食品微生物檢測中分子診斷技術的優化

摘 要：隨著現代食品工業的快速發展，食品安全問題得到社會的廣泛關注。食品中微生物污染是影響食品安全的主要因素之一，因此對食品中微生物的檢測十分重要。近年來，隨著分子生物學的發展，以聚合酶鏈式反應、核酸雜交、基因芯片等為代表的分子診斷技術逐漸應用于食品微生物檢測領域。本文在介紹食品微生物檢測中常用分子診斷技術的基礎上，總結出分子診斷技術應用中存在的問題，并針對性地提出優化分子診斷技術的建議，以期為進一步提升食品微生物檢測水平提供參考。

關鍵詞：食品微生物檢測；分子診斷技術；優化建議

Optimization of Molecular Diagnostic Techniques in the Detection of Food Microorganisms

MA Yafei

（Ye County Food Inspection and Testing Center， Pingdingshan 467200， China）

Abstract： With the rapid development of modern food industry， food safety has received widespread attention from the society. Microbial contamination in food is one of the main factors threatening food safety， so the detection of microorganisms in food is very important. In recent years， with the vigorous development of molecular biology， molecular diagnostic technologies represented by polymerase chain reaction， nucleic acid hybridization and gene chip have been gradually applied in the field of food microbial detection. In this paper， on the basis of introducing the commonly used molecular diagnostic technologies in food microbial detection， the problems in the application of molecular diagnosis technology are summarized， and some suggestions to optimize the molecular diagnosis technology are put forward， in order to provide reference for further improving the level of food microbial detection.

Keywords： food microbial detection; molecular diagnostic technology; optimization suggestions

食品安全關乎著人們的健康和社會穩定。食品中的微生物污染是導致食源性疾病的主要原因，及時準確地檢測食品中的致病微生物，對保障食品安全、控制食源性疾病的發生與流行具有重要作用[1]。傳統的食品微生物檢測方法主要依賴于微生物的培養和生化反應，存在檢測周期長、靈敏度低等缺點，難以滿足現代食品安全監管的需求。近年來，隨著分子生物學的發展，一系列分子診斷技術如聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）、熒光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）、核酸雜交、基因芯片等被引入食品微生物檢測領域。這些技術不依賴于微生物培養，可直接從食品基質中提取核酸進行檢測，大大縮短了檢測周期，提高了檢測靈敏度和特異性。但在分子診斷技術的實際應用中，仍存在不少障礙和誤區，限制了其性能的充分發揮[2]。

1 食品微生物檢測中的常用分子診斷技術

1.1 聚合酶鏈式反應

PCR技術憑借其操作簡便、靈敏度高、特異性強等優點，已成為食品微生物檢測領域的常用分子診斷方法。PCR技術是指利用一對特異性引物，在DNA聚合酶的作用下，通過連續的變溫過程實現目標DNA片段的指數擴增。這一方法有效彌補了傳統微生物培養技術檢測周期長、靈敏度低等缺陷，提高了食品致病菌的檢出效率。

然而，傳統PCR技術仍存在一些不足之處。①PCR僅能對目標微生物進行定性檢測，無法準確反映食品中微生物的含量水平。②PCR對反應條件高度敏感，易受外源DNA等因素的干擾而出現假陽性結果。針對上述局限，研究者開發了多種PCR衍生技術，如熒光定量PCR、巢式PCR、多重PCR等，進一步拓展了PCR技術的應用范圍和靈活性[3]。

1.2 熒光定量PCR

qPCR是在傳統PCR技術基礎上進一步發展的新一代分子診斷技術。qPCR引入熒光標記物，可在擴增過程中實時監測每個循環的熒光信號變化，據此估算出樣品中目標微生物的起始含量。與傳統PCR技術相比，qPCR技術最大的優勢在于實現了病原菌的絕對定量或相對定量，為精準評估食品微生物污染狀況提供了重要的技術手段。

目前，qPCR已被廣泛應用于食品中多種致病菌的高通量篩查和含量分析。例如，研究者利用qPCR技術對速凍水餃、生鮮乳等樣品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌進行了快速定量檢測，靈敏度在10～102 CFU·g-1（CFU·mL-1）[4]。這些結果表明，qPCR技術有望成為食品微生物檢測的“金標準”，但qPCR對實驗操作和環境條件要求較高，所以應注意規范化操作，提高檢測的精密度和準確度。

1.3 核酸雜交

核酸雜交技術是基于核酸分子間特異性堿基配對原理而建立的另一類重要的分子診斷方法。該方法以人工合成的核酸探針為雜交試劑，與樣品中的目標序列進行互補配對，再通過檢測雜交復合物的信號強度判斷目標微生物的存在情況及含量。斑點雜交、Southern 雜交、原位雜交等是目前應用較為成熟的核酸雜交技術。

核酸雜交具有操作相對簡便、重復性好，無須對微生物進行復雜培養等優點，在食品致病菌快速篩查方面有其獨特的優勢。但傳統核酸雜交儀器依賴放射性同位素標記，存在污染環境、危害人體健康等風險。此外，核酸雜交的靈敏度相對較低，在復雜食品基質中容易出現漏檢問題。為解決上述問題，研究者開發了多種新型核酸探針，如肽核酸（Peptide Nucleic Acids，PNA）探針、量子點標記探針等，明顯提高了核酸雜交檢測食源性病原菌的靈敏度和特異性。

1.4 基因芯片

基因芯片是繼PCR和核酸雜交之后新一代高通量分子診斷技術。基因芯片可在一張芯片上整合成百上千個探針，實現對多種微生物的同時分析。根據芯片類型和用途，基因芯片可分為基因表達芯片、基因分型芯片、比較基因組雜交芯片等不同形式。基因芯片技術的發展，為實現食品微生物的多菌種同檢和溯源分析奠定了基礎。基因芯片檢測通量高、特異性強，可以對多個食品樣品進行并行分析，大大提高了檢測效率。研究表明，16S核糖體RNA基因（16S ribosomal DNA，16S rDNA）芯片可實現6種食源性致病菌的同時定性定量檢測，靈敏度可達103 CFU·mL^-1，具有良好的應用前景[5]。但基因芯片儀器和試劑價格昂貴，數據分析流程復雜，一定程度上限制了其在食品檢測領域的推廣。

2 分子診斷技術在食品微生物檢測應用中存在的問題

2.1 樣品處理方法不當

樣品處理是食品微生物分子檢測的關鍵環節，直接影響后續核酸提取和擴增效率。然而，食品基質成分復雜多樣，含有多種PCR抑制物質，如脂肪、蛋白質、多糖等。若這些抑制物質未能有效去除，會極大干擾核酸提取過程，導致提取效率低下，甚至出現假陰性結果。此外，不同的食品基質中抑制物質的種類和含量存在較大差異，若采用統一的樣品處理方法，很難滿足不同基質的需求。樣品處理方案的選擇和優化對食品微生物核酸提取效果有一定影響。例如，市售DNA提取試劑盒雖然操作簡便，但針對某些復雜基質（如發酵乳制品）缺乏專一性，導致提取效果不佳。若樣品處理不當，PCR檢測靈敏度可能會降低1～2個數量級，甚至完全檢測不到目標菌[6]。

2.2 引物/探針設計缺乏特異性

引物和探針是PCR和核酸雜交反應的核心組分，其設計的科學性和特異性直接關系到分子檢測的靈敏度和準確性。理想的引物和探針應具有以下特點。①特異性強，只與目標基因結合，不與其他非特異性序列雜交。②引物間不能形成二聚體，避免競爭性擴增。③引物和模板間不能形成穩定的發夾結構，影響擴增效率。然而，在實際引物/探針設計中，很難同時滿足以上特點，從而影響了分子檢測的特異性和重復性。寬譜引物雖然可同時檢測多個菌種，但特異性差，容易擴增出目標菌以外的條帶，影響檢出結果的準確性。引物自身二級結構如發夾、自身互補等會降低有效引物的濃度。探針與引物間的不合理設計也會產生干擾信號，影響雜交效率。

2.3 擴增條件未優化

PCR反應對擴增條件高度敏感，退火溫度、延伸時間、鎂離子濃度等因素的微小變化都會影響擴增效率和特異性。當退火溫度過低時，引物易發生非特異性結合，產生額外條帶；退火溫度過高則會降低引物結合效率，減少目標產物的生成量。鎂離子濃度過低會抑制DNA聚合酶活性，過高則易產生非特異性擴增。延伸時間不足，長片段模板來不及完全擴增；延伸時間過長，非特異性產物會大量積累。以上問題表明，單純依賴于經驗設置PCR參數，很難達到最佳擴增效果。而許多研究者卻忽視了食品基質復雜性對擴增條件的影響，盲目照搬文獻中的反應體系，從而影響檢測的靈敏度和特異性。

2.4 缺乏必要的陽性對照和陰性對照

陽性和陰性對照是保證分子診斷結果可靠的重要步驟。在食品微生物核酸檢測中，陽性對照主要用于排除假陰性，評估擴增反應的有效性；而陰性對照則用于監控污染，識別假陽性信號。在理想情況下，每批次檢測都應設置陽性和陰性對照，并全程監控檢測過程。然而，在實際工作中，陽性/陰性對照會出現缺失現象，這是導致分子檢測失誤的重要原因之一。導致這一問題的原因是多方面的。①某些實驗室受限于成本和操作難度等因素，未使用標準菌株和質控品，因此缺乏可靠的陽性對照來源。②在核酸提取環節，內參基因是核酸提取和PCR反應的有效性指標，然而很多檢測方案并未涵蓋內參對照，無法及時發現核酸提取失敗或PCR抑制等問題。③在擴增環節，交叉污染是導致假陽性的常見原因，但由于陰性對照的缺失，這些污染問題很難被及時發現和追溯[7]。

3 食品微生物檢測中分子診斷技術使用質量的優化建議

3.1 優化食品樣品前處理方案

針對食品基質的復雜性，可從以下方面優化樣品前處理。在物理處理方面，研究者嘗試了機械勻漿、高壓勻漿、超聲波處理等方法，以提高微生物裂解效率。化學裂解劑如溶菌酶、蛋白酶K、十六烷基三甲基溴化銨等的使用，可有效去除細胞蛋白和多糖等干擾物質。此外，一些吸附材料如聚乙烯亞胺、氧化鋁、二氧化硅顆粒等可用于吸附食品中的PCR抑制物。

3.2 加強引物和探針的優化設計

應用生物信息學，可從多方面優化引物和探針設計。在序列選擇方面，引物和探針設計區域應具有物種特異性，避開易發生突變的位點。利用同源性分析和多序列比對等工具，可篩選出特異性強、突變率低的候選區域。針對候選序列，可用Primer Premier、Oligo等軟件進行二級結構和熱力學性質預測，選擇自由能低、發夾和自身互補少的最優引物。同時，可采用退火溫度標記引物、鎖核酸修飾探針等新型策略提高檢測的特異性。

3.3 實施擴增條件的系統優化

擴增條件優化應遵循“一因素一次”（Single-Factor-at-a-Time，OFAT）原則，即在其他因素不變的情況下，逐一考察各因素的影響。為提高優化效率，可借助試驗設計方法，如正交試驗、Plackett-Burman設計等，以最少的試驗次數獲得各因素的最佳水平組合。此外，還可利用計算機模擬等方法輔助優化過程。例如，可以采用均勻設計-反應面分析法優化牛肉中沙門氏菌qPCR檢測的退火溫度和引物濃度，從而提高檢測靈敏度。未來應加強多因素耦合效應機制的研究，為實現擴增條件的精準調控提供理論指導。

3.4 加強質量控制和結果判定標準的建立

在核酸提取環節，可加入內參來監控提取和擴增過程，排除假陰性結果。擴增時，應設置陰性對照監控污染，設置陽性對照評價靈敏度。對擴增曲線進行分析，排除由于非特異性擴增導致的假陽性。此外，有必要建立統一的結果判定標準。目前，很多研究僅以Cq值作為判定標準，而忽視了擴增曲線形狀對結果可靠性的影響。因此，應結合Cq值、終點熒光強度、擴增效率等多個指標，制定嚴格、客觀的判定標準，減少漏檢和誤判。

4 結語

分子診斷技術以其靈敏度高、特異性強、檢測速度快等優勢，已成為食品微生物檢測領域的重要工具。但受樣品處理、引物/探針設計、擴增條件優化、質控體系建設等因素的影響，分子診斷技術在實際應用中還存在不少問題，從而影響檢測結果的準確性和可靠性。在未來應針對食品基質特性，對其關鍵技術環節進行優化，建立規范的操作流程和質量控制體系，促進分子診斷技術在食品微生物檢測中的標準化應用，為保障食品安全提供技術支撐。

參考文獻

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