PAX8基因與上皮性卵巢癌的相關性

劉健 趙晶 王蓉 陳雪 馬曉梅

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是眾所周知的最致命的婦科惡性腫瘤[1],是一組涉及卵巢的異源性腫瘤。其中上皮性腫瘤(約90%)可分為四種主要組織型:漿液性、粘液性、子宮內膜樣和透明細胞型,其中高級別漿液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer,HGSOC)是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)中發生率和致死率最高的亞型,與BRCA1或 BRCA2和p53基因突變有關,占卵巢癌死亡總數的70%,其高死亡率主要因為在早期階段,HGSOC是無癥狀的,并且不存在特定的生物標志物,因此大多數病例在晚期才被發現,且發現時通常已伴有遠處轉移(FIGO Ⅲ～Ⅳ期)[2]。該疾病主要治療方式包括手術減瘤、序貫紫杉烷類藥物和鉑類方案化療,治療初期藥物治療往往效果明顯,但很快就會發生化療耐藥,甚至疾病復發。因此,對于該類患者的診療,了解EOC的致瘤和轉移過程是至關重要的,最新的組織學、分子生物學和動物模型證據表明,大多數HGSOC起源于輸卵管上皮[3]。研究發現,幾乎所有HGSOC中都存在輸卵管上皮(fallopian tube epithelium,FTE)譜系特異性標記配對盒基因8(paired box 8,PAX8),至于EOC的其他組織類型,PAX8基因在卵巢透明細胞癌和卵巢子宮內膜樣腫瘤中高表達,在卵巢黏液性腫瘤中低表達[4]。近年來,PAX8基因在卵巢癌中的致瘤作用已得到充分重視[5-6],所以將PAX8基因作為EOC的診斷標志物,甚至作為HGSOC潛在治療靶點的研究越來越受到研究者的關注。本文就PAX8基因在EOC中的致瘤作用及臨床潛在應用等方面的研究進展展開綜述。

1 PAX配對盒基因家族概述

PAX配對盒基因家族是一類在胚胎模式形成和器官發育中高度保守的轉錄基因家族。PAX基因最初發現于果蠅,隨后發現廣泛存在于許多不同的物種中[7]。它們在果蠅的胚胎發育中影響幼蟲的分割并促進眼睛和大腦發育[8]。這些基因編碼的轉錄因子包括四個功能域:具有DNA結合活性的N端配對域、保守的八肽基序、同源域(可作為第二個獨立的DNA結合區)和C端的反式激活域[9]。在哺乳動物中,PAX基因家族根據是否具有配對域末端的八肽基序、同源域以及所具有的同源域是否完整,可分為4個亞家族[10]。分別為:亞家族Ⅰ(PAX1和PAX9)由配對結構域和八肽組成,亞家族Ⅱ(PAX2,PAX5和PAX8)除配對結構域和八肽外還有部分同源結構域,亞家族Ⅲ(PAX3和PAX7)由配對結構域、完全同源結構域和八肽組成,亞家族Ⅳ(PAX4和PAX6)由配對結構域和完全同源結構域組成。PAX基因家族編碼的蛋白質為一組在胚胎發育和器官分化中極其重要的轉錄調控因子,主要用于調節細胞增殖,促進更新,誘導前體細胞定向轉移和引導特定細胞系分化[11]。

2 PAX8基因在組織生長發育過程中的功能

PAX8基因位于人染色體2q12-q14上,是一種譜系特異性轉錄因子相關基因[12]。研究表明,甲狀腺發育不良的PAX8基因缺失小鼠會發生嚴重發育不良,斷奶后不久將會死亡[13]。在發育過程中,小鼠的PAX8基因表達主要存在于腎臟、甲狀腺和苗勒管的正常上皮細胞中,其中苗勒管是雌性生殖系統的起源[14]。早期甲狀腺激素替代療法讓雌性PAX8基因缺失小鼠得以存活,但它們無法生育,因為會伴隨苗勒管衍生組織的異常,例如子宮閉鎖、陰道口閉鎖和輸卵管積水導致的輸卵管損傷[15]。PAX8基因在雄性生殖系統的發育中也起著關鍵作用,并在胚胎期中腎管中表達[16]。用甲狀腺激素治療雄性PAX8基因缺失小鼠,可以治療先天性甲狀腺功能減退癥,但這些小鼠由于沒有附睪、輸出導管和精子而不能生育[17]。因此,PAX8基因在組織發育過程中起著重要作用,并可以指導兩性生殖器官的正常形成。同時,胚胎發育和癌癥進展之間的許多相似之處越來越得到研究者認可,因為這兩個過程都需要許多細胞類型之間的相互作用和協調,許多轉錄因子和轉錄因子家族參與胚胎分化和癌癥轉化和進展的調節。

3 PAX8基因與上皮性卵巢癌的相關性

在正常成年組織中,PAX8基因表達于腎臟、甲狀腺和輸卵管上皮等,而不是卵巢上皮細胞。同時有研究發現PAX8基因也在HGSOC中高表達[18]。最新的證據證明FTE是主要的卵巢癌祖細胞部位,從健康FTE中敲除PAX8基因,幾乎沒有功能影響,并且沒有顯著改變基因的表達。然而,將HGSOC中PAX8基因敲除會降低腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲,同時誘導細胞死亡,減慢腫瘤進展[12]。有研究指出PAX8基因是輸卵管分泌細胞譜系的標志物,其表達保留在96%的漿液性卵巢癌、89%的子宮內膜樣癌和100%的透明細胞癌中,并影響腫瘤細胞增殖、形態和存活,癌癥基因組圖譜(TGCA)項目表明PAX8是卵巢癌細胞增殖所必需的存活基因[5]。證明卵巢腫瘤細胞依賴PAX8基因的表達,而正常的FTE不受PAX8基因變化的影響,上皮性卵巢癌細胞的發生和PAX8基因的表達具有明顯的相關性。

4 PAX8基因在上皮性卵巢腫瘤發展中的作用

4.1 PAX8基因與腫瘤的關系 研究表明,PAX8基因與卵巢惡性腫瘤的發生之間有著重要的聯系[6]。PAX8基因能直接結合并增加抑癌基因P53的轉錄,激活定位于HGSOC細胞質中的抑癌基因P21的表達,誘導卵巢癌細胞非典型的促增殖作用。Nik等[19]利用基因工程小鼠模型成功模擬了從輸卵管分泌上皮細胞到高級別漿液性卵巢癌的轉化。此外,基因譜研究也發現HGSOC的基因表達譜與輸卵管的關系比與卵巢表面上皮的關系更密切[20]。PAX8基因通過與視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma,RB)中細胞增殖因子E2F1直接結合,在調節細胞周期中起著核心作用,包括PAX8基因在內的幾種PAX蛋白(組織特異性發育調節因子)與RB蛋白相互作用,從而直接或間接調節細胞周期。

PAX8基因在腎細胞癌、膀胱癌、卵巢癌和甲狀腺癌細胞系中經常表達,并且癌細胞系中PAX8基因的沉默導致E2F1及其靶基因表達的顯著降低,以及 RB蛋白的蛋白酶體依賴性不穩定,而RB1 mRNA水平不受影響。Li等[21]研究提出PAX8基因轉錄直接調節E2F1啟動子,并且RB耗竭后E2F1轉錄增強。RB被募集在PAX8 基因結合位點,并參與癌細胞中 PAX8基因介導的E2F1轉錄。在癌癥中,通過轉錄激活E2F1表達和RB-E2F1通路上調來控制細胞生長需要頻繁和持續的PAX8基因表達。Xiong等[5]認為,在正常的EOC細胞中增加PAX8基因表達,會上調叉頭盒基因(forkhead box M1,FOXM1)信號通路,增加細胞增殖、遷移和上皮間質轉變,與此相應,在3種人類卵巢癌細胞系中敲除PAX8基因后,FOXM1基因表達減少,癌細胞增殖減少,凋亡增加。但我們對PAX8基因的認識仍在逐漸深入,研究表明,PAX8基因控制著參與調節腫瘤-基質相互作用、細胞粘附、增殖、存活和轉移的轉錄程序[22]。PAX8基因作為轉錄因子發揮作用驅動特定目標基因的激活,并與調節細胞命運和身份的不同因素相關聯。

4.2 PAX8基因調節腫瘤細胞與細胞外間質的相互作用 Soriano等[22]利用體外遷移實驗和黏附分析發現上調PAX8基因表達可通過整合素異二聚體αvβ3增加細胞間粘附連接,在卵巢癌腫瘤細胞粘附細胞外間質(extracellular matrix,ECM)過程中發揮調節作用,并驅動腫瘤進展和侵襲。據報道,整合素β3僅與另外兩個α整合素亞基結合:整合素αiib和整合素αv。αiibβ3二聚體存在于巨核細胞系細胞中,在血小板聚集時發揮作用;αvβ3二聚體存在于增殖的內皮細胞和一些癌細胞中[23]。有證據表明異二聚體αvβ3在腫瘤生長和侵襲的多種機制中發揮作用,包括與ECM、基質金屬蛋白酶、血小板衍生生長因子、轉化生長因子β(TGFβ)、血管內皮生長因子受體相互作用,以及防止細胞凋亡[24]。其中TGFβ是一種由腫瘤細胞和成纖維細胞分泌的細胞因子,參與導致實體瘤的ECM重塑。具體而言,TGFβ介導成纖維細胞向癌癥相關成纖維細胞的轉變,以促進該類細胞轉移,ECM蛋白(如纖連蛋白和膠原蛋白)都通過增加組織剛度和增強成纖維細胞的浸潤最終影響免疫細胞浸潤而與疾病侵襲性相關,膠原蛋白和纖連蛋白的沉積與不良的臨床預后和生存率呈直接相關關系[25]。

纖連蛋白是一種ECM糖蛋白,除了傷口愈合、胚胎發育和致癌轉化等過程外,還在細胞分化、遷移、侵襲和增殖中起著至關重要的作用。在卵巢癌中,纖連蛋白在細胞遷移、侵襲、轉移中發揮作用,并作為預后生物標志物[26]。與纖連蛋白類似,膠原蛋白通過控制基質剛度在ECM重塑中發揮作用,并在卵巢癌細胞中提供轉移前生態位[27]。這些研究證明PAX8基因作為HGSOC免疫標記物的可能,同時PAX8基因- ECM的相關性突出了PAX8基因對腫瘤細胞的潛在治療價值,即未來研究者有望開發有效的腫瘤轉移阻斷信號。Hardy等[28]發現PAX8基因是人類卵巢癌模型(OVCAR8RFP)以及源自卵巢表面上皮和輸卵管上皮的漿液性腫瘤模型中作為遷移和腹膜定植的統一驅動因素,但目前仍需對其他HGSOC細胞系模型進行研究,以確認PAX8基因在上皮性卵巢癌遷移中的主要調節作用。

4.3 PAX8基因招募MECOM 基因驅動卵巢癌致癌功能 Bleu等[29]認為PAX8基因是卵巢癌細胞的主要組織因子,它參與了大量基因組位點的表達,其中PAX8基因在特定的基因組位點上特異性招募MDS1-EVI1復合基因集(MDS1-EVI1 complex locus,MECOM)。MECOM是一個轉錄單元,最初由2個主要的啟動子(500 kb)組成,驅動MDS1和EVI1蛋白的表達[30]。在卵巢癌和急性髓性白血病中因發生剪接導致MDS1-EVI1融合蛋白的表達[31]。基因PAX8和MECOM剪接變異體,表達于同一蛋白復合體中,以調控特定的共同基因模塊,支持體內腫瘤生長,細胞外間質生成和細胞粘附[29]。Bleu 等[29]發現PAX8和MECOM是同一轉錄復合物的一部分,并確定了PAX8-MECOM基因特征,該基因特征是預后不良的OC患者,PAX8基因在非HGSOC中的作用與HGSOC相似。另一項研究報告稱,敲低PAX8基因表達可降低腫瘤細胞的粘附水平,減少腫瘤負荷[32]。此外,卵巢譜系特異性PAX8基因調節子參與決定苗勒管器官發生過程中細胞命運和表型的決定性事件,如果失調有助于卵巢癌發生[33]。這些研究說明PAX8基因驅動的細胞致癌功能涉及多種因子參與,這將為未來相關研究奠定一定理論基礎。

4.4 腫瘤微環境中PAX8基因與脂肪間充質干細胞的作用 上皮性卵巢癌是一種獨特的實性腫瘤,起源于腹腔,轉移和再發于腹腔,并形成其特有的微環境[34]。腫瘤微環境(tumor micro-environment)由免疫細胞、間充質干細胞和腫瘤組織間的非細胞成分等組成,TME在卵巢癌的轉移和耐藥中有著重要影響[35]。大網膜上的脂肪間充質干細胞(adipose‐derived mesenchymal stem cells,ADSCs)可以顯著提高卵巢癌的生長速度和侵襲能力,提示卵巢癌的進一步發展[36]。Chu等[37]發現ADSC明顯上調卵巢癌細胞PAX8基因表達,參與激活河馬(Hippo)信號通路,該通路核心包含一個激酶級聯,哺乳動物ste20樣激酶1/2(Mammalian Ste20-like kinases 1/2,MST1/2)和大型腫瘤抑制因子1/2(Large tumour suppressor 1/2,LATS1/2),以及下游效應器,即轉錄共激活因子YES相關蛋白(transcriptional co-activator Yes-associated protein,YAP)和具有PDZ結合基序的轉錄共激活劑(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ)。TAZ參與調節多種腫瘤細胞的生長、凋亡、遷移和侵襲以及上皮間質的轉化和干細胞化。PAX8基因上調促進TAZ在卵巢癌中的轉錄,間接影響腫瘤進展,并參與調節腫瘤微環境和原發腫瘤之間的相互作用[38]。

4.5 卵巢癌非編碼體細胞突變集中在PAX8通路 在卵巢癌細胞突變中,約96%位于非蛋白質編碼DNA區域,并提出部分非編碼體細胞突變可能通過修改調節元件的功能驅動癌癥發展,PAX8基因表達的轉錄因子結合發生在非啟動子區域,包括增強子和超增強子區域[39]。Corona等[40]發現轉錄因子PAX8與超增強子在所有上皮性卵巢癌組織型中均被檢測到,并且在HGSOC和子宮內膜樣中最為活躍。這表明PAX8基因可能為HGSOC中非編碼體細胞突變所致轉錄失調的主要參與者。

4.6 SOX17與PAX8協同控制腫瘤轉錄網絡 Reddy等[41]開發了癌癥核心轉錄因子特異性(CaCTS)算法,用來識別腫瘤驅動主轉錄因子(MTF),即一組與超級增強子(super enhancers,SE)相關的轉錄因子,其預測的結合基序在SE上富集,表現出腫瘤類型特異性表達。通過這種方法,發現PAX8基因、SOX17基因和MECOM形成了驅動高級別漿液性卵巢癌細胞系中腫瘤細胞存活的核心調節回路。其中,SOX17基因是一個新譜系生存轉錄因子,是SOXF家族的成員,該家族具有β-連環蛋白結合和反式激活結構域,它與上皮性卵巢癌中的PAX8基因有著共同表達模式,SOX17或 PAX8基因的破壞同樣抑制腫瘤細胞的活性并且下調譜系相關轉錄物的譜系。腫瘤細胞通常依賴于一組相互關聯的MTF來維持其惡性表型[42]。為了進一步探討SOX17的致癌潛能,Lin等[43]從癌癥基因組圖譜(TCGA)中初步證實了其在HGSOC中的優先基因表達。在泛癌分析的基礎上,HGSOC表現出SOX17mRNA的最高水平; 作為比較,PAX8基因表達在HGSOC中相對受限。

同樣,SOX17基因和PAX8基因在苗勒氏管起源的子宮內膜癌組織也高表達,細胞模型顯示SOX17與PAX8基因共定位于細胞核中,并且分別在SOX17或PAX8基因表達免疫沉淀物中檢測到內源性PAX8或SOX17基因。臨床樣本的生化分析證明SOX17與PAX8基因都顯示出苗勒管譜系特異性共表達,并共同調控廣泛的下游基因,包括參與細胞周期和組織形態發生的基因。SOX17和PAX8基因表達對新開發的 CDK12/13共價抑制劑非常敏感,這些抑制劑有效地抑制體外腫瘤活性和體內異種移植物生長。因此,SOX17和 PAX8基因協同控制致瘤轉錄網絡并呈現可靶向苗勒氏管譜系特異性轉錄裝置。同樣,Moreira等[44]也通過多項細胞試驗發現在蛋白質水平上,敲除PAX8基因可導致 SOX17基因表達幾乎完全消失,SOX17基因的敲低同樣導致 PAX8基因表達水平大幅下降,同時PAX8-SOX17基因復合體與SERPINE1(也稱為絲氨酸蛋白酶抑制劑1)表達關系密切,其中SERPINE1為Serpin家族E成員,是血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路的有效抑制因子。據報道,其抗血管生成作用主要通過與玻連蛋白結合并阻斷整合素αvβ3和uPAR結合位點介導,可阻斷細胞粘附、遷移并抑制血管生成[45]。Moreira等[44]通過轉錄組學和蛋白質組學分析認為,在卵巢細胞中,激活 PAX8-SOX17基因信號傳導時,SERPINE1作為腫瘤血管生成的重要抑制劑,處于明顯下調狀態。該研究者提出假設,在腫瘤發生過程中,通過PAX8-SOX17基因復合體激活抑制SERPINE1表達,在體內觸發VEGF通路激活并促進腫瘤血管生成,所以在未來的研究中,抑制 PAX8-SOX17基因通路可能具有潛在價值,作為治療卵巢癌的抗血管生成的新方向。

5 PAX8基因相關靶向藥物試驗

HGSOC仍然是影響全球女性的最致命的惡性腫瘤之一,因為大多數病例是在發生腹膜轉移等不良結局后才得以診斷,導致預后不良,且目前在臨床治療中仍然缺乏該類疾病特異性的靶向藥物。由于HGSOC細胞類型和組織類型的特異性、在健康成人細胞中的低表達以及HGSOC的發病及發展過程中對PAX8基因表達和活性的依賴性,其被認為是HGSOC中非常有前途的診斷和治療靶點。多項研究都指出 PAX8蛋白是OC致病相關信號通路中的重要調節因子,它與正常細胞和腫瘤細胞中不同介質結合的證據表明,PAX8蛋白復合物可以特異性地靶向腫瘤細胞,使正常細胞和組織完全不受影響。硫鏈絲菌肽(Thiostrepton)是一種硫肽抗生素,可特異性結合70S原核核糖體抑制基因翻譯[46]。Hardy等[28]發現PAX8基因可上調上皮性卵巢癌中的叉頭盒基因FOXM1水平,其中FOXM1是一種致癌基因,在超過80%的HGSOC腫瘤樣本中呈激活狀態,它是漿液性腫瘤進展的關鍵驅動因素[47]。而硫鏈絲菌素可靶向影響配對盒基因PAX8基因和叉頭盒基因FOXM1的表達,已有報道硫鏈絲菌素通過下調FOXM1基因表達抑制乳腺癌細胞遷移、轉移和轉化[48]。Hardy等[28]利用硫鏈絲菌素靶向PAX8基因和FOXM1基因降低其蛋白水平的原理,將膠束封裝硫鏈絲菌肽試驗性治療有效減少了腫瘤負荷,這一發現突出了在HGSOC中利用藥物特異性靶向PAX8基因的治療潛力。Lin等[43]發現SOX17與PAX8基因在培養的細胞系和臨床腫瘤標本中發生物理相互作用,這兩種核蛋白結合到重疊的基因組區域,并調控一組共同的下游基因,包括那些參與細胞周期和組織形態發生的基因,此外,轉錄周期蛋白依賴性激酶(CDKs)的小分子抑制劑可以有效降低SOX17和PAX8基因的表達。

ZSQ1722是一種新型的口服CDK12/13共價拮抗劑,在異種移植模型中表現出較強的抗腫瘤活性。此外,靶向PAX因子的另一種策略是抑制其結合活性。Grimley 等[49]在227種潛在的PAX2基因抑制劑中發現了一種稱為EG1的小分子,可有效阻斷PAX2-5-8 DNA結合活性并降低癌細胞的活力。同一研究小組使用無偏倚的、基于細胞的高通量篩選分離抑制PAX2-5-8基因復合體反式激活能力的化合物。這些抑制劑不會干擾 PAX2-5-8 DNA結合活性,但對PAX2-5-8基因復合體轉錄激活以及癌細胞增殖具有抑制作用[50]。鑒于EG1和抑制劑通過兩種不同的機制發揮其作用,或許兩種分子的結合可能會在未來增加治療益處。

基于PAX8基因在HGSOC中的核心作用,Shi等[33]等發現HGSOC中的PAX8 基因調節子對組蛋白脫乙酰酶(HDAC)拮抗劑敏感,HDAC拮抗劑作為單一藥物有效抑制卵巢腫瘤的生長和擴散,并與標準化療聯合發揮協同作用,這一發現或許能為PAX8基因相關性的卵巢癌提供治療方面的思路。Liu[51]研究發現姜黃醇可能通過降低卵巢癌細胞中PAX8的表達抑制了卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移,該項動物實驗中,姜黃醇抑制裸鼠移植卵巢癌的生長,與尼拉帕尼有協同作用,加了尼拉帕尼對卵巢癌的化療敏感性。這些研究均揭示了卵巢癌中可操作的譜系存活轉錄復合物,可通過產生一系列化合物在藥理學上靶向這種難以治療的惡性腫瘤,從而為以后新型抗卵巢癌的藥物的發現提供了一定基礎。

6 PAX8基因對卵巢癌復發和生存期的影響

研究者認為漿液性卵巢癌患者的無進展生存期和總生存期與PAX8基因表達有關[52];子宮內膜癌和卵巢癌組織中PAX8基因的上調伴隨著更高的死亡風險和疾病復發[53]。研究指出不同FIGO分期、不同病理分級的卵巢癌患者中PAX2基因、PAX8基因表達存在明顯差異,且其陽性率隨著FIGO分期、不同病理分級的增加而改變,提示PAX2基因、PAX8基因表達與疾病進展存在一定關聯,可有效評估患者病情進展情況[54]。由此可以推測出PAX8基因與EOC的發生、疾病進展、復發及預后關系密切,故未來有理由相信PAX8基因作為EOC疾病預測因子為卵巢癌患者的臨床管理帶來益處。

7 展望

上皮性卵巢癌中,PAX8基因通過促進癌細胞的增殖、遷移和存活能力而提供生長優勢,更是卵巢高級別漿液性腫瘤進展的關鍵驅動因素,在一定程度上PAX8基因的表達能夠預測卵巢癌的進展和預后,以便指導臨床對該疾病患者的管理。同時,PAX8基因在控制卵巢癌細胞狀態和遷移方面的核心作用,也表明卵巢癌PAX8基因及其表達的蛋白可能成為一種高效的抗癌療法,具有廣闊的應用前景,靶向這些蛋白質有望減慢患者的腫瘤生長和進展,并顯著提高生存率。PAX8基因具有組織特異性,因此與通過普遍表達干擾靶標的方法相比,這種治療策略還可能具有更低的毒性水平,這或將成為未來EOC開發靶向療法或精準醫學的重要新機會。