多蒸多制工藝過程中酒黃精多糖的單糖組成變化研究

摘 要：采用HPLC-ESLC法測定多批不同蒸制工藝制得的酒黃精多糖的單糖組成變化規律，為酒黃精炮制工藝標準化評價提供依據。結果表明，生黃精（黃精飲片）、酒黃精（一蒸一制）、酒黃精（二蒸二制）、酒黃精（四蒸四制）、酒黃精（六蒸六制）、酒黃精（九蒸九制）多糖中單糖組成均檢測到巖藻糖、果糖，9種飲片黃精多糖中巖藻糖含量為7.62～3.28 mg·g^-1，果糖含量為5.36～0.78 mg·g^-1；巖藻糖與果糖含量比值為1.42～4.18。酒黃精蒸制次數不同，飲片中黃精多糖單糖組分巖藻糖、果糖含量及巖藻糖與果糖含量比值變化具有一定的規律性。上述結果可為酒黃精炮制工藝標準化及酒黃精質量評價提供參考依據。

關鍵詞：酒黃精；多糖；單糖組分；九蒸九制

Study on the Changes of Polysaccharide Monosaccharide Composition from Polygonatum sibiricum in the Process of Multi-Steam-Multi-Bask

TU Shifeng MIN Jiang HUANG Jiajia

（1.Nanchang Inspection and Testing Center， Nanchang 330000， China;

2.Puning Hospital of Traditional Chinese Medicine， Puning 515300， China）

Abstract： HPLC-ESLC method was used to determine the changes of polysaccharide monosaccharide composition from Polygonatum sibiricum by different batch of different steaming processes， which provided the basis for standardization evaluation of distillate extract processing technology. The results showed that fucose and fructose were detected in the polysaccharides of Polygonatum sibiricum （Polygonatum decoction pieces）， processed Polygonatum sibiricum （one-steam-one-bask）， processed Polygonatum sibiricum （two-steam-two-bask）， processed Polygonatum sibiricum （four-steam-four-bask）， processed Polygonatum sibiricum （six-steam-six-bask）， and processed Polygonatum sibiricum （nine-steam-nine-bask） polysaccharides. The content of fucose in polysaccharide of nine kinds of decoction pieces was from 7.62 mg·g^-1 to 3.28 mg·g^-1， the content of fructose in polysaccharideand was from"5.36 mg·g^-1 to 0.78 mg·g^-1， the ratio of fucose to fructose of polysaccharide was from 1.42 to 4.18. The contents of fucose and fructose， as well as the ratio of fucose and fructose of polysaccharide monosaccharide in processed Polygonatum sibiricum were changed regularly with different steaming times. The above results can provide reference for the standardization of processing technology and quality evaluation of wine yellow essence.

Keywords： processed Polygonatum sibiricum; polysaccharides; monosaccharide components; nine-steam-nine-bask

黃精始載于《名醫目錄》，味甘、性平，歸脾、肺、腎經，具有補氣養陰、健脾、潤肺及益腎等功效[1]。生黃精具麻味，刺激咽喉，蒸后補脾、潤肺、益腎功能增強，并可除去麻味，以免刺激咽喉，臨床使用前需要經過炮制以降低其刺激性、增強其功效[2]。蒸法是黃精炮制方法之一，歷代文獻中均有記載[3]。《中華人民共和國藥典》（2020年版）規定酒黃精炮制方法之一為酒蒸（一蒸一曬）[1]。我國古法炮制推崇九蒸九制[4]，借助蒸制過程使之滋而不膩，更好地發揮補益作用。諸多研究結果顯示，黃精多糖是黃精化學組成的一個重要部分，是黃精主要生物學活性成分之一，發揮補益作用[5]。黃精蒸制次數不同可導致黃精多糖的單糖組分發生變化[6]。分析黃精多糖單糖組成，即是解析黃精多糖結構[7]。本研究使用三氟乙酸將提取出來的酒黃精多糖水解為單糖，通過蒸發光散射技術[8]，分析一蒸一曬、二蒸二曬……九蒸九曬等多種蒸制方法對炮制品黃精多糖分子結構變化的影響規律，即黃精多糖的單糖組分變化規律，為酒黃精炮制工藝標準化及炮制品質量控制指標制定提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

樣品1～10工藝號原藥材產于湖南省，基源為多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua），均由江西中醫藥大學的中藥鑒定教研室進行植物基源鑒定。樣品信息具體見表1。

1.2 儀器、試劑

日立Primaide（企業級）高效液相色譜儀、通微UMIEX 7700蒸發光檢測器以及XS105DU電子天平、ME204E電子天平（梅特勒-托利多公司）。

乙腈（色譜純），三氟乙酸、正丁醇、氯仿、無水乙醇（分析純）。

實驗用水為娃哈哈純凈水，紹興黃酒購于紹興女兒紅釀酒有限公司。對照品有巖藻糖（nkl-00538230316，含量98%，成都鈉鈳鋰生物科技有限公司）、果糖（100231-202008，中國藥品生物制品檢定所）。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃精、酒黃精炮制

（1）黃精炮制工藝。取完整、無霉變的黃精生品，剔除須根、洗凈、潤透，切藥機切厚片，晾曬干即得。

（2）酒黃精炮制工藝。取完整、無霉變的黃精藥材，剔除須根、洗凈、干燥，按20%比例加入黃酒，攪拌均勻悶潤12 h，置木制蒸籠內蒸制8 h，放涼至酒黃精軟硬合適狀，切厚片，攤晾曬干，即得酒黃精（一蒸一制）飲片。取酒黃精（一蒸一制）飲片，按20%比例加入黃酒，攪拌均勻悶潤12 h，置木制蒸籠內蒸制8 h，攤晾曬干即得取酒黃精（二蒸二制）飲片。按照上述方法分別制得酒黃精（三蒸三制）、酒黃精（四蒸四制）、（五蒸五制）、酒黃精（六蒸六制）、酒黃精（七蒸七制）、酒黃精（八蒸八制）、酒黃精（九蒸九制）。

1.3.2 供試品溶液

取本品粉末（過三號篩）約5.0 g，精密稱定，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4 h，棄去乙醇液，藥渣揮干，精密加水100 mL，密塞，稱定質量，煎煮1 h，再稱定質量，用水補足減少的質量，混勻、離心。之后精密量取上清液5 mL，置安瓿瓶中，加2 mol·L^-1的三氟乙酸1 mL封口、混勻，110 ℃水解1 h，水浴蒸干、放冷，殘渣用水溶解，轉移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻、濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

1.3.3 混合對照品溶液

精密稱取適量巖藻糖、果糖對照品，加水制成含6.24 mg·L^-1巖藻糖、1.98 mg·L^-1果糖的混合對照品儲備溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為安捷倫ZORBAX Original 70? Carbohydrate"Analysis（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為30 ℃，流動相為乙腈-水（85∶15），流速1 mL·min^-1，ELSD漂移管溫度為75 ℃，氣體流量為2.5 L·min^-1，增益為1。分別精密吸取對照品溶液2 μL（或5 μL）、10 μL，供試品溶液10～20 μL，注入高效液相色譜儀進行測定，以外標兩點法對數方程計算。結果如圖1所示，巖藻糖、果糖兩種成分色譜峰分離良好，與相鄰峰的分離度大于1.5，表明該分析方法專屬性良好，適用于黃精、酒黃精中巖藻糖、果糖的測定。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

精密吸取1.3.3項下巖藻糖、果糖混合對照品儲備液，按相關倍數稀釋，制備0.12 mg·mL^-1、0.25 mg·mL^-1、0.62 mg·mL^-1、1.25 mg·mL^-1、2.50 mg·mL^-1和6.24 mg·mL^-1等6個濃度的巖藻糖及0.040 mg·mL^-1、0.079 mg·mL^-1、0.198 mg·mL^-1、0.396 mg·mL^-1、0.792 mg·mL^-1和1.980 mg·mL^-1等6個濃度的果糖混合對照品溶液，按1.3.4項下的色譜條件進行測定，以峰面積的常用對數為縱坐標（lgA），以相應的質量濃度的常用對數值lgC為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算線性范圍、r值，結果見表2。結果顯示，兩種成分分別在各自濃度范圍內線性關系良好，表明該方法適用于不同濃度水平的巖藻糖、果糖定量測定。

2.2 精密度實驗

精密吸取1.3.2項下供試品酒黃精（一蒸一制）溶液10 μL，連續進樣6次，按1.3.4項下色譜條件進行測定。巖藻糖、果糖成分峰面積常用對數值lgC的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）分別為1.31%和1.40%，表明該方法的精密度良好。

2.3 穩定性實驗

精密吸取1.3.2項下供試品酒黃精（一蒸一制）溶液10 μL，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和24 h，分別進樣測定，巖藻糖、果糖峰成分面積常用對數值lgC的RSD分別為0.88%和1.06%，表明24 h內樣品中的巖藻糖和果糖具有良好的穩定性。

2.4 重復性實驗

取酒黃精（一蒸一制）樣品，按1.3.2項方法平行制備6份供試品溶液，取1.3.3項下對照品儲備溶液制備含0.25 mg·mL^-1巖藻糖、0.079 mg·mL^-1果糖混合對照品溶液，按1.3.4項下色譜條件測定。測定結果為供試品中巖藻糖含量為0.62%、RSD為2.03%，果糖含量為0.20%、RSD為1.79%。這表明該實驗方法重復性良好。

2.5 回收率實驗

取已知各單糖含量的酒黃精（一蒸一制）6份，每份樣品稱取粉末約0.5 g，精密稱定，精密加入巖藻糖、果糖混合對照品溶液適量，按1.3.2項下的方法制備供試品溶液，按1.3.4項下的色譜條件進行測定，計算巖藻糖、果糖的加樣回收率，結果見表3。巖藻糖平均回收率為99.26%，RSD為0.61%；果糖平均回收率為102.93%，RSD為1.06%。巖藻糖、果糖加樣回收率在95%～105%，RSD＜5%，表明該實驗方法準確度較高。

2.6 酒黃精及黃精供試品含量測定

取9批酒黃精及黃精樣品，按1.3.2項下方法制備供試品溶液，取1.3.3項下對照品儲備溶液制備含0.25 mg·mL^-1巖藻糖、0.079 mg·mL^-1果糖混合對照品溶液，按1.3.4項下色譜條件進行樣品測定，計算9批次樣品中巖藻糖、果糖兩種成分的含量，并計算兩種成分含量比值，結果見表4。結果表明，隨著酒黃精蒸制次數的增加，酒黃精多糖結構發生變化，多糖組成成分中巖藻糖與果糖的含量比值逐漸增大，該比值變化趨勢與酒黃精外觀性狀變化呈現一定的相關性。

3 討論與結論

本文采用HPLC-ELSD檢測技術，以中藥飲片企業根據多個不同傳統炮制工藝炮制所得“一蒸一制”酒黃精、“二蒸二制”酒黃精……“九蒸九制”酒黃精等炮制成品為實驗材料[9-10]，探索多蒸多制酒黃精在炮制過程中黃精多糖結構（單糖）組成變化規律。結果表明，在酒黃精多蒸多制過程中，隨著蒸制次數的增加，酒黃精多糖分子結構發生變化，多糖中巖藻糖/果糖含量比值逐次增大。

黃精生用“刺人咽喉”，借助蒸制過程可消除或降低黃精不良反應，增強黃精功效。“九蒸九制”及“多蒸多制”工藝是中藥飲片黃精沿用多年炮制工藝，此類炮制工藝可以直接改變黃精多糖分子結構即單糖組分比例變化。歷代文獻及現代各省（自治區、直轄市）炮制規范中僅僅以感官性狀變化作為炮制品品質判斷依據。本文定量分析的研究結論可以為酒黃精炮制工藝標準化、炮制品質量提升等提供依據。

參考文獻

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