利用紫薯粉基質(zhì)ARTP誘變選育富硒酵母菌株

摘要：旨在通過ARTP誘變技術(shù)選育出能夠高效利用紫薯粉為營(yíng)養(yǎng)源并富集硒的釀酒酵母菌株，以期開發(fā)出新型的富硒紫薯酵母產(chǎn)品，推動(dòng)紫薯原料的高值化多元利用。以釀酒酵母CICC-1015為出發(fā)菌株，ARTP誘變結(jié)合硒耐受性梯度馴化篩選，選育出能夠在含有紫薯粉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并能夠耐受較高濃度亞硒酸鈉且進(jìn)行高效生物轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的酵母突變菌株。結(jié)果表明：以培養(yǎng)16 h的菌株作為誘變的出發(fā)菌株，ARTP處理時(shí)間110 s，致死率達(dá)到94.2%，既能夠較好的保持高突變頻率，又利于篩選有益突變菌株。篩選最高耐受200 mg·L?1亞硒酸鈉的突變菌株FJH-010，該突變株能在以10%紫薯分為原料的環(huán)境下生長(zhǎng)良好，生物量達(dá)到20.6 g·L?1（干重），硒含量達(dá)到4 245μg·g?1，其中有機(jī)硒占比95.3%，硒的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95.8%，而且遺傳穩(wěn)定性良好，顯示了較強(qiáng)的硒富集與轉(zhuǎn)化能力，為進(jìn)一步開發(fā)含有機(jī)硒的富硒紫薯酵母產(chǎn)品提供了新途徑。關(guān)鍵詞：ARTP誘變；富硒；紫薯；酵母.

中圖分類號(hào)：Q939.97文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0253?2301（2024）08?0061?06

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.08.008

梁玲，雷娟娟，黃銘珊，等.利用紫薯粉基質(zhì)ARTP誘變選育富硒酵母菌株[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2024，55（8）：61?66.

Breeding of Selenium-enriched Yeast Strain by ARTP Mutagenesis in Purple Sweet Potato Matrix

LIANG Ling1，LEI Juan-juan1，HUANG Ming-shan1，HUANG Qin-geng2，3*

（1.Fujian Health College，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350101，China;2.Qingyuan One Alive Institute of Biological Research Co.，Ltd.，Qingyuan，Guangdong 511500，China;3.Guangdong Rongda Biological Co.，Ltd.，Qingyuan，Guangdong 511500，China）

Abstract：This study aimed to breed the saccharomyces cerevisiae strain that could efficiently use the purple sweet potato powder as the nutrient source and enrich the selenium by ARTP mutagenesis technology，in order to develop the new selenium-enriched purple sweet potato yeast products and promote the high-value and diversified utilization of purple sweet potato raw materials.By taking the saccharomyces cerevisiae CICC-1015 as the original strain，and using the ARTP mutagenesis combined with the selenium tolerance gradient acclimation screening，the yeast mutant strain was selected which could grow in the medium containing purple sweet potato powder，and could tolerate the higher concentrations of sodium selenite and efficiently biotransform into the organic selenium.The results showed that the strain cultured for 16 h was used as the original strain formutagenesis.The ARTP treatment time was 110 s， and the lethality reached 94.2%，which could not only maintain the high mutation frequency，but also help to screen the beneficial mutant strains.The mutant strain FJH-010 with the highest tolerance to 200 mg·L?1 sodium selenite was screened.The mutant strain could grow well in the environment with 10%purple sweet potato powder as the raw material，with the biomass reaching 20.6 g·L?1（dry weight），and the selenium content reaching 4245μg·g?1.Among them，the proportion of organic selenium was 95.3%，the transformation rate of selenium reached 95.8%，and the genetic stability was good，showing the strong selenium enrichment and transformation ability，which would provide a new approach for the further development of the selenium-enriched purple sweet potato yeast products containing the organic selenium.

Key words：ARTP mutagenesis；Selenium-enriched；Purple sweet potato；Yeast

硒作為一種人與動(dòng)物不可或缺的微量元素，具備抗氧化、強(qiáng)化心血管、保護(hù)肝臟、抗癌及提升免疫力等多重功效。研究已證實(shí)，硒的缺乏與包括克山病、大骨節(jié)病及能量缺乏性營(yíng)養(yǎng)不良等在內(nèi)的超過40種疾病存在緊密聯(lián)系[1?3]。因此，科學(xué)合理地補(bǔ)充硒元素，對(duì)于維護(hù)并促進(jìn)人體健康具有至關(guān)重要的意義。在硒的補(bǔ)充策略上，有機(jī)硒相較于無機(jī)硒展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)性。無機(jī)硒雖可用作補(bǔ)充來源，但其存在的蓄積性毒性風(fēng)險(xiǎn)以及吸收利用率低等問題；而有機(jī)硒則以其高生物活性、無毒副作用、易于腸道吸收及高生物利用率等特點(diǎn)，成為更為理想的補(bǔ)硒選擇[4]。當(dāng)前，利用酵母作為生物轉(zhuǎn)化平臺(tái)，將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，是補(bǔ)硒領(lǐng)域的主要方法[5]。此方法通過向酵母菌培養(yǎng)基中添加無機(jī)硒源，借助微生物強(qiáng)大的代謝機(jī)制，促使硒元素與菌體內(nèi)蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)結(jié)合，這一過程有效規(guī)避了無機(jī)硒的潛在毒性，極大地提升了硒元素的安全性、吸收效率及生物利用度[6]。因此，富硒酵母被視為補(bǔ)硒元素的最佳途徑。在富硒酵母產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，酵母菌株的篩選與培育尤為關(guān)鍵。具體而言，菌株對(duì)無機(jī)硒的高耐受能力以及對(duì)有機(jī)硒的高效轉(zhuǎn)化能力，直接決定了產(chǎn)品的品質(zhì)與生產(chǎn)效率。因此，不斷優(yōu)化菌株特性，提升其對(duì)硒的轉(zhuǎn)化效率與穩(wěn)定性，將是推動(dòng)富硒酵母產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要方向。紫薯富含礦物質(zhì)、維生素、硒、鐵及花青素等有益成分，紫薯中的硒元素，被譽(yù)為“抗癌衛(wèi)士”，高效吸收后留存于血清，不僅助力心肌修復(fù)，還顯著增強(qiáng)免疫力，有效清除體內(nèi)自由基，從根源上抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制與分裂，可預(yù)防胃癌、肝癌等癌癥的發(fā)生[7?8]。獲得能夠利用紫薯為原料生產(chǎn)富硒酵母的菌株，可實(shí)現(xiàn)硒與紫薯營(yíng)養(yǎng)成分的有機(jī)結(jié)合，同時(shí)還能夠避免普通硒酵母所具有的濃厚酵母味道，實(shí)現(xiàn)硒酵母產(chǎn)品的優(yōu)化。

為了獲得能夠利用紫薯的酵母菌株，傳統(tǒng)選育方法有物理誘變及化學(xué)誘變，存在操作繁瑣，安全性低，且長(zhǎng)期重復(fù)使用易致突變效率低、突變譜窄、抗性飽和等問題。常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變系統(tǒng)能夠在常溫常壓下形成微生物細(xì)胞有效的DNA多樣性損傷，具有操作簡(jiǎn)便、安全性高、產(chǎn)生突變的多樣性大等特點(diǎn)，是非常安全高效的誘變系統(tǒng)[9?10]。因此，本研究以釀酒酵母（Saccharo-myces cerevisiae）CICC1015為出發(fā)菌株，采用ARTP誘變育種技術(shù)，旨在選育能夠以紫薯粉為原料進(jìn)行細(xì)胞代謝與繁殖，同時(shí)具有高濃度亞硒酸鈉耐受性的變株，借助酵母領(lǐng)域相對(duì)成熟的深層發(fā)酵工藝與技術(shù)，實(shí)現(xiàn)該酵母菌株在紫薯營(yíng)養(yǎng)素環(huán)境中將無機(jī)硒高效轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的生物合成過程，為富硒紫薯酵母的生產(chǎn)提供優(yōu)良的菌株。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1出發(fā)菌種釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1015，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。紫薯粉購(gòu)于市場(chǎng)的新鮮紫薯洗凈，切成薄片，45℃真空干燥12 h，粉碎后過60目篩，裝入密封袋，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.1.2培養(yǎng)基YPD（yeast extract peptone dextrose）培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L?1，葡萄糖20 g·L?1，酵母浸出粉10 g·L?1，pH 7.0，121℃滅菌20 min。YPD斜面培養(yǎng)基及固體平板培養(yǎng)基：蛋白胨20 g·L?1，葡萄糖20 g·L?1，酵母浸出粉10 g·L?1，瓊脂20 g·L?1，pH 7.0，121℃滅菌20 min。紫薯固體培養(yǎng)基：紫薯粉200 g·L?1，瓊脂20 g·L?1，pH自然，121℃滅菌20 min。紫薯液體培養(yǎng)基：紫薯粉100 g·L?1，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.1.3主要試劑與儀器（1）主要試劑：亞硒酸鈉（Na2SeO3）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；YPD培養(yǎng)基原料：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硒酸鈉（Na2SeO3）母液：稱取1 g Na2SeO3溶于10 mL水中，用0.22μm的針頭式過濾器過濾除菌，?4℃保藏。（2）主要儀器：ARTP-IIS型ARTP誘變儀：無錫源清天木生物科技有限公司；UV-2 100型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Mettler pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；DNP-9 052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SKY-211C恒溫振蕩器：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌懸液的制備取一環(huán)保藏于?80℃冰箱的釀酒酵母菌株CICC1015，接種至YPD斜面，30℃恒溫培養(yǎng)24 h后，用5 mL無菌水將菌苔洗脫，混勻，吸取1 mL菌懸液轉(zhuǎn)接至裝有30 mL液體YPD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，180 r·min?1振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到活化的菌液，置于離心機(jī)中4 000 r·min?1，10 min離心收集菌體，采用生理鹽水重懸，洗滌，重復(fù)離心洗滌3遍，以適量的生理鹽水調(diào)整菌液濃度為1.0×107個(gè)·mL?1，作為ARTP誘變的菌懸液。

1.2.2生長(zhǎng)曲線的繪制將上述活化后的菌液按照10%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r·min?1振蕩培養(yǎng)，設(shè)置三組重復(fù)，每隔4 h取樣，采用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm下的吸光值OD600，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制酵母菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.3出發(fā)菌株對(duì)亞硒酸鈉的耐受性試驗(yàn)在搖瓶中活化8h的菌液，加入亞硒酸鈉母液，使培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的終濃度分別為0、100、200、300、400、500、600μg·mL?1，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，測(cè)定OD600，計(jì)算致死率，確定出發(fā)菌株對(duì)亞硒酸鈉的耐受濃度，據(jù)此確定誘變篩選平板亞硒酸鈉的初始濃度。

1.2.4 ARTP誘變將制備好的誘變菌懸液加入終濃度為5%的甘油作為保護(hù)劑，取10μL菌懸液均勻涂于載片，參照ARTP誘變育種儀操作流程，將載片轉(zhuǎn)入操作倉(cāng)，以氦氣作為工作載氣，通氣量選擇10 L·min?1，功率選擇110 W，距離2 mm。處理時(shí)間設(shè)置為0、20、40、60、80、100、120、140、160和180 s，誘變結(jié)束后將載片轉(zhuǎn)入990μL無菌生理鹽水中，渦旋振蕩1 min，確保將菌體全部洗脫下來，然后稀釋涂布至紫薯篩選平板，30℃培養(yǎng)2 d至長(zhǎng)出單菌落，篩選能以紫薯為原料生長(zhǎng)的釀酒酵母菌株。平板菌落計(jì)數(shù)，以處理0 s的樣品為對(duì)照，計(jì)算致死率并繪制致死率曲線，選擇致死率為90%～95%的處理時(shí)間對(duì)菌株進(jìn)行誘變。

1.2.5酵母菌株的馴化篩選經(jīng)過ARTP誘變，在紫薯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，采用點(diǎn)植法將菌落點(diǎn)植于出發(fā)菌株最大耐受亞硒酸鈉濃度500μg·L?1的紫薯培養(yǎng)基平板進(jìn)行30℃恒溫培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后，進(jìn)一步點(diǎn)植于更高濃度的亞硒酸鈉的紫薯培養(yǎng)基平板，采用這種梯度馴化與選擇的方式，逐步獲得能夠在更高亞硒酸鈉濃度生長(zhǎng)的釀酒酵母變株。

將這些菌株接種含高濃度亞硒酸鈉的紫薯斜面培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)24 h，再經(jīng)傳代兩次，獲得斜面菌株。用5 mL無菌生理鹽水將斜面菌株洗脫下來，制備菌懸液（調(diào)整菌液濃度為107個(gè)·mL?1）。取菌懸液按照10%的接種量接入30 mL的紫薯液體培養(yǎng)基中（含200 mg·L?1的亞硒酸），30℃、200 r·min?1振蕩培養(yǎng)16 h作為種子培養(yǎng)液，然后取種子培養(yǎng)液按移種量20%接種于30 mL含200 mg·L?1亞硒酸鈉的紫薯液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min?1發(fā)酵36 h。培養(yǎng)結(jié)束后，6 000 r·min?1離心收獲細(xì)胞，60℃烘干至水分為8%，測(cè)定細(xì)胞的生物量（干重），測(cè)定硒含量及有機(jī)硒含量。

1.2.6硒的測(cè)定與轉(zhuǎn)化率計(jì)算硒含量、有機(jī)硒含量檢測(cè)參照文獻(xiàn)[11]。

硒轉(zhuǎn)化率（富硒效率）=（液體培養(yǎng)細(xì)胞干重中的硒含量/紫薯液體培養(yǎng)基中總的硒含量）×100%。1.2.7遺傳穩(wěn)定性研究將搖瓶液體培養(yǎng)篩選得到的富硒酵母菌株連續(xù)傳代多次，每一代測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物硒含量、有機(jī)硒含量以及細(xì)胞的生物量（干重），考察其遺傳穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)菌株的誘變效果有很大影響，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母菌活力強(qiáng)、代謝旺盛、對(duì)環(huán)境變化更為敏感，此時(shí)對(duì)酵母菌進(jìn)行誘變，有利于獲得損傷修復(fù)程度高、多樣化突變的誘變菌株庫(kù)。由圖1可知，活化后的酵母菌在YPD液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在0～4 h酵母菌處于適應(yīng)階段，生長(zhǎng)速度緩慢；4～20h是菌株的快速生長(zhǎng)階段，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；20～36h菌體數(shù)量變化不大，為穩(wěn)定期。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期，即培養(yǎng)16 h的酵母菌作為誘變的出發(fā)菌株。

2.2出發(fā)菌株對(duì)亞硒酸鈉的耐受性

培養(yǎng)基中高濃度的亞硒酸鈉有利于有機(jī)硒的富集，卻對(duì)菌體生長(zhǎng)具有抑制作用。篩選耐受較高濃度亞硒酸鈉的出發(fā)菌株有利于提高富硒量。由圖2可知，隨著培養(yǎng)基中亞硒酸鈉濃度不斷升高，菌體濃度不斷下降，在亞硒酸鈉濃度為500μg·L?1時(shí)，菌體已基本無法生長(zhǎng)。當(dāng)誘變后的菌株能在含500μg·L?1亞硒酸鈉的平板上長(zhǎng)出，說明該菌株基因可能產(chǎn)生了突變，使其能耐受高濃度的亞硒酸鈉。

2.3 ARTP誘變時(shí)間的選擇

根據(jù)ARTP誘變不同的時(shí)長(zhǎng)后涂布紫薯平板的菌落數(shù)，以未經(jīng)誘變的菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算不同處理時(shí)間的致死率，繪制致死率曲線。由圖3可知，ARTP處理70 s，致死率已經(jīng)達(dá)到了55.6%，處理110 s時(shí)，致死率達(dá)到94.2%，而處理120 s，致死率達(dá)到98.7%。為得到誘變損傷較多的菌株，且有足夠的菌株生長(zhǎng)，選擇致死率為94.2%，處理時(shí)間為110 s作為酵母菌株誘變的時(shí)間。

2.4耐受亞硒酸鈉酵母菌株的馴化

以CICC1015為出發(fā)菌株，采用110 s的誘變時(shí)間進(jìn)行ARTP誘變處理，涂布含500μg·L?1亞硒酸鈉的紫薯培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑取菌落點(diǎn)植于含600μg·L?1亞硒酸鈉的紫薯培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落后，繼續(xù)挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落點(diǎn)植更高亞硒酸鈉濃度的平板，采用這種梯度馴化與選擇的方式，逐步獲得能夠在200 mg·L?1亞硒酸鈉紫薯平板上生長(zhǎng)的釀酒酵母變株。

2.5富硒酵母菌株的篩選

為驗(yàn)證和篩選富硒能力強(qiáng)的菌株，選取在平板上生長(zhǎng)良好的菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，測(cè)定細(xì)胞的生物量（干重）、硒含量。由圖4可知，從硒含量看，經(jīng)過高濃度亞硒酸鈉的訓(xùn)化，搖瓶篩選的菌株硒含量均高于出發(fā)菌株，最高為FJH-010，硒含量達(dá)到4 245μg·g?1，較CICC1015提高7.1倍，其次是FJH-024，硒含量達(dá)到4 093μg·g?1，較CICC1015提高6.9倍；從生物量看，經(jīng)過誘變及高濃度硒訓(xùn)化后，誘變菌株的生物量均低于出發(fā)菌株，其中硒含量最高的FJH-010生物量為20.6 g·L?1，為出發(fā)菌株的92.8%，F(xiàn)JH-024的生物量為18.7 g·L?1，為出發(fā)菌株的84.2%，生物量最高的AYFX022為出發(fā)菌株的97.7%，但硒含量?jī)H為3 435μg·g?1，由此可見誘變的損傷具有多樣性。

由表1可見，誘變篩選菌株FJH-010的有機(jī)硒占比達(dá)到95.3%，硒的轉(zhuǎn)化率達(dá)到97.3%，而出發(fā)菌株的有機(jī)硒占比僅為90.6%，硒的轉(zhuǎn)化率為91.8%，誘變菌株展現(xiàn)了較強(qiáng)的富硒能力，并且有機(jī)硒的含量也明顯優(yōu)于出發(fā)菌株。

2.6富硒酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

遺傳穩(wěn)定性是誘變菌株優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)，將誘變株FJH-010在含Na2SeO3的紫薯培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)5代搖瓶發(fā)酵，測(cè)定硒含量，由圖5可知，從菌株形態(tài)特征看，F(xiàn)JH-010在傳代過程中穩(wěn)定性良好，菌落形態(tài)及顯微形態(tài)都沒有變化，而且硒含量變化幅度在3%以內(nèi)，體現(xiàn)了較好的遺傳穩(wěn)定性。

3討論與結(jié)論

在富硒酵母菌株的選育方面，孫朝陽等[12]利用NaN3誘變結(jié)合H2O2選擇壓力，實(shí)現(xiàn)了硒含量的顯著提升。李穎[13]則通過紫外誘變與抗性平板篩選，獲得了高硒含量且高生物量的MY-02菌株。而利用紫薯作為原料培養(yǎng)富硒酵母及運(yùn)用ARTP誘變選育富硒酵母菌株未見相關(guān)報(bào)道。

本研究通過ARTP誘變技術(shù)，成功選育出了能夠高效利用紫薯粉生長(zhǎng)并富集硒的突變株FJH-010。與原始菌株相比，F(xiàn)JH-010的硒富集能力提升了7.1倍，達(dá)到4 245μg·g?1，且有機(jī)硒占比高達(dá)95.3%，硒轉(zhuǎn)化效率也達(dá)到了95.8%，同時(shí)展現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。這一成果不僅為富硒酵母產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了新的菌株資源，也為紫薯資源的綜合利用開辟了新的途徑。ARTP誘變技術(shù)以其常溫常壓下的高效DNA損傷能力，為微生物育種構(gòu)建了龐大的突變庫(kù)，極大地促進(jìn)了優(yōu)良菌株的篩選進(jìn)程[14?15]。

在本研究中，通過合理的誘變時(shí)間選擇和梯度馴化策略，成功地從大量突變體中篩選出了性能優(yōu)異的FJH-010菌株。這一成果不僅豐富了富硒酵母菌株的種質(zhì)資源，也為后續(xù)的菌株改良和工業(yè)化應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。后續(xù)研究中將深入研究FJH-010的代謝機(jī)制，優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，以期實(shí)現(xiàn)更高的硒富集效率和更大的生物量產(chǎn)出。同時(shí)，還將積極探索將FJH-010應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的可能性，包括開發(fā)功能性食品、保健品以及農(nóng)業(yè)飼料添加劑等，以滿足市場(chǎng)對(duì)高質(zhì)量富硒產(chǎn)品的需求。鑒于ARTP誘變技術(shù)誘發(fā)的突變多樣性，計(jì)劃在后續(xù)研究中實(shí)施優(yōu)勢(shì)菌株的融合改組策略，以期融合多個(gè)優(yōu)良突變株的遺傳特性，培育出生物量與硒產(chǎn)量均優(yōu)的菌株。此外，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，本課題組還將關(guān)注其他新型誘變技術(shù)在菌株選育中的應(yīng)用，以期獲得更多具有優(yōu)良性狀的酵母菌株，推動(dòng)富硒酵母產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）