-4Rα/STAT6通路活化，進而抑制LPS誘導的巨噬細胞M1極化并促進M2極化。

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［收稿日期］2023-12-07［編輯］劉星星