超高效液相色譜串聯質譜法測定動物源食品中4種硝基呋喃代謝物

摘 要：本研究建立了超高效液相色譜串聯質譜法同時檢測動物源食品中3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-Amino-2-Oxazolidinone，AOZ）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-Amino-5-Morpholinomethyl-2-Oxazolidinone，AMOZ）、氨基脲（Semicarbazide，SEM）、1-氨基-2-內酰脲（1-Aminohydantoin，AHD）殘留量的分析方法。樣品以0.2 mol·L^-1鹽酸水為提取劑，加入2-硝基苯甲醛為衍生劑，37 ℃水浴振蕩4 h，調節pH值為7.4±0.2，HLB固相萃取柱凈化，氮氣吹干，用0.1%甲酸（含有50%甲醇）水溶液復溶，采用0.1%甲酸水-10 mmol·L^-1乙酸銨和甲醇為流動相梯度洗脫，經C18柱分離，電噴霧正離子模式掃描，多反應監測模式，內標法定量。結果表明，4種硝基呋喃藥物線性良好，相關系數（R2）均大于0.999，動物源食品中AOZ、AMOZ、SEM、AHD的檢出限均為0.2 μg·kg^-1，定量限為0.4 μg·kg^-1。低、中、高濃度加標水平下，4種化合物在畜肉產品中的回收率為87.42%～102.26%，相對標準偏差為0.80%～5.93%；在禽肉產品中的回收率為89.76%～104.94%，相對標準偏差為0.62%～5.83%；在禽蛋產品中的回收率為90.30%～106.82%，相對標準偏差為0.85%～7.93%；在水產品中的回收率為86.95%～107.36%，相對標準偏差為0.20%～5.02%。該方法靈敏度高、重復性好，可為實驗室大批量檢測動物源食品中硝基呋喃類藥物提供技術參考。

關鍵詞：超高效液相色譜串聯質譜；動物源食品；硝基呋喃類藥物

Determination of Four Nitrofuran Metabolites in Animal Derived Food by Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

BIAN Wenke WANG Runhao

（1.College of Agricultural Engineering and Food Science， Shandong University of Technology， Zibo 255049， China;

2.Shandong Burey Inspection and Testing Co.， Ltd.， Zibo 256400， China）

Abstract： In this research， an ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was developed for the simultaneous determination of 3-amino-2-oxazolidinone （AOZ）， 5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidinone （AMOZ）， semicarbazide （SEM） and 1-aminohydontion （AHD） residues in food from animal origin. These samples were treated with 0.2 mol·L^-1 hydrochloric acid water as an extract and 2-nitrobenzaldehyde as derivative. Samples were shaken in a water bath at 37 ℃ for 4 h， and the pH was adjusted to 7.4±0.2， and purified by HLB solid phase extraction column， then dried by nitrogen， used 0.1% formic acid water to redissolve （included 50% methanol）， 0.1% formic acid water are mixed with 10 mmol·L^-1 ammonium acetate and methanol as mobile phase to gradient. C18 column to separation， scanning electrospray positive in ion mode and multi-reaction monitoring mode， quantification by internal standards. The results showed that the four nitrofuran drugs had good linearity， and correlation coefficients （R2） were all greater than 0.999. The detection limits of AOZ， AMOZ， SEM and AHD in animal food were all 0.2 μg·kg^-1， and quantitation limits were 0.4 μg·kg^-1. At low， medium and high concentration addition levels， the recovery rates of the four compounds in livestock meat products were 87.42%～102.26%， and the relative standard deviations were 0.8%～5.93%; the recovery rates in poultry meat products were 89.76%～104.94%， the relative standard deviations were 0.62%～5.83%; the recovery rates in poultry egg products were 90.30%～106.82%， the relative standard deviations were 0.85%～7.93%; the recovery rates in aquatic products were 86.95%～107.36%， and the relative standard deviations were 0.20%～5.02%. The the method has high sensitivity and good repeatability， which providing technical reference for the detection of nitrofurans in large quantities of animal food in laboratory.

Keywords： ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; animal derived food; nitrofuran drugs

硝基呋喃類藥物是一種廣泛應用于水產養殖類、畜禽產品中的廣譜抗生素。硝基呋喃類藥物對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲等病原體均有殺滅作用[1]。硝基呋喃類藥物作用于微生物酶系統，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖類代謝，從而起到抑菌作用[2]。硝基呋喃類藥物廣泛應用于畜禽及水產養殖業，主要治療大腸桿菌和沙氏門菌引起的腸炎等疾病[3]。硝基呋喃類藥物在動物體內代謝后，產生的硝基呋喃類代謝物極易與蛋白質結合，并且這些蛋白質結合物能在人體中殘留很長時間，采用蒸煮、烘烤等方式均不能使其降解，對人體健康構成了威脅[4]。因此，硝基呋喃類代謝物的檢測是保障食品安全的重要環節。

目前對于硝基呋喃類代謝物常見的檢測方法有高效液相色譜法[5-6]、液相色譜串聯質譜法[7-15]、免疫分析法[16-19]。其中免疫分析具有操作簡單、成本低、快速等優點，但大批量任務檢測時極易出現假陽性，只能快速定性分析，無法準確定量分析，適用于實驗室檢測樣品的初步篩選。高效液相色譜法具有重現性好、結果準確等優點，但高效液相色譜法抗干擾能力差，極易受其他雜質影響，在實際樣品檢測中受到一些限制。超高效液相色譜串聯質譜法具有靈敏度高、結果準確、快速等優點，可分析基質復雜的樣品，能夠做到準確定性、定量分析。硝基呋喃分子量小，可以通過衍生化生成大分子量穩定的化合物，因此采用超高效液相色譜串聯質譜法（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）來測定。目前，硝基呋喃代謝物檢測常用的標準《食品安全國家標準 水產品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》（GB 31656.13—2021）只適用于水產品的檢測、《動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯質譜法》（GB/T 21311—2007）涉及動物源產品的檢測，兩個標準都采用液液萃取法進行凈化提取。這對于基質復雜的畜禽肉、禽蛋、水產品有一定的局限性，在萃取過程中極易發生乳化現象。本研究在GB 31656.13—2021和GB/T 21311—2007兩個標準的基礎上，建立了動物源食品中4種硝基呋喃及其代謝物的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、雞蛋、雞肉、清江魚：購于淄博市超市。

甲醇、乙腈、乙酸銨：色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、磷酸二氫鉀：分析純，國藥化學試劑集團有限公司；甲酸：色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；2-硝基苯甲醛（純度99.9%）：色譜純，國藥麥克林；正己烷：色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司，乙酸乙酯：色譜純，上海默克化工技術有限公司；二甲亞砜：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；實驗室用水：一級水，娃哈哈；3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-Amino-2-Oxazolidinone，AOZ）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-Amino-5-Morpholinomethyl-2-Oxazolidinone，AMOZ）、氨基脲鹽酸鹽（Semicarbazide Hydrochloride，SEM·HCl）、1-氨基-2-內酰脲（1-Aminohydantoin，AHD）4種硝基呋喃代謝物標準品：100 μg·mL-1；3-氨基-2-噁唑烷基酮-D4（AOZ-D4）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮-D5（AMOZ-D5）、氨基脲鹽酸鹽-13C，15N2（SEM·HCl-13C，15N2）、1-氨基-2-內酰脲-13C3（AHD-13C3）4種硝基呋喃代謝物同位素標準品：100 μg·mL-1。

1.2 儀器與設備

TGL-16M高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；TN-5800氮吹濃縮儀：天津奧特塞恩斯儀器有限公司；anavo HLB固相萃取柱，500 mg/12 mL，北京納鷗科技有限公司；XH-C渦旋混合器：常州越新儀器制造有限公司；TSQ Quantival UPLC-MS/MS超高效液相-質譜連用儀，配有TraceFinder 4.1 General Quan數據處理軟件：賽默飛世爾科技有限公司；PHS-25酸度計：上海雷磁儀器有限公司；SHA-B數顯恒溫水浴振蕩器：天津奧特塞恩斯儀器有限公司；有機相微孔濾膜，13 mm×0.22 μm：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 混合標準溶液配制

準確移取4種硝基呋喃代謝物混標適量于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為1 μg·mL^-1、100 μg·L^-1、10 μg·L^-1的混合標準儲備液。取4種硝基呋喃代謝物同位素混合標準品適量于10 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為1 μg·mL^-1的混合中間液。

1.3.2 樣品制備

取豬肉、雞肉、魚肉肌肉組織500 g切成小塊后置于搗碎機中，將其搗碎后分別置于3個不同的樣品盒中，貼標簽備用。取雞蛋500 g去殼后打入搗碎機中，用搗碎機將其充分攪拌混勻，倒入樣品盒中，貼標簽備用。

1.3.3 樣品前處理

（1）提取。稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入4種硝基呋喃同位素工作液（1 μg·mL^-1）20 μL，加入0.05 mol·L^-1 2-硝基苯甲醛300 μL，加入0.2 mol·L^-1鹽酸水15 mL，37 ℃水浴振蕩4 h。用磷酸氫二鈉與氫氧化鈉調節pH值為7.4±0.02，加入5 mL正己烷除油脂，于4 ℃ 8 000 r·min^-1離心10 min，取下清液于另一只50 mL離心管中備用，若下清液渾濁則加入5 mL正己烷再次除油。（2）凈化。用5 mL甲醇、5 mL水活化柱子，將下清液以2～3 mL·min^-1的速度流過柱子，用5 mL蒸餾水淋洗柱子并且吹干，用10 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于50 ℃下氮吹至盡干，加入2 mL 0.1%甲酸水∶甲醇（1∶1）試劑復溶，渦旋混勻，過0.22 μm尼龍有機濾膜于進樣小瓶中，經UPLC-MS/MS測定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm）配Waters預柱；色譜柱溫度：30 ℃；流動相：A為10 mmol·L^-1乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，B為甲醇；流速：0.25 mL·min^-1；進樣量：1 μL；梯度洗脫條件見表1。

1.3.5 質譜條件

電噴霧離子源（Heated-Electro Spray Ionization，H-ESI），多反應模式監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM），正離子模式；電噴霧電壓：4 000 V；離子源溫度：400 ℃；離子傳輸管溫度：350 ℃；鞘氣：35 arb；輔助氣：10 arb。其他質譜采集參數見表2。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

配制1 μg·mL^-1 4種硝基呋喃代謝物混標和1 μg·mL^-1 4種硝基呋喃同位素混標，以10 μL·min^-1的流速經過質譜，進行質譜一級掃描，確定母離子強度是否滿足條件要求。滿足要求后繼續進行二級掃描，選擇離子強度最強和次強的離子對分別作為定量和定性離子，并對碰撞能量進行優化調整，確定用于化合物分析的最佳質譜條件。

2.2 液相色譜條件優化

硝基呋喃代謝物分析采用C18色譜柱，本研究采用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm）和Waters預柱。預柱安裝在流動相流路中泵出口位置和色譜柱入口位置的結合點。在線過濾器主要用于溶劑過濾，除去流動相和樣品中更細小的雜質，達到更好保護色譜柱的目的。

硝基呋喃代謝物采用正離子模式電離，為提高該化合物在正離子模式下的分析靈敏度，在流動相中添加乙酸銨來增強目標離子的檢測信號，同時也促進目標化合物的電離[7，9]。

如圖1所示，0.1%甲酸水-10 mmol·L^-1乙酸銨與甲醇構成的流動相體系基線非常平穩，儀器的響應值高，能夠非常好的分離出4中硝基呋喃類藥物，能夠準確定性定量分析。因此，選用10 mmol·L^-1乙酸銨-0.1%甲酸水與甲醇為分離硝基呋喃代謝物的流動相體系。

2.3 提取液pH值的影響

硝基呋喃代謝物在動物組織中容易與蛋白質結合在一起，無法直接測定，必須采用酸水解的方式使代謝物從組織中游離出來。在弱堿條件下，乙酸乙酯對AOZ、AMOZ、AHD、SEM衍生產物提取效率最高，弱堿環境可以抑制目標物的電離，使其絕大部分呈分子狀態存在于衍生溶液中，有利于乙酸乙酯對目標物的提取或HLB固相萃取柱的吸附，從而增強富集凈化的效果。在pH值為7.0±0.2、7.2±0.2、7.4±0.2、7.6±0.2時，比較4種硝基呋喃代謝物（添加濃度5 μg·kg^-1）的回收率，結果見圖2。可以發現，SEM、AHD在pH值為7.4±0.2時回收率最高，AOZ、AMOZ回收率在pH值為7.0～7.6時變化不大，因此將pH值調整為7.4±0.2。大量實驗證明，在畜肉、雞蛋、禽肉、水產品中加入1.5 mol·L^-1氫氧化鈉2.1 mL和1 mol·L^-1磷酸氫二鉀1 mL，可得到pH值為7.4±0.2，為實驗室大批量樣品檢測節約時間。

2.4 衍生劑用量的影響

硝基呋喃類藥物結構中含有五元雜環，化學穩定性較差，原型藥在生物體內代謝很快，但其代謝產物和蛋白質結合物比較穩定，所以通常以其代謝物為目標分析物來測定其含量。對硝基呋喃類藥物來說，其代謝物分子質量較小，且離子化效率低，存在較少的特征離子，無法采用非衍生法檢測，故需要用衍生法進行檢測[10，20]。標準GB 31656.13—2021中使用的衍生劑是0.05 mol·L^-1 2-硝基苯甲醛，加入150 μL衍生16 h，在此基礎上本研究進一步優化衍生劑的用量和衍生時間。由表3可知，0.05 mol·L^-1 2-硝基苯甲醛在用量300 μL、衍生時間4 h條件下可達到較高的衍生效率，故確定衍生劑的用量為300 μL、衍生時間為4 h。

2.5 凈化方式的優化

豬肉、雞蛋、雞肉、魚肉含有豐富的蛋白質，但基質特別復雜，因此在前處理過程中選擇合適的凈化方式非常重要。GB 31656.13—2021、GB/T 21311—2007和農業部781號公告-4-2006采用的凈化方式都是液液萃取法。液液萃取法是根據分析物相似相溶的原理，利用分析物與干擾物在2種不相溶的溶劑中分配系數不同，使分析物從干擾物中分離，從而達到凈化樣品的目的。液液萃取法雖有操作簡單、技術經典等優點，但豬肉、雞蛋、魚肉基質復雜，萃取過程中加入乙酸乙酯后會與鹽酸水分不開層，發生乳化現象，導致目標分析物回收率不穩定。原因可能是豬肉、禽肉、魚肉這類產品中含有豐富的油脂，加入一定量正己烷除油，沒有明顯的效果。

對于基質復雜的樣品，實驗采用固相萃取的凈化方式對提取液進行凈化。在固相萃取過程中，樣品通過充滿吸附劑的一次性萃取柱后，根據分析物、干擾物與萃取柱吸附劑結合能力的不同，用不同極性的溶劑分步除去雜質，最后洗脫出分析物，達到分離和富集分析物的目的。采用固相萃取柱凈化可以節約大量的有機試劑，有利于保護環境，也能夠有效避免乳化現象的發生，使回收率更加穩定。

液液萃取、固相萃取2種凈化方式在添加濃度為5 μg·kg^-1時的回收率情況如圖3所示，AHD、SEM在固相萃取凈化方式下的回收率明顯高于液液萃取凈化方式下的回收率，AOZ與AMOZ的回收率變化不大。因此，選用固相萃取的方式進行提取液凈化。

親水親脂型HLB小柱過柱子時柱床是否干涸對回收率沒有太大的影響，具有更加穩定的操作性能[21]。過柱子時應該考慮提取液是否會堵塞柱子，本實驗選用500 mg/12 mL的HLB固相萃取柱，過柱子前考慮到提取液可能出現渾濁，因此加入5 mL正己烷除油，低溫高速離心后取下層清液過柱。

2.6 標準曲線的配制

取6支潔凈的50 mL離心管，加入1 μg·mL^-1"4種硝基呋喃代謝物同位素混標20 μL于6支離心管中，取10 μg·L^-1 4種硝基呋喃代謝物混標100 μL于第1支離心管中，取100 μg·L^-1 4種硝基呋喃代謝物混標20 μL、50 μL、100 μL分別于第2、3、4支離心管中，分別取1 μg·mL-1 4種硝基呋喃代謝物混標20 μL、40 μL于第5、6支離心管中。按照1.3.3完成前處理過程后，上機檢測。以外標和內標特征離子峰面積比為縱坐標（Y），以濃度值為橫坐標（X，μg·L^-1），內標法定量，進行線性分析，回歸方程及相關系數見表4。

由表4可知，AOZ、AMOZ、SEM、AHD 4種化合物在0.5～20.0 μg·kg^-1具有良好的線性關系，相關系數（R2）均大于0.999。按照1.3.3中建立的方法，進行加標實驗，以信噪比S/N≥3確定本方法的檢出限（Limit of detection，LOD），以S/N≥10確定本方法的定量限（Limit of quantification，LOQ）[22]。結果顯示，AOZ、AMOZ、AHD、SEM的檢出限為0.2 μg·kg^-1，定量限為0.4 μg·kg^-1。

2.7 方法回收率與精密度

取4種基質空白陰性樣品，分別加入適量的標準溶液和20 μL 4種硝基呋喃同位素標準溶液，使AOZ、AMOZ、SEM、AHD 4種化合物的質量濃度為0.5 μg·kg^-1、5.0 μg·kg^-1、10.0 μg·kg^-1，按照1.3.2和1.3.3的步驟進行樣品處理，進行加標回收實驗，每個濃度點平均測定7次，計算平均回收率。由表5可知，硝基呋喃代謝物在畜肉產品中的回收率為87.42%～102.26%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.80%～5.93%；在禽肉產品中的回收率為89.76%～104.94%，相對標準偏差為0.62%～5.83%；在禽蛋產品中的回收率90.30%～106.82%，相對標準偏差為0.85%～7.93%；在水產品中的回收率為86.95%～107.36%，相對標準偏差為0.20%～5.02%。

3 結論

本研究通過優化提取、凈化、儀器條件，建立了超高效液相色譜串聯質譜法測定動物源食品中AOZ、AMOZ、SEM、AHD 4種代謝物的方法。

4種代謝物用0.2 mol·L^-1鹽酸水提取，調節pH值為7.4±0.2，經HLB固相萃取柱凈化，內標法定量。該方法具有較好的準確度和重復性，結果準確，靈敏度高，可實現大批量動物源食品中硝基呋喃的檢測分析，能夠有效提高工作效率。

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