卡格列凈減輕心肌梗死后細胞凋亡及炎癥反應改善預后

【摘要】目的 探究在心肌梗死（MI）后使用卡格列凈（CANA）對心臟炎癥反應及細胞凋亡的作用。方法 選用15只8～10周齡C57/BL6小鼠（SPF級），用抽簽法隨機抽取5只小鼠為Sham組（假手術+生理鹽水灌胃），剩余10只小鼠通過結扎左冠狀動脈前降支的方法制作MI模型，制作成功后的10只MI小鼠隨機分為2組：MI組（生理鹽水灌胃）、CANA+MI組（CANA灌胃），每組5只。CANA+MI組小鼠以20 mg/（kg·d^-1）卡格列凈灌胃4周，Sham組及MI組則使用同等體積生理鹽水灌胃4周。4周后，使用小鼠超聲機測量左室收縮末期內徑及左室射血分數。蘇木精染色、Tunel染色用于明確心臟結構及MI后細胞凋亡狀況。IF免疫熒光染色用于檢測MI后心臟炎癥反應程度。Western blotting用于檢測炎癥及凋亡相關蛋白表達水平。結果 與MI組相比，CANA+MI組左室射血分數升高、梗死面積減小。Tunel染色顯示，CANA+MI組小鼠MI邊緣區凋亡細胞數量較MI組顯著減少，相應促凋亡蛋白Bax表達降低，抑凋亡蛋白Bcl-2表達升高。CANA+MI組小鼠CD3⁺T細胞、F480⁺巨噬細胞和LY6G⁺中性粒細胞數量較MI組明顯減少，相關蛋白p-P65、p-IκBα表達量明顯降低。結論 CANA抑制了MI后心臟炎癥反應，減輕了細胞凋亡。

【關鍵詞】卡格列凈；炎癥反應；心肌梗死；細胞凋亡

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.04.018

Canagliflozin Alleviates Apoptosis and Inflammation After

Myocardial Infarction and Improves Prognosis

LI Ming，GAO Jixian，WU Bing，LIU Xiaoxiong，XIA Hao

（Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Cardiovascular Research Institute，Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Cardiology，Wuhan 430060，Hubei，China）【Abstract】Objective To investigate the effect of canagliflozin（CANA）on cardiac inflammatory response and apoptosis after myocardial infarction （MI）.Methods This study selected 15 C57/BL6 mice （SPF grade） aged 8～10 weeks，and randomly selected 5 mice as the Sham group （sham surgery+saline gavage） using a lottery method.The remaining 10 mice were used to create an MI model by ligating the anterior descending branch of the left coronary artery.After successful production，the 10 MI mice were randomly divided into two groups：the MI group （saline gavage） and the CANA+MI group （Canagliflozin gavage），with 5 mice in each group.The mice in the CANA+MI group were gavaged with 20 mg/（kg·d^-1） of Canagliflozin for 4 weeks，while the Sham and MI groups were gavaged with the same volume of physiological saline for 4 weeks.After 4 weeks，left ventricular end systolic diameter and left ventricular ejection fraction were measured using a mouse ultrasound machine.Hematoxylin（HE staining） and Tunel staining are used to clarify the cardiac structure and cell apoptosis status after MI.IF immunofluorescence staining is used to detect the degree of cardiac inflammatory response after MI.Western blotting is used to detect the expression levels of inflammation and apoptosis related proteins.Results Compared with the MI group，left ventricular ejection fraction increased and infarct size decreased in CANA+MI group.Tunel staining showed that the number of apoptotic cells in the MI margin area of the CANA+MI group mice was significantly reduced compared to the MI group，with a corresponding decrease in the expression of pro apoptotic protein Bax and an increase in the expression of anti apoptotic protein Bcl-2.The number of CD3⁺ T cells，F480⁺ macrophages，and LY6G⁺ neutrophils in the CANA+MI group mice was significantly reduced compared to the MI group，with associated proteins p-P65，p-IκBα.The expression level was significantly reduced.Conclusion Canagliflozin inhibits cardiac inflammatory response after MI and reduces cell apoptosis.

【Keywords】Canagliflozin；Inflammatory response；Myocardial infarction；Apoptosis

心血管疾病仍然是世界上人類死亡的主要原因之一，而心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心血管疾病中最嚴重的表現，在發達國家中每年因急性MI造成的死亡人數超過1/3^[1]。盡管越來越多的生活干預及治療方法使65歲以上老年人急性MI的死亡率有所降低，但65歲以下的男性及女性心血管事件發生率并沒有類似的下降^[2]，因此MI對人類的健康仍然有著重大威脅，尋找新的治療方案及作用靶點勢在必行。

鈉-葡萄糖共轉運蛋白2抑制劑（sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor，SGLT2i）最初被發現是一種治療2型糖尿病的藥物，通過促進尿液中的糖及鈉的排泄，來發揮降糖作用。后來具有重要意義的臨床試驗EMPA^[3]和CANVAS ^[4]證實了SGLT2i在2型糖尿病高危患者中具有顯著心血管益處。最近的研究^[5]證明長期口服卡格列凈（canagliflozin，CANA）發揮心血管保護作用并不受體內血糖的影響。CANA發揮作用可能與多種因素相關，例如抗炎、抗氧化應激、心肌重構和離子代謝等。因此，SGLT2i發揮心血管益處的具體機制仍不明確，本研究試圖探索CANA影響非糖尿病MI小鼠的炎癥反應、心肌細胞凋亡及心臟重構的相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8～10周齡雄性C57/BL6小鼠（SPF級）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（許可證號：SCXX2021-0006），所有動物均飼養于SPF級環境中，予以12 h光照及無光照環境養育，環境濕度50%～80%，溫度21～23 ℃，予以普通食物飼養。本實驗采用的動物實驗方案經武漢大學人民醫院動物保護與使用委員會批準[倫理編號：WDRM動（福）20211203D號]。

1.1.2 試劑與儀器

GAPDH抗體（AC001）、p-P65抗體（AP1294）、p-IκBα抗體（AP0707）、Bcl-2抗體（A19693）、HRP山羊抗兔IgG二抗、TRIzol（RK30129）均購自于武漢愛博泰克生物（Abclonal）。抗Bax一抗（GB114122）、RIPA裂解液（G2002）、5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、Servicebio RT First Stand cDNA Synthesis Kit、Servicebio 2*SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒（Low ROX）均購自于武漢塞維爾生物科技有限公司（Servicebio）。

1.2 方法

1.2.1 動物MI模型及給藥

小鼠通過腹腔注射3%戊巴比妥鈉（90 mg/kg）進行麻醉，剔除左側胸部體毛且使用酒精對相應部位進行消毒，將其仰臥位固定于手術臺上，然后使用小動物呼吸機（Kent Scientific VFA-23-BV型）保證通氣。在胸骨左緣第3、4肋間切開，逐步暴露心臟，使用7-0絲線結扎左前降支，結扎后可以發現結扎部位心肌變白或者顏色變淺，接著逐步縫合，抽出殘存空氣后關閉胸部。術后將小鼠放于加熱板上，完全蘇醒前將小鼠放回獨立通氣的籠內。Sham組小鼠進行相同操作，但不進行結扎。在術后第3天開始，CANA+MI組小鼠每天行CANA灌胃處理[20 mg/（kg·d^-1）]，持續4周^[6]。Sham組及MI組每天以等量生理鹽水進行灌胃，持續4周。

1.2.2 小鼠心臟超聲檢查

4周后小鼠通過吸入2%異氟醚進行麻醉，通過小動物高分辨超聲成像采集心臟的長軸及短軸圖像，測量出左室收縮末期內徑，計算左室射血分數。

1.2.3 免疫熒光染色

取出術后4周小鼠心臟，先用生理鹽水取出殘存血液，再使用10%氯化鉀溶液浸泡使心臟停搏于舒張期，用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（D4054，Bioscience，中國）對細胞核進行標記。最后在熒光顯微鏡下進行圖像采集，用Image J軟件進行定量分析。

1.2.4 蘇木精染色

用準備好的石蠟切片進行二甲苯透明、梯度酒精脫水、蘇木精染色、鹽酸酒精分化、清洗后伊紅染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明等步驟后，進行封片，最后于顯微鏡下觀察。使用Image J軟件進行計算左心室梗死面積。

1.2.5 Tunel染色

將MI后4周小鼠心臟取出，使用Tunel染色對MI邊緣區凋亡心肌進行檢測，應用ApopTag Plus熒光素原位凋亡檢測試劑盒（S7111，Millipore）進行染色，隨后使用熒光顯微鏡下進行圖像采集，用Image J軟件進行定量分析。

1.2.6 Western blotting檢測

首先從心臟心室組織（MI小鼠則為MI邊緣區）中提取總蛋白。將準備好的心臟組織放入蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物中，經過研磨、離心后，取上清液加入蛋白上樣緩沖液后金屬浴100 ℃10 min，提取好的蛋白使用BCA蛋白測定試劑盒（Servicebio）測定蛋白濃度。蛋白通過10% SDS-PAGE（Servicebio）進行電泳分離，并轉移到聚偏氟乙烯膜上，進行封閉及三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗，然后放入對應一抗在4 ℃冰箱中孵育過夜。隨后，將聚偏氟乙烯膜與相應二抗在室溫下孵育90 min。最后在Bio-Rad檢測系統上使用增強化學發光將圖像可視化。根據目的條帶與加載控制的灰度值比采用Image J軟件評估蛋白的相對表達量。

1.3 統計學處理

應用GraphPad Prism 9統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用Students’t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CANA減輕MI后MI面積和心功能障礙

MI后4周，HE染色結果顯示，與MI組相比，CANA+MI組小鼠MI面積明顯減少（圖1A、1B），同時進行的小鼠心臟超聲結果顯示（圖1C、1D及1E），與MI組對比，CANA+MI組小鼠的左室射血分數顯著提高。綜上所述，這些數據表明，CANA可以減少MI后的梗死面積，改善心功能，有利于預后。

2.2 CANA減輕MI后心肌細胞凋亡

細胞凋亡是MI后梗死面積大小與患者死亡的主要原因。因此筆者通過Tunel染色進一步研究CANA是否減少MI邊緣區細胞凋亡。如圖2A、2B所示，Sham組小鼠Tunel陽性細胞極少，且各組間差異沒有統計學意義，MI組小鼠MI邊緣區凋亡細胞數量明顯增加。而相比于MI組小鼠，CANA+MI組小鼠的凋亡細胞數量明顯減少。為了收集更多的證據證實CANA減輕MI后心肌細胞凋亡，筆者檢測了相關因子蛋白水平。Western blotting結果顯示，相比于MI組，CANA+MI組小鼠促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制促凋亡蛋白Bax的表達（圖2C、2D）。這表明CANA可以減輕MI后心肌細胞凋亡。

2.3 CANA減輕MI后炎癥反應

由于MI的發展過程中，持續的炎癥反應會引起大量免疫細胞及炎性細胞浸潤，加重心肌細胞凋亡及心功能損傷，因此探究CANA對MI后炎癥反應的影響。如圖3A、3B所示，與MI組小鼠相比，CANA+MI組小鼠減輕了MI邊緣區的炎癥反應，抑制了炎癥細胞聚集，CD3⁺T細胞、F480⁺巨噬細胞及LY6G⁺中性粒細胞明顯減少。為了收集更多CANA干預MI炎癥反應的證據，筆者對炎癥的經典通路核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）進行了Western blotting分析，圖3C、3D表明，與MI組相比，CANA+MI組小鼠的p-P65及p-IκBα水平明顯降低。上述結果表明，CANA可以通過調控NF-κB通路來減輕MI后心臟炎癥反應。

3 討論

在MI發生以后，梗死心臟的修復依賴于一個高度協調的反應，這包括炎癥細胞和間充質細胞的連續募集和清除^[7]。梗死愈合可以分為三個不同但又相互重疊的階段：炎癥期、增殖期和成熟期^[8]。在炎癥期中，壞死的細胞釋放危險信號激活受體系統，如Toll樣受體、晚期糖基化終產物受體、白細胞介素（interleukin，IL）等，這些受體又通過不同的方式激活下游促炎級聯反應，引起強烈的炎癥反應。大量的免疫細胞及炎性細胞（巨噬細胞）浸潤于梗死心肌中，炎性巨噬細胞有助于消化和清除受損的細胞及細胞外基質，但同時分泌炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α、IL-1β、IL-6和IL-12，這些炎癥因子在長時間持續的炎癥反應中也加重心肌細胞凋亡及心功能損傷^[9-11]。激活的多種受體系統中，NF-κB轉錄因子的激活涉及多種細胞類型，在調節炎癥反應、細胞黏附、生存和生長控制多個方面起著重要作用。有大量的研究報告與上述對應，NF-κB缺失在再灌注梗死模型中可以減少梗死面積、改善心功能、降低促炎細胞因子水平^[12]。近年來，關于SGLT2i通過抑制NF-κB通路減輕炎癥反應的研究大量報道^[13-15]。在本次研究中，筆者探究了MI發生以后，CANA通過抑制NF-κB通路，也就是抑制p-IκBα的磷酸化，從而降低P65活化，最終減輕了MI后炎癥反應，改善了預后。

炎癥反應發生以后，MI區的梗死細胞及細胞質基質碎片被清除，但長時間持續的炎癥反應使促炎介質的表達增強，反而可能會激活促凋亡通路，誘導更多的心肌細胞損失，這也是MI后心肌細胞損失的主要原因。細胞凋亡的激活也決定了MI后的心臟功能以及MI后心力衰竭的發生。據相關文獻^[14，16-17]報道，在葡萄糖脂毒性誘導的心肌模型、阿毒素誘導的心肌缺血再灌注模型中，CANA等SGLT2i均減輕了心肌細胞凋亡。在其他領域中，同樣有SGLT2i減輕細胞凋亡，保護機體功能的研究報道^[18-19]。細胞凋亡的原因是促凋亡及抗凋亡相關蛋白之間的平衡失衡。結果表明，CANA通過抑制促凋亡蛋白Bax、促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達而減輕心肌細胞的凋亡。

目前關于SGLT2i在心力衰竭中的益處已被證實^[20-22]，而SGLT2i在MI中的作用仍不明確。本研究在動物實驗中初步說明了CANA可以通過抑制MI后心臟炎癥反應及心肌細胞凋亡，從而改善心臟功能改善預后，為MI治療過程中使用SGLT2i提供了一定支持，有潛力成為MI治療過程中的新型藥物，不足的是CANA發揮作用的具體分子機制需要進一步研究。

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收稿日期：2023-11-29