核型正常產前診斷中染色體微陣列的應用分析

［摘要］目的探討染色體微陣列（CMA）在核型正常的羊水產前診斷中染色體微缺失或微重復的臨床意義。方法收集2017年1月至2021年6月在汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院行羊膜腔介入性產前診斷的877例羊水標本，進行核型及CMA檢測，以核型正常的794例羊水標本為研究對象，對CMA檢測的異常結果進行分析。結果成功對794例標本進行了核型和CMA檢測。在794例核型正常的標本中，CMA檢測異常35例，產前診斷指征中，胎兒超聲異常13例，占37.14%（13/35）；血清學篩查高風險10例，占28.57%（10/35）；高齡妊娠6例，占17.14%（6/35）；無創產前檢測（NIPT）提示異常3例，不良孕產史3例。CMA檢測較核型分析額外檢出4.41%（35/794）的異常標本；其中，致病性拷貝數變異（CNVs）17例，檢出率為2.14%（17/794），臨床意義不明CNVs 12例，檢出率為1.51%（12/794），純合區域（ROH）異常6例，檢出率為0.76%（6/794）。在17例致病性CNVs中，檢出的CNVs片段范圍在147.00kb～4.30Mb，檢出5種已知微缺失/微重復綜合征，分別為16p11.2微重復綜合征、16p13.11微缺失綜合征、腎囊腫和糖尿病（RCAD）綜合征、22q11.21微重復綜合征、DiGeorge綜合征。在12例臨床意義不明CNVs中，檢出的CNVs片段范圍在369.00kb～5.70Mb，對7例胎兒的父母進行了外周血CMA驗證，其中4例（編號18、編號19、編號23、編號29）遺傳自表型正常的母親，2例（編號22、編號28）遺傳自表型正常的父親，1例（編號20）考慮為新發病例。在6例ROH異常的CNVs中，檢出的CNVs片段范圍在21.80～83.00Mb，對2例胎兒的父母進行了外周血CMA驗證，其中1例（編號32）排除了20號染色體單親二倍體（UPD）的可能，1例（編號33）僅對母親進行了CMA驗證，其結果顯示正常，考慮為父源性。結論CMA檢測可以檢出核型分析難以測查的微缺失、微重復、單親二倍體及雜合性缺失等基因組失衡現象，是產前診斷核型分析的有效補充檢測技術。

［關鍵詞］產前診斷；染色體核型；染色體微陣列；微缺失/微重復

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.11.011

［中圖分類號］R173［文獻標識碼］A

［文章編號］1673-5293（2024）11-0085-07

Analysis of application of chromosomal microarray analysis in prenatal diagnosis of normal karyotype

ZENG Dan，FAN Shushu，XU Jing，MIAO Shuhong，JIANG Meimei

（Yuebei Peoples Hospital，Affiliated to Shantou University Medical College，Guangdong Shaoguan 512026，China）

［Abstract］ Objective To investigate the clinical significance of chromosomal microdeletion and microduplication detected by chromosomal microarray analysis （CMA） in prenatal diagnosis of amniotic fluid of normal karyotype. Methods A total of 877 amniotic fluid samples were collected from patients who underwent invasive prenatal diagnosis via amniocentesis at Yuebei Peoples Hospital Affiliated to Shantou University Medical College between January 2017 and June 2021.Karyotype and CMA were performed on these samples.Among them，794 samples with normal karyotype were selected as the study subjects，and the abnormal results of CMA detection were analyzed. Results A total of 794 specimens underwent karyotyping and CMA testing.Among the 794 specimens with normal karyotypes，CMA testing showed abnormalities in 35 cases.Among the prenatal diagnostic indications，there were 13 cases （37.14%，13/35） with abnormal fetal ultrasound findings，10 cases （28.57%，10/35） identified as high risk by serum screening，6 cases （17.14%，6/35） from advanced maternal age pregnancies，3 cases with abnormal results from non-invasive prenatal testing （NIPT），and 3 cases with a history of adverse pregnancy outcomes.CMA testing detected abnormalities in 4.41% （35/794） of specimens that were not identified by karyotype analysis.Among these，there were 17 pathogenic copy number variations （CNVs），with a detection rate of 2.14% （17/794），12 CNVs of unclear clinical significance with a detection rate of 1.51% （12/794），and 6 cases of abnormal regions of homozygosity （ROH），with a detection rate of 0.76% （6/794）.Among the 17 cases of pathogenic CNVs，the detected CNV segments ranged from 147.00kb to 4.30Mb，five known microdeletion/microduplication syndromes were identified，including the 16p11.2 microduplication syndrome，16p13.11 microdeletion syndrome，renal cysts and diabetes （RCAD） syndrome，22q11.21 microduplication syndrome，and DiGeorge syndrome.Among the 12 cases of CNVs with unclear clinical significance，the detected CNV segments ranged from 369.00kb to 5.70Mb，peripheral blood CMA verification was performed on the parents of seven fetuses.Of these，four cases （Case 18，Case 19，Case 23，and Case 29） were inherited from phenotypically normal mothers，two cases （Case 22 and Case 28） were inherited from phenotypically normal fathers，and one case （Case 20） was considered a de novo case.Among the six cases of CNVs with ROH abnormalities，the detected CNV segments ranged from 21.80Mb to 83.00Mb，peripheral blood CMA verification was performed on the parents of two fetuses.In one case （Case 32），the possibility of uniparental disomy （UPD） on chromosome 20 was excluded，and in one case （Case 33），only the mother underwent CMA verification，which returned a normal result，suggesting paternal origin. Conclusion CMA can detect genomic imbalances such as microdeletion，microduplication，uniparental disomy and loss of heterozygosity that are difficult to detect through karyotype，it is an effective supplementary detection technology to karyotype analysis in prenatal diagnosis.

［Key words］ prenatal diagnosis;chromosomal karyotype;chromosomal microarray analysis;microdeletion/microduplication

染色體微陣列（chromosome microarray analysis，CMA）是一種高分辨率、全基因組范圍的檢測技術，不僅可以檢測染色體數目異常、染色體非平衡結構異常，而且能檢出亞顯微水平的拷貝數變異（copy number variants，CNVs），即染色體微缺失或微重復等［1-2］。本研究通過對794例核型正常的羊水標本進行分析，以探討CMA檢測技術在產前診斷染色體微缺失或微重復中的應用情況。

1研究對象與方法

1.1研究對象

收集2017年1月至2021年6月在汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院行羊膜腔介入性產前診斷，并進行核型及CMA檢測的877例孕婦為研究對象。孕婦年齡為16～45歲，孕周為17～25+4周，單胎，羊膜腔穿刺后抽取羊水，分別行核型及CMA聯合檢測。從中選取染色體核型正常的794例羊水標本納入研究。

1.2納入與排除標準

納入標準：①病歷資料完整；②所有孕婦均自愿接受介入性產前診斷；③簽署知情同意書；④染色體核型正常。

排除標準：①羊水樣本不合格；②母血污染；③多胎妊娠；④輔助生殖受孕。

本研究通過粵北人民醫院醫學倫理委員會批準（YBEC-KY）。

1.3方法

1.3.1產前診斷指征

①血清學篩查高風險；②高齡孕婦（≥35歲）；③胎兒超聲異常；④無創產前檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）提示異常；⑤有不良孕產史；⑥夫妻染色體異常。

1.3.2標本的采集

消毒輔巾，在超聲引導定位下行羊膜腔穿刺，抽取羊水32mL，丟棄最先抽取的2mL羊水，其中10mL羊水行CMA檢測，另外20mL羊水離心棄上清后留懸液，分兩瓶進行雙人雙線培養操作后，行染色體核型分析。

1.3.3染色體核型分析

抽取羊水后立即離心，棄上清，吸取沉淀，放入裝有4.5mL培養基的培養瓶中，混均后分別放入Thermo公司的兩臺二氧化碳培養箱中，培養7～8天換新培養液后，騷刮羊水細胞混勻，繼續培養2～4天，觀察羊水細胞，其長滿培養瓶底約2/3時進行收獲，制片，胰酶消化，G顯帶后，用卡爾蔡司公司Axio Imager Z2正置顯微鏡進行掃描，每份標本至少分析5個核型，20個分裂相，若發現異常，則加大計數和染色體核型分析。按照人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN2016）標準，對相關染色體進行命名。

1.3.4 CMA檢測

在超聲引導下經羊膜腔穿刺采樣，應用Affymetrix公司的CytoScan 750k芯片對全基因組進行檢測分析，檢測過程中對DNA進行提取、酶切、連接、PCR、純化、片段化、標記、雜交洗滌、掃描和分析等步驟，均嚴格按照標準流程進行操作，檢測結果應用ChAS3.1.0.15軟件（美國Affymetrix公司）進行分析。

參照相關文獻［3］將CMA檢測結果分為五類，致病性、可能致病、臨床意義不明、可能良性、良性。產前診斷CMA檢測結果一般報：致病性、可能致病、臨床意義不明。

2結果

2.1 CNVs檢測異常的一般情況

成功對877例羊水標本進行了染色體核型及CMA檢測，其中核型正常的羊水標本共有794例（包括多態13例，9號倒位12例）。在794例核型正常的標本中，CMA檢測異常35例，產前診斷指征中，胎兒超聲異常13例，占37.14%（13/35）；血清學篩查高風險10例，占28.57%（10/35）；高齡妊娠6例，占17.14%（6/35）；NIPT提示異常3例，不良孕產史3例。CMA檢測較核型額外檢出4.41%（35/794）的異常標本；其中，17例致病性CNVs，檢出率為2.14%（17/794），12例臨床意義不明CNVs，檢出率為1.51%（12/794），6例純合區域（regions of homozygosity，ROH）異常，檢出率為0.76%（6/794）。

2.2致病性CNVs的情況

在17例致病性CNVs中，產前診斷指征血清學篩查高風險7例，占41.18%（7/17），胎兒超聲異常6例，占35.29%（6/17），不良孕產史2例，NIPT提示異常1例，高齡妊娠1例。其主要涉及X、22號染色體異常，微缺失12例，占70.59%（12/17）；微重復4例，占23.53%（4/17）；微重復缺失1例，占5.88%（1/17）。檢出的CNVs片段范圍在147.00kb～4.30Mb，檢出5種已知微缺失/微重復綜合征，分別為16p11.2微重復綜合征、16p13.11微缺失綜合征、腎囊腫和糖尿病（renal cysts and diabetes，RCAD）綜合征、22q11.21微重復綜合征、DiGeorge綜合征。

其它致病性CNVs涉及類固醇硫酸酯酶（ste-roid sulfatase，STS）、矮身材同源盒（short stature homeobox，SHOX）、性別決定基因（sex-determmmg region Y gene，SRY），缺口受體1（notch receptor 1 gene，NOTCH1）、皮膚基底細胞瘤抑制因子（patched 1，PTCH1）等疾病相關基因。對3例胎兒的父母進行了外周血CMA驗證，結果顯示，其中1例（編號11）考慮為新發病例，1例（編號10）遺傳自表型正常的母親，1例（編號17）遺傳自有智力低下、先天性語言障礙的母親，見表1。

2.3臨床意義不明CNVs的情況

在12例臨床意義不明CNVs中，產前診斷指征胎兒超聲異常5例，占41.67%（5/12）；高齡妊娠4例，占33.33%（4/12）；血清學篩查高風險2例，占16.67%（2/12）；NIPT提示異常1例。其主要涉及2、4號染色體異常，檢出的CNVs片段范圍在369.00kb～5.70Mb。對7例胎兒的父母進行了外周血CMA驗證，結果顯示，其中4例（編號18、編號19、編號23、編號29）遺傳自表型正常的母親，2例（編號22、編號28）遺傳自表型正常的父親，1例（編號20）考慮為新發病例，見表2。

2.4 ROH異常的情況

在6例ROH異常的CNVs中，產前診斷指征胎兒超聲異常2例，占33.33%（2/6），高齡妊娠1例，血清學篩查高風險1例、NIPT提示異常1例、不良孕產史1例。檢出的CNVs片段范圍在21.80～83.00Mb。對2例胎兒的父母進行了外周血CMA驗證，結果顯示，其中1例（編號32）排除了20號染色體單親二倍體（uniparental disomy，UPD）的可能，1例（編號33）僅對母親進行了CMA驗證，其結果顯示正常，考慮為父源性，見表3。

2.5妊娠結局

在17例致病性CNVs羊水標本中，9例引產，8例繼續妊娠，新生兒未見異常。在12例臨床意義不明CNVs羊水標本中，1例因超聲顯示“胎兒水腫”引產，11例繼續妊娠中有1例新生兒為雙足外翻，余新生兒未見異常。在6例ROH異常CNVs羊水標本中，1例因“孕40周胎死宮內”引產，1例因超聲示“胎兒心臟畸形”引產，1例孕31+6周時因“子癇前期、腎炎”行剖宮產，胎兒出生后進行腦康復治療，且其1歲多有隱睪手術治療史，余3例繼續妊娠，新生兒未見異常。

2.6致病性CNVs病例的隨訪情況

在17例致病性CNVs病例中，對9例進行了引產，8例新生兒出生，并重點對其進行了隨訪。編號1、編號2隨訪至4歲，已出現魚磷病皮膚癥狀；編號4隨訪至4歲，體檢良好；編號9的16p11.2微重復綜合征外顯率為27.20%，隨訪至3個月，體檢良好，后失訪；編號10的16p13.11微缺失綜合征外顯率為13.10%，隨訪至3歲，體檢良好；編號11的腎囊腫和糖尿病（RCAD）綜合征外顯率為34.40%，隨訪至5歲，體檢良好；編號13、編號14的22q11.21微重復綜合征外顯率均為21.90%，隨訪至4歲，體檢良好。

3討論

3.1 CMA檢出情況

本研究對877例羊水標本均進行了染色體核型及CMA檢測，在核型正常的794例中，CMA檢測異常35例，檢出率為4.41%（35/794）。Hillman等［4］研究發現，染色體核型檢測正常時，CMA檢出率為3.6%。與該研究相比，本研究中CMA檢出率相對較高，其可能與國內相關數據庫不完善，國內外不同基因芯片平臺的CNVs報告標準不同有關。

3.2異常CMA與產前診斷指征

本研究顯示，在核型正常而CMA異常的35例產前診斷指征中，胎兒超聲異常13例，數目最多，占37.14%（13/35）；其次為血清學篩查高風險10例（28.57%）、高齡妊娠6例（17.14%）。這提示在染色體微缺失微重復中，胎兒超聲產前診斷更易檢出染色體異常。本研究顯示，在17例致病性CNVs中，血清學篩查高風險7例，占41.18%（7/17）；胎兒超聲異常6例，占35.29%（6/17）。這表明在核型正常而CMA異常的不同羊水產前診斷指征中，血清學篩查高風險陽性檢出率最高。因此，應用血清學篩查高風險時，應盡早建議孕婦行產前診斷，對核型分析的同時行CMA檢測。

3.3致病性CNVs與相關疾病

本研究顯示，在核型正常的794例標本中，檢出17例致病性CNVs，疾病檢出率提高了2.14%（17/794）。這與譚滿勝等［5］研究致病性CNVs疾病檢出率提高了2.22%基本相符。本研究顯示，致病性CNVs染色體微缺失12例（70.59%），微重復4例（23.53%），微重復缺失1例（5.88%），可見致病性CNVs主要以微缺失致病為主。在致病性CNVs中檢出22q11.21微重復綜合征3例，Xp22.31微缺失3例，腎囊腫和糖尿病（RCAD）綜合征2例，DiGeorge綜合征、16p11.2微重復綜合征、16p13.11微缺失綜合征各1例，涉及致病基因6例。22q11.21微重復綜合征主要表現為智力低下、精神運動發育遲滯、生長緩慢等，外顯率為21.90%［6］。梅瑾等［7］研究顯示，在6例22q11.21微重復病例中，有5例產前診斷指征為唐氏篩查21三體高風險。本研究中有3例22q11.21微重復病例均為血清學篩查高風險。由此可見，22q11.21微重復可能在唐氏篩查高風險產前診斷指征中更易檢出。Xp22.31微缺失綜合征主要為X連鎖隱性遺傳，涉及STS，STS缺乏是導致X連鎖魚鱗病的主要原因，患者幾乎全部為男性，世界范圍內的患病率約為每2 000～6 000名男性中有1例患者［8］。本研究中3例X連鎖魚鱗病中，1例因胎兒超聲異常引產，2例新生兒已分娩。腎囊腫和糖尿病綜合征主要為17q12微缺失，且涉及肝細胞核因子1β（hepatocyte nuclear factor 1β，HNF1B）基因，其主要表現為泌尿生殖系統異常，尤其是腎囊腫，腎小球囊性病變和腎發育不良，外顯率為34.4%［6］。本研究中2例腎囊腫和糖尿病綜合征，1例B超未見異常，選擇繼續妊娠，新生兒未見異常；1例B超示胎兒雙腎發育異常，與其綜合征表現相符，已引產。DiGeorge綜合征為22q11.21微缺失。Agarwal等［9］研究發現，先天性心臟病與DiGeorge綜合征密切相關。本研究中的1例DiGeorge綜合征B超提示胎兒室間隔缺損，與上述研究表現相符，已引產。可見對于胎兒超聲提示心血管系統結構異常的羊水標本應盡早行CMA檢測。

3.4致病性CNVs與隨訪

本研究顯示，在17例致病性CNVs中，有8例新生兒出生，編號1、編號2均檢出魚磷病基因，詳細詢問病史，其母親為魚磷病基因攜帶者，且均有家族遺傳病史，胎兒均為男胎，出生后隨訪至4歲，均已出現魚鱗病皮膚癥狀。編號4檢出SHOX基因，SHOX基因為明確半劑量不足基因，與身材矮小有關，可伴有Leri-Weill軟骨生成障礙，出生后隨訪至4歲，其身高、體重、運動、體檢均良好。編號9檢出16p11.2微重復綜合征，主要表現為發育遲緩、孤獨癥傾向，外顯率為27.20%，出生后3個月時隨訪體檢正常，后失訪。編號10檢出16p13.11微缺失綜合征，主要表現為智力低下、癲癇，經驗證基因缺失源于表型正常的母親，外顯率為13.10%，出生后隨訪至3歲，無癲癇，智力、體檢均良好。編號11檢出腎囊腫和糖尿病綜合征，外顯率為34.40%，出生后隨訪到5歲，其血糖及腎臟B超均正常。編號13、編號14檢出22q11.21微重復綜合征，主要表現為智力低下、精神運動發育遲滯、生長緩慢，外顯率為21.90%，出生后隨訪到4歲，智力、身高、體重、運動均正常。由此可見，外顯率也是孕婦決定是否引產的重要考慮條件，臨床中應做到知情選擇，引產不是唯一的途徑。

3.5臨床意義不明CNVs與驗證情況

本研究顯示，在核型正常的794例羊水標本中，檢出12例臨床意義不明CNVs，檢出率為1.51%（12/794），與相關研究中CMA檢測臨床意義不明CNVs的檢出率1%～2%［10］基本相符。本研究顯示，CNVs片段大小范圍在369.00kb～5.70Mb，微重復9例，微缺失3例，以微重復為主；對7例胎兒的父母進行了外周血CMA驗證，結果顯示，其中4例遺傳自表型正常的母親，2例遺傳自表型正常的父親，且新生兒未見異常，判定為良性CNVs，另外1例為新發突變（編號20），新生兒有雙足外翻，考慮臨床意義仍不明確。因此，對于胎兒的CMA檢測結果，應結合父母標本進行驗證，有助于降低臨床意義不明CNVs比例，并完善相關數據庫，提高CMA檢測結果的準確性。

3.6純合區域與單親二倍體

本研究顯示，在核型正常的794例羊水標本中，檢出6例ROH異常CNVs。如果僅在1條染色體發現≥10Mb的ROH異常，應優先考慮UPD。目前已知6、7、11、14、15及20號染色體含有印跡致病基因，當發生UPD時認為是具有致病性［3］；其余染色體的UPD臨床意義均不明確，但有增加隱性遺傳病的風險。有研究顯示，6、20號染色體有UPD致病性［11-12］。本研究中ROH異常CNVs涉及2、4、5、6、20號染色體，編號34涉及父源性UPD（6），其與新生兒一過性糖尿病（OMIM 601410）有關，但父母標本未行驗證；編號32涉及父性源UPD（20），其可導致假性甲狀旁狀功能減退，經對父母標本進行驗證可排除UPD（20）。上述2例均選擇繼續妊娠，新生兒未見異常。

3.7小結

綜上所述，與染色體核型分析相比，CMA檢測可以檢出核型難以檢出的微缺失、微重復、UPD及雜合性缺失等基因組失衡現象。CMA檢測較染色體核型分析額外檢出率為4.41%，尤其對血清學篩查高風險及胎兒超聲異常的染色體微缺失、微重復的檢出，其疾病檢出率提高了2.14%。相對染色體核型分析，CMA技術是產前診斷核型檢查的有效補充。

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［專業責任編輯：于學文］

［中文編輯：王懿；英文編輯：劉昕田］