酶聯(lián)免疫吸附法在食品中重金屬殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

摘 要：酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）以其高特異性、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，在食品重金屬殘留檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本文綜述了ELISA檢測(cè)水產(chǎn)品中汞、谷物中鎘、蔬菜中鉛、奶制品中鉻和食用油中砷的研究進(jìn)展，重點(diǎn)闡述了抗原設(shè)計(jì)、抗體制備、樣品前處理和檢測(cè)條件優(yōu)化等關(guān)鍵技術(shù)。針對(duì)不同食品基質(zhì)，提出了進(jìn)一步提升ELISA檢測(cè)性能的建議，為食源性重金屬分析提供參考。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫吸附法；重金屬；食品安全

Abstract： Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） has shown broad application prospects in the field of heavy metal residue detection in food due to its advantages of high specificity and sensitivity. This article reviews the research progress on ELISA detection of mercury in aquatic products， cadmium in grains， lead in vegetables， chromium in dairy products， and arsenic in edible oils， and focuses on key technologies such as antigen design， antibody preparation， sample pretreatment， and optimization of detection conditions. Suggestions have been put forward to further improve the performance of ELISA detection for different food matrices， providing reference for foodborne heavy metal analysis.

Keywords： enzyme-linked immunosorbent assay; heavy metals; food safety

重金屬作為一類(lèi)有毒有害物質(zhì)，在食品中的殘留問(wèn)題日益受到人們的關(guān)注[1]。酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）以其高特異性、高靈敏度、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，在食品中重金屬殘留檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本文綜述了酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)食品中汞、鎘、鉛、鉻、砷等重金屬殘留的研究進(jìn)展，重點(diǎn)闡述了該方法在水產(chǎn)品、谷物、蔬菜、奶制品和食用油等典型食品基質(zhì)中的應(yīng)用。

1 食品中重金屬殘留類(lèi)別

常見(jiàn)的食源性重金屬包括汞、鎘、鉛、鉻、砷等，它們主要來(lái)源于環(huán)境污染和食品加工過(guò)程中的污染。汞在自然界廣泛存在，可通過(guò)生物富集進(jìn)入食物鏈，主要以甲基汞的形式殘留于魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)等水產(chǎn)品中，具有很強(qiáng)的生物毒性。鎘是一種致癌物質(zhì)，在植物性食品如谷物、蔬菜中含量相對(duì)較高，長(zhǎng)期攝入可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、腎功能損傷等。鉛作為神經(jīng)毒素，對(duì)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育危害尤為突出，易殘留于農(nóng)作物和畜禽產(chǎn)品中。鉻主要以六價(jià)鉻的形式呈現(xiàn)毒性，可通過(guò)工業(yè)污染進(jìn)入奶制品等食品中[2]。無(wú)機(jī)砷是一級(jí)致癌物，廣泛存在于水環(huán)境和土壤中，經(jīng)農(nóng)作物吸收、生物富集后可在米面油等食品中檢出。這些重金屬元素在食品加工、包裝、儲(chǔ)運(yùn)等環(huán)節(jié)也可能引入，如鎘可通過(guò)鍍層從金屬包裝遷移至食品中。

2 酶聯(lián)免疫吸附法的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)

ELISA是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫分析技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性、快速、簡(jiǎn)便等突出優(yōu)勢(shì)，在食品中重金屬殘留檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。與傳統(tǒng)的儀器分析方法如原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法相比，ELISA無(wú)須復(fù)雜的樣品前處理，可實(shí)現(xiàn)痕量重金屬的快速篩查。該方法利用重金屬與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫原，通過(guò)動(dòng)物免疫獲得特異性抗體，再借助酶標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大和比色檢測(cè)。例如，采用半抗原偶聯(lián)技術(shù)制備甲基汞-牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）免疫原，免疫小鼠獲得單克隆抗體，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，可實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中甲基汞的高靈敏檢測(cè)[3]。特別地，納米材料如量子點(diǎn)、金納米顆粒等的引入可賦予ELISA更優(yōu)異的性能，如采用量子點(diǎn)標(biāo)記抗體替代傳統(tǒng)的酶標(biāo)記，可獲得更寬的線(xiàn)性范圍和更低的檢出限。此外，ELISA與其他先進(jìn)技術(shù)如毛細(xì)管電泳、微流控芯片等聯(lián)用，有望實(shí)現(xiàn)重金屬殘留的自動(dòng)化、微型化和高通量檢測(cè)。ELISA在食源性重金屬分析中的應(yīng)用持續(xù)深入，新型抗原合成策略、信號(hào)放大技術(shù)、儀器集成方案不斷涌現(xiàn)，促進(jìn)了食品安全檢測(cè)向快速、便攜、智能化的方向發(fā)展。

3 酶聯(lián)免疫吸附法在食品重金屬殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 水產(chǎn)品中汞的檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附法在水產(chǎn)品中汞殘留檢測(cè)領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值。該方法以特異性抗體為核心，通過(guò)巧妙的抗原合成策略和免疫方案，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水體生物體內(nèi)甲基汞的高靈敏檢測(cè)。具體來(lái)說(shuō)，采用半抗原偶聯(lián)技術(shù)，以甲基汞為半抗原，以牛血清白蛋白為載體蛋白，制備甲基汞-BSA免疫原，經(jīng)小鼠免疫獲得單克隆抗體。借助該抗體，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，使樣品中游離的甲基汞與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量的抗體，通過(guò)酶促顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)換和定量分析[4]。該方法無(wú)須煩瑣的樣品前處理，可直接測(cè)定魚(yú)肉、貝類(lèi)等樣品中的甲基汞含量，線(xiàn)性范圍寬，重現(xiàn)性好，為水產(chǎn)品汞殘留的常規(guī)檢測(cè)提供了有力工具。此外，量子點(diǎn)標(biāo)記抗體、金納米顆粒信號(hào)放大等新技術(shù)與ELISA的融合，進(jìn)一步提升了檢測(cè)靈敏度和特異性[3]。這些技術(shù)創(chuàng)新為揭示水生食物鏈中汞的生物富集規(guī)律、評(píng)估水產(chǎn)品汞污染風(fēng)險(xiǎn)提供了新思路。

3.2 谷物中鎘的檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)谷物中鎘殘留的技術(shù)實(shí)施流程以半抗原分子的巧妙設(shè)計(jì)為起點(diǎn)，以Cd-EDTA-BSA復(fù)合物為免疫原，通過(guò)兔子的多次免疫、細(xì)胞融合和雜交瘤篩選等環(huán)節(jié)，可獲得高親和力、高特異性的抗鎘單克隆抗體[2]。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，游離鎘與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合該抗體，繼而通過(guò)酶促底物反應(yīng)引發(fā)比色信號(hào)的變化。為消除谷物基質(zhì)的干擾，樣品前處理是關(guān)鍵一環(huán)，采用EDTA-McIlvaine緩沖液超聲輔助提取，可有效釋放出谷物中的鎘離子。在此基礎(chǔ)上建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，操作流程簡(jiǎn)便，分析速度快，能夠滿(mǎn)足痕量鎘檢測(cè)的靈敏度要求。為進(jìn)一步提高檢測(cè)通量，可將ELISA與高通量檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，利用96孔微孔板實(shí)現(xiàn)樣品的并行分析。對(duì)包被條件、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間、顯色體系等參數(shù)進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化，可有效縮短單個(gè)樣品的分析周期。自動(dòng)洗板機(jī)、酶標(biāo)儀等儀器設(shè)備的引入，則實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過(guò)程的自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，顯著提升了檢測(cè)效率[5]。

3.3 蔬菜中鉛的檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)蔬菜中鉛殘留，以特異性識(shí)別鉛離子的單克隆抗體的制備為核心。以鉛-異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（Isothiocyanobenzylethyl Enediamine Tetraacetic Acid，ITCBE）螯合物為半抗原，偶聯(lián)牛血清白蛋白后免疫BALb/c小鼠，經(jīng)脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出能穩(wěn)定分泌抗鉛抗體的雜交瘤細(xì)胞株[1]。將該抗體應(yīng)用于競(jìng)爭(zhēng)ELISA體系，樣品中游離的鉛離子與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限量的抗鉛抗體，繼而通過(guò)抗體復(fù)合物與酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，引發(fā)顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺判定鉛的含量。蔬菜基質(zhì)復(fù)雜多樣，采用合理的樣品前處理方案至關(guān)重要。以檸檬酸-硫脲溶液超聲輔助提取葉菜中的鉛，可有效破壞植物細(xì)胞壁，釋放螯合態(tài)鉛，獲得理想的提取效率。根莖類(lèi)蔬菜富含淀粉和多糖，利用蛋白酶水解預(yù)處理，能夠去除非特異性干擾，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。需要注意的是，通過(guò)包被抗原濃度、抗體用量、酶標(biāo)記物選擇等參數(shù)的優(yōu)化組合，能夠顯著提升檢測(cè)靈敏度和特異性，降低檢出限。引入自動(dòng)化樣品處理平臺(tái)、智能溫控系統(tǒng)、多功能酶標(biāo)儀等設(shè)備，可實(shí)現(xiàn)蔬菜鉛殘留檢測(cè)的高通量、標(biāo)準(zhǔn)化分析，為批量化檢測(cè)提供技術(shù)保障。

3.4 奶制品中鉻的檢測(cè)

將酶聯(lián)免疫吸附法應(yīng)用于奶制品中鉻殘留檢測(cè)，技術(shù)實(shí)施流程環(huán)環(huán)相扣。起始于特異性識(shí)別六價(jià)鉻的單克隆抗體的制備，以六價(jià)鉻-ITCBE螯合物為半抗原，經(jīng)牛血清白蛋白偶聯(lián)后免疫BALB/c小鼠，融合脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，篩選出高親和力的抗鉻抗體分泌細(xì)胞株[4]。將該抗體引入間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA體系，樣品中游離的六價(jià)鉻與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗鉻抗體，再與酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，觸發(fā)顯色反應(yīng)，根據(jù)吸光度值判定六價(jià)鉻含量。奶制品基質(zhì)復(fù)雜，富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)等干擾物質(zhì)，樣品前處理策略的優(yōu)化非常重要。采用Tris-HCl緩沖液超聲輔助提取，可有效釋放出奶制品中與蛋白質(zhì)結(jié)合的六價(jià)鉻。引入蛋白酶K酶解預(yù)處理，能夠水解樣品中的蛋白質(zhì)，去除非特異性干擾。此外，巧妙利用固相萃取小柱富集凈化樣品，能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)的精準(zhǔn)度。需要特別注意的是，通過(guò)包被抗原濃度、酶標(biāo)記物種類(lèi)、底物反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)的系統(tǒng)優(yōu)化，可顯著提升檢測(cè)靈敏度，將檢出限降低至納克級(jí)。聯(lián)用自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、密閉恒溫反應(yīng)器、高分辨率酶標(biāo)儀等設(shè)備，可實(shí)現(xiàn)牛奶、奶粉等樣品中六價(jià)鉻的規(guī)模化篩查，為奶制品的質(zhì)量控制提供有力支撐。隨著量子點(diǎn)標(biāo)記、磁性微球分離等新技術(shù)與ELISA的緊密結(jié)合，有望開(kāi)發(fā)出更加靈敏、快速、高通量的奶制品鉻殘留檢測(cè)新策略，助力食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控。

3.5 食用油中砷的檢測(cè)

將酶聯(lián)免疫吸附法應(yīng)用于食用油中砷殘留檢測(cè)，需要對(duì)技術(shù)實(shí)施流程的每一個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化和嚴(yán)格把控?？股榭贵w的制備是整個(gè)分析過(guò)程的核心，以三價(jià)砷-二甲基砷（Dimethylarsinic Acid，DMA）螯合物為半抗原，經(jīng)EDC活化并與載體蛋白如血藍(lán)蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH）偶聯(lián)，制得人工合成的免疫原。以該免疫原多點(diǎn)多次免疫家兔，經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)與雜交瘤篩選，獲得能穩(wěn)定分泌高親和力抗砷單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株[2]。將制備的抗體應(yīng)用于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)體系，利用游離砷與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗砷抗體，再通過(guò)酶標(biāo)記的二抗與抗原抗體復(fù)合物特異性結(jié)合引發(fā)顯色反應(yīng)，根據(jù)吸光度值的高低判定樣品中砷的含量。為了從復(fù)雜的食用油基質(zhì)中富集提取游離態(tài)砷，需對(duì)樣品前處理方案進(jìn)行優(yōu)化。采用去污劑輔助的乳化萃取技術(shù)，利用砷在兩相體系中的分配行為，將其從含油基質(zhì)轉(zhuǎn)移至水相中，再經(jīng)固相萃取小柱凈化、濃縮，獲得適合免疫分析的待測(cè)液。在建立檢測(cè)方法時(shí)，通過(guò)包被抗原濃度、酶標(biāo)記物種類(lèi)、顯色底物類(lèi)型等參數(shù)的篩選組合，并優(yōu)化競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)溫度、時(shí)間、緩沖體系pH值等條件，可顯著提高檢測(cè)靈敏度和特異性，最終建立起適合食用油基質(zhì)的砷殘留檢測(cè)新方法。

4 提高酶聯(lián)免疫吸附法應(yīng)用效果的建議

為進(jìn)一步提升酶聯(lián)免疫吸附法在食品重金屬殘留檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用效果，可從以下幾個(gè)方面著手。①抗原設(shè)計(jì)與抗體制備是關(guān)鍵所在，采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)與分子對(duì)接技術(shù)，優(yōu)選出高度模擬重金屬離子空間構(gòu)象的半抗原分子，并通過(guò)定點(diǎn)突變和體外親和力成熟等技術(shù)獲得高特異性識(shí)別重金屬的單克隆抗體，可從源頭上提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。②樣品前處理策略的創(chuàng)新也非常重要，針對(duì)不同食品基質(zhì)選擇合理的提取方案，如超聲輔助提取、微波消解、離子液體萃取等，可有效減少基質(zhì)干擾，提高待測(cè)物的回收率。③信號(hào)放大技術(shù)的引入能夠突破酶聯(lián)免疫法的靈敏度瓶頸，利用納米材料的獨(dú)特性質(zhì)，如納米金的表面等離子體共振效應(yīng)、量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)等，構(gòu)建新型信號(hào)放大系統(tǒng)，將檢測(cè)靈敏度提高數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)。利用核酸適配體、多肽適配體等特異性結(jié)合重金屬離子，可克服抗體制備周期長(zhǎng)、批間差異大等不足，實(shí)現(xiàn)重金屬的快速、靈敏檢測(cè)。④將酶聯(lián)免疫法與其他先進(jìn)分析技術(shù)聯(lián)用，如毛細(xì)管電泳、微流控芯片、生物傳感器等，可發(fā)揮協(xié)同增效作用，實(shí)現(xiàn)重金屬殘留的自動(dòng)化、微型化、現(xiàn)場(chǎng)化快速檢測(cè)，為食品安全監(jiān)管提供更加高效、快捷的技術(shù)手段。

5 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)抗原分子設(shè)計(jì)、抗體制備、新型標(biāo)記物和信號(hào)放大系統(tǒng)的優(yōu)化組合，ELISA方法不斷突破檢測(cè)靈敏度瓶頸。未來(lái)，抗原合成、適配體篩選等生物技術(shù)的引入，有望進(jìn)一步拓展ELISA在食源性重金屬分析領(lǐng)域的應(yīng)用，為保障食品安全提供更加強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

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